徐慧鮮 劉振鋒

胃癌是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的癌癥之一[1]。據(jù)2020年全球癌癥統(tǒng)計(jì),胃癌發(fā)病率占新發(fā)癌癥病例的5.6%,排第五位;胃癌死亡率占癌癥總死亡病例的7.7%,排第四位[2]。中國(guó)是胃癌大國(guó),胃癌已成為威脅國(guó)民生命健康的一大疾病,也是國(guó)家癌癥防治的重點(diǎn)[3,4]。因此,有必要研究胃癌惡性進(jìn)展的潛在機(jī)制,為胃癌治療提供靶點(diǎn)。谷氨酰胺酶1(glutaminase1,GLS1)是一種代謝酶,通常在高度增殖的癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá),通過(guò)分解谷氨酰胺,滿足癌細(xì)胞快速增殖對(duì)能量的需求[5,6]。目前,GLS1已被證實(shí)是致癌過(guò)程中的一種重要靶點(diǎn),且有證據(jù)表明,GLS1的抑制劑可能是癌癥治療的有效策略[7-9]。GLS1在胃癌中被報(bào)道與胃癌患者較差的預(yù)后有關(guān)[10]。但筆者發(fā)現(xiàn)GLS1表達(dá)調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲及上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的作用尚不清楚。因此,本研究通過(guò)干擾胃癌細(xì)胞中GLS1的表達(dá),研究GLS1表達(dá)缺失對(duì)胃癌細(xì)胞惡性行為和體內(nèi)生長(zhǎng)的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1和胃癌細(xì)胞N87、MKN28、BGC826和BGC803由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)提供。在含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素混合液的DMEM培養(yǎng)液中,置于含5%CO2的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)換 設(shè)計(jì)合成2條靶向GES-1的siRNA片段(記為si-GLS1-1#和si-GLS1-2#),分別轉(zhuǎn)染N87和BGC823細(xì)胞,并以無(wú)意義siRNA為對(duì)照(si-con)。轉(zhuǎn)染48 h后,實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)和western blot檢測(cè)細(xì)胞中GLS1 mRNA和蛋白表達(dá)水平。

1.3 qRT-PCR實(shí)驗(yàn) Trizol法用于提取細(xì)胞總RNA。采用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA樣本逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。然后,采用SYBR Green法進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。引物序列如下:GLS1正向5’- AAGAGAATGGGCTGGTGCTC-3’,反向5’-ACCGCGTAAGCAGATTTGGA-3’,內(nèi)參β-actin正向5’-CTTCGCGGGCGACGAT-3’,反向5’- CCACATAGGAATCCTTCTGACC-3’。 GLS1 mRNA相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔct法計(jì)算。

1.4 Western blot實(shí)驗(yàn) 取適量RIPA裂解液進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE),然后將電泳分離的蛋白樣品轉(zhuǎn)移至PVDF膜。PVDF膜在5%脫脂奶粉中封閉2 h后,分別與GLS1、N-cadherin、E-cadherin、Vimentin或β-actin一抗稀釋液,4℃孵育過(guò)夜;然后與相應(yīng)的二抗室溫孵育2 h。使用ECL化學(xué)發(fā)光液檢測(cè)目的條帶,拍照,ImageJ軟件分析目的條帶的灰度值。

1.5 CCK8和克隆形成檢測(cè)細(xì)胞增殖 CCK8試劑盒用于CCK8細(xì)胞增殖活性的檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,消化、離心、計(jì)數(shù)、重懸,將細(xì)胞懸液以1×104個(gè)/孔播種至96孔板,37℃培養(yǎng)箱中孵育24 h后,每孔加入10 μl CCK8溶液,繼續(xù)孵育4 h。在酶標(biāo)儀下讀取每孔490 nm處的吸光度值(OD值),并且計(jì)算細(xì)胞的增殖活性。此外,通過(guò)克隆形成實(shí)驗(yàn)評(píng)估細(xì)胞的增殖能力。將細(xì)胞以約2×102個(gè)/孔播種至6孔板,37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約2周后,采用10%甲醛溶液固定細(xì)胞,采用0.1%結(jié)晶紫染色,肉眼或在顯微鏡下計(jì)數(shù)克隆形成數(shù)目。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 Annexin V-FITC/PI雙染法試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡。收集取數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞,加入1×Binding Buffer重懸細(xì)胞。然后分別加入5 μl的Annexin V-FITC,室溫下,避光染色15 min,再加入5 μl的PI染色5 min。流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.7 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲 將Transwell小室放入24孔培養(yǎng)板,Transwell小室作為上室,24孔板作為下室。用無(wú)血清的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,制備細(xì)胞懸液,取適量細(xì)胞懸液加入上室腔中,然后在下室腔中加入適量含10%胎牛血清的培養(yǎng)液。培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,取出上室,倒掉上室中的液體,放入甲醇溶液中固定30 min后,放入Giemsa染液中染色15 min,流水清洗后,用濕棉棒輕輕擦去上室底部膜表面未遷移的細(xì)胞,顯微鏡下觀察隨機(jī)5個(gè)視野區(qū)的細(xì)胞,并計(jì)數(shù),取平均數(shù)記為細(xì)胞遷移數(shù)目。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中預(yù)先在Transwell小室的底部鋪一層Matrigel基質(zhì)膠,其他步驟同細(xì)胞遷移。

1.8 異種移植瘤實(shí)驗(yàn) 將BALB/C裸鼠在本實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為sh-NC組、sh-GLS1-1#組和sh-GLS1-2#組,每組5只。根據(jù)分組,分別將轉(zhuǎn)染對(duì)應(yīng)shRNA的N87細(xì)胞經(jīng)皮下接種裸鼠。分別于接種第7、14、21、28天檢測(cè)小鼠體內(nèi)移植瘤生長(zhǎng)體積,接種28 d后,使小鼠安樂(lè)死,剝離移植瘤稱重,并通過(guò)Western blot檢測(cè)移植瘤中N-cadherin、E-cadherin和Vimentin的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 GLS1在胃黏膜上皮細(xì)胞和胃癌細(xì)胞中的表達(dá) qRT-PCR檢測(cè)GLS1 mRNA在胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1和胃癌細(xì)胞N87、MKN28、BGC826和BGC803的表達(dá),結(jié)果顯示,與GES-1細(xì)胞比較,N87、MKN28、BGC826和BGC803細(xì)胞中GLS1 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)。Western blot檢測(cè)GLS1蛋白表達(dá),結(jié)果顯示,與GES-1細(xì)胞比較,N87、MKN28、BGC826和BGC803細(xì)胞中GLS1蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)圖1,表1。

表1 GLS1在胃黏膜上皮細(xì)胞和胃癌細(xì)胞的表達(dá)

圖1 GLS1的蛋白表達(dá)

2.2 干擾GLS1表達(dá)對(duì)人胃癌N87和BGC823增殖的影響 qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示,與si-con組比較,si-GLS1-1#組和si-GLS1-2#組N87和BGC823細(xì)胞中GLS1 mRNA和蛋白表達(dá)均明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CCK8實(shí)驗(yàn)顯示,與si-con組比較,si-GLS1-1#組和si-GLS1-2#組N87和BGC823細(xì)胞的增殖活性均明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與si-con組比較,si-GLS1-1#組和si-GLS1-2#組N87和BGC823細(xì)胞的克隆形成數(shù)目均明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2,表2。

圖2 干擾GLS1 表達(dá)對(duì)人胃癌N87和BGC823GLS1的表達(dá)和克隆形成的影響;A Western blot檢測(cè)人胃癌N87和BGC823中GLS1的表達(dá);B 克隆形成檢測(cè)人胃癌N87和BGC823的增殖

表2 沉默GLS1 表達(dá)對(duì)人胃癌N87和BGC823增殖的影響

2.3 干擾GLS1 表達(dá)對(duì)人胃癌N87和BGC823細(xì)胞凋亡的影響 與si-con組比較,si-GLS1-1#組和si-GLS1-2#組N87和BGC823細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率均明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)圖3,表3。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)人胃癌N87和BGC823細(xì)胞凋亡

表3 干擾GLS1 表達(dá)對(duì)人胃癌N87和BGC823細(xì)胞凋亡的影響 n=9,

2.4 干擾GLS1 表達(dá)對(duì)人胃癌N87和BGC823遷移和侵襲的影響 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲,結(jié)果顯示,與si-con組比較,si-GLS1-1#組和si-GLS1-2#組N87和BGC823細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)目和侵襲細(xì)胞數(shù)目均減少(P<0.05)。Western blot檢測(cè)EMT相關(guān)蛋白表達(dá),結(jié)果顯示,與si-con組比較,si-GLS1-1#組和si-GLS1-2#組N87和BGC823細(xì)胞中N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)降低(P<0.05),而E-cadherin蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。見(jiàn)圖4,表4。

圖4 干擾GLS1 表達(dá)對(duì)人胃癌N87和BGC823遷移和侵襲以及N-cadherin、E-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)的影響;A transwell檢測(cè)人胃癌N87和BGC823遷移和侵襲;B Western blot檢測(cè)N-cadherin、E-cadherin和Vimentin的表達(dá)

表4 干擾GLS1 表達(dá)對(duì)人胃癌N87和BGC823遷移、侵襲的影響

2.5 干擾GLS1 表達(dá)對(duì)人胃癌N87和BGC823體積和重量的影響 異種移植瘤實(shí)驗(yàn)觀察干擾GLS1對(duì)胃癌細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng)的影響,結(jié)果顯示,與si-con組比較,si-GLS1-1#組和si-GLS1-2#組小鼠體內(nèi)移植瘤的體積明顯減小(P<0.05),腫瘤重量明顯減輕(P<0.05)。見(jiàn)圖5,表5、6。

圖5 干擾GLS1 表達(dá)對(duì)人胃癌N87和B GC823細(xì)胞小鼠移植瘤的影響

表5 干擾GLS1 表達(dá)對(duì)人胃癌N87 細(xì)胞小鼠移植瘤體積和重量的影響 n=9,

表6 干擾GLS1 表達(dá)對(duì)人胃癌BGC823細(xì)胞小鼠移植瘤體積和重量的影響 n=9,

2.6 干擾GLS1 表達(dá)對(duì)人胃癌N87和BGC823移植瘤EMT表達(dá)的影響 Western blot檢測(cè)移植瘤中EMT相關(guān)蛋白表達(dá),結(jié)果顯示,與si-con組比較,si-GLS1-1#和si-GLS1-2#組移植瘤中N-cadherin和Vimentin表達(dá)明顯降低(P<0.05),而E-cadherin表達(dá)明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)圖6,表7。

圖6 干擾GLS1 表達(dá)對(duì)人胃癌N87和BGC823細(xì)胞小鼠移植瘤EMT表達(dá)的影響

表7 干擾GLS1表達(dá)對(duì)人胃癌N87和BGC823細(xì)胞小鼠移植瘤N-cadherin、E-cadherin和Vimentin的影響 n=9,

3 討論

谷氨酰胺代謝為癌癥細(xì)胞增殖提供能量,是癌癥的標(biāo)志之一[11]。GLS1是催化谷氨酰胺代謝的關(guān)鍵代謝酶,在多種人類腫瘤中檢測(cè)到GLS1的高表達(dá),且GLS1異常表達(dá)與癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為有關(guān)[12,13]。賴明華等[14]報(bào)道,GLS1在乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá),抑制GLS1的表達(dá)可降低細(xì)胞增殖活性,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。盧昭輝等[15]研究表明,人胃腸道神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中GLS1高表達(dá)與細(xì)胞較強(qiáng)的增殖和侵襲能力有關(guān)。Liu等[16]發(fā)現(xiàn),敲低GLS1可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、集落形成和遷移能力,提示靶向GLS1可能是結(jié)直腸癌治療的一個(gè)新的潛在靶點(diǎn)。目前,在胃癌中,GLS1被發(fā)現(xiàn)與胃癌臨床預(yù)后有關(guān),GLS1表達(dá)越高,胃癌患者的3年總生存率越低[10];此外,李家秋等[17]研究表明,靶向抑制GLS1可以抑制胃癌細(xì)胞的增殖能力。

本研究體外培養(yǎng)胃癌細(xì)胞,qRT-PCR檢測(cè)證實(shí)GLS1在胃癌細(xì)胞中呈高表達(dá)。腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲是腫瘤發(fā)展過(guò)程中最具危險(xiǎn)性的過(guò)程,當(dāng)腫瘤細(xì)胞在遠(yuǎn)處器官形成克隆時(shí),往往會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生嚴(yán)重破壞[18,19]。本研究細(xì)胞功能研究證實(shí),干擾GLS1不僅能夠抑制胃癌細(xì)胞的增殖活性和克隆形成能力,還可抑制細(xì)胞的遷移和侵襲能力,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。異種移植瘤實(shí)驗(yàn)證實(shí)干擾GLS1阻礙了胃癌細(xì)胞的體內(nèi)生長(zhǎng)。結(jié)果表明GLS1可能成為胃癌治療的有效的治療靶點(diǎn)。此外,有研究發(fā)現(xiàn)GLS1在癌細(xì)胞中的調(diào)控機(jī)制,如靶向GLS1可通過(guò)增加活性氧類和抑制Wnt/β-catenin途徑減弱肝細(xì)胞癌的干性特征[20];GLS1的下調(diào)降低一些與癌細(xì)胞存活有關(guān)的關(guān)鍵癌基因(如c-Myc、cdk4、NF-kB等)的表達(dá),抑制多發(fā)性骨髓瘤進(jìn)展,延長(zhǎng)患者生存期[21]。但GLS1在胃癌細(xì)胞進(jìn)展中的調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

EMT是一種將黏附上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為侵襲性間充質(zhì)細(xì)胞的生物過(guò)程,其主要表現(xiàn)為細(xì)胞黏附蛋白標(biāo)記物E-cadherin表達(dá)降低,而間充質(zhì)蛋白標(biāo)記物N-cadherin和Vimentin水平升高[22,23]。數(shù)據(jù)顯示,EMT是腫瘤形成和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵,也是一個(gè)可逆的生物過(guò)程[24]。本研究中,我們發(fā)現(xiàn)干擾GLS1表達(dá)能夠使胃癌細(xì)胞中N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)水平降低,而E-cadherin蛋白表達(dá)明顯升高,表明干擾GLS1減弱了胃癌細(xì)胞的EMT過(guò)程。此外,在GLS1敲低表達(dá)的移植瘤中也檢測(cè)到了N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)降低,而E-cadherin蛋白表達(dá)升高。提示干擾GLS1可能通過(guò)抑制胃癌細(xì)胞的EMT過(guò)程,抑制癌細(xì)胞的遷移和侵襲。

綜上所述,GLS1在胃癌細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá),干擾GLS1能夠抑制癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和EMT過(guò)程,促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡,并能減緩胃癌細(xì)胞的體內(nèi)生長(zhǎng)。本研究結(jié)果為GLS1作為胃癌治療的潛在靶點(diǎn)提供了實(shí)驗(yàn)參考。