●李振斌 （黔西南民族職業(yè)技術學院 貴州 興義 562400）

三葉青學名三葉崖爬藤（Tetrastigma hemsleyanumDielsetGilg），為葡萄科崖爬藤屬植物，為民族民間常用中草藥，主要分布于貴州、浙江、廣西、福建等地，全草具有清熱解毒、活血祛風等功效，可用于治療流行性感冒、肝炎、泌尿系統(tǒng)結石等[1-3]，素有“植物抗生素”等美譽。隨著其藥用價值的不斷開發(fā)，金奇片、金絲地甲膠囊等中成藥問世，進一步促進三葉青產(chǎn)業(yè)發(fā)展。目前，以浙江、福建、湖南、廣西產(chǎn)三葉青研究居多，對貴州產(chǎn)三葉青研究甚少，特別是黔喀斯特地區(qū)，因地形地貌獨特，植物特征鮮明，缺乏該地區(qū)三葉青的基礎研究，且尚存在產(chǎn)地把狹葉三葉青及其同屬植物混作三葉青栽培，缺少質(zhì)量評價研究，影響本品的合理使用。鑒于此，本試驗開展三葉青生藥學研究，以期為三葉青的準確應用和深入開發(fā)提供科學依據(jù)，為質(zhì)量標準的制定提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

樣品自采，共9批，其中3批栽培，6批野生，詳見表1。經(jīng)貴州黔西南喀斯特區(qū)域發(fā)展研究院鄧朝義研究員鑒定為三葉崖爬藤的全株。

表1 樣品來源

槲皮素（對照品）購于中國食品藥品檢定研究院國家藥品標準物質(zhì)網(wǎng)，批號：100081-201610。

1.2 儀器

EX30生物顯微鏡（寧波舜宇儀器公司）；FA224分析天平（ 萬分之一，上海舜宇恒平科學儀器）；KS-5200DB超聲波清洗機（昆山潔力美超聲儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 鑒別 對不同產(chǎn)地三葉青進行地理標記，以物候期為指向，定點觀察其植物特征，記錄植株特點；對收集的藥材進行干燥，觀察描述藥材不同部位性狀特點，并對其進行粉碎，通過制片顯微鏡觀察藥材的粉末顯微特征。

1.3.2 薄層色譜 取干燥的三葉青全草粉末10 g，稀乙醇250 mL回流提取2 h，冷卻過濾并蒸干，用適量水混懸，乙酸乙酯萃取3次，每次 100 mL，合并乙酸乙酯層，濃縮至約5 mL，得供試品溶液。取槲皮素對照品適量，加無水甲醇溶解，制得1 mg/mL對照品溶液。照中國藥典薄層色譜法（通則0502）試驗[4]，分別吸取上述溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上。以石油醚∶乙酸乙酯∶甲酸（9∶4∶1）為展開劑，展開，取出晾干后噴以1%AlCl3乙醇溶液，于紫外燈（365 nm）下檢視。

1.3.3 水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物測定 水分按照《中國藥典》2020年版四部通則0832水分測定法（第二法 烘干法）[5]測定；總灰分、酸不溶性灰分按照《中國藥典》2020年版四部通則2302灰分測定法測定。

浸出物測定按《中國藥典》2020年版四部通則2201浸出物測定法，分別用60%乙醇、水作溶劑，以冷浸法、熱浸法篩選確定理想的溶劑和提取方法。

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

涉及數(shù)據(jù)用SPSS 24.0與Excel2010軟件統(tǒng)計數(shù)據(jù)，并進行組別的差異性分析。P＜0.05表示差異顯著，每組試驗重復3次。

2 結果與分析

2.1 原植物鑒別

草質(zhì)藤本。常分枝，匍匐或攀沿，具5縱棱，無毛或被疏柔毛。卷須不分枝，與葉對生。復葉有3小葉，小葉披針形、長橢圓披針形，長5～9 cm，寬1.7～3.5 cm，頂端漸尖，基部略楔形，側生小葉基部不對稱，邊緣每側有4～8個鋸齒，上表面綠色，下表面略淺，無毛；側脈5～6對，網(wǎng)脈不明顯；葉柄長4～7 cm，中央小葉柄長0.5～1.8 cm，側生小葉柄長0.2～0.4 cm，無毛或被疏柔毛?；ㄐ蛞干?，下部有節(jié)，節(jié)上有苞片，二級分枝集生成傘形，花二歧狀著生在分枝末端；花序梗被短柔毛，長1～2.5 mm；花蕾卵圓形，萼碟形，萼齒細小，卵狀三角形；花瓣4，卵圓形，無毛；雄蕊4，花藥黃色；子房陷在花盤中，柱頭4裂。果實近球形或倒卵球形（青色，橙紅色，后為烏黑色），直徑0.4～0.6 cm，有種子1顆?；ㄆ?～7月，果期8～11月。對比發(fā)現(xiàn)，栽培品與野生品原植物特征無明顯區(qū)別。

2.2 性狀鑒別

2.2.1 野生品 塊根類圓球形、紡錘形或不規(guī)則塊狀，長1～7 cm，直徑 0.5～4 cm；表面棕褐色或灰褐色，稍皺縮，具類網(wǎng)狀紋理，偶見皮孔狀凸起，殘留棕褐色細根或根莖；質(zhì)地硬而脆，斷面略平坦，粉性，類白色或淺棕紅色。莖五棱形，表面暗棕褐色或黃綠色；可見節(jié)，稍膨大；質(zhì)脆，斷面纖維性。葉皺縮，多破碎，完整葉片展平后為三出掌狀復葉；上表面黃綠色或暗綠色，下表面色稍淺，無毛。氣微，味微甜。

2.2.2 栽培品 塊根橢圓形、紡錘形、長條形，長2～8 cm，直徑0.6～3.5 cm，偶見類網(wǎng)狀紋理，質(zhì)地稍硬，斷面略平坦，富粉性。莖特點與野生品無顯著區(qū)別。葉片顏色較野生品偏黃，為黃綠色或黃褐色，完整葉片亦較野生品多。

2.3 顯微鑒別

粉末灰棕色或灰褐色。淀粉粒橢圓形、類圓形或紡錘形等，多單粒，直徑9～45 μm。網(wǎng)紋細胞較多，壁稍厚，黃棕色或黃色，直徑121～189 μm。草酸鈣針晶散在或成束存在于紡錘形黏液細胞內(nèi)，長36～129 μm。草酸鈣簇晶散在或排列成行，直徑10～74 μm。可見角質(zhì)層組織。螺紋導管多見，孔紋導管直徑42～98 μm，纖維長梭形，壁厚，胞腔狹小。葉片下表皮細胞多角形，氣孔為平軸式或不定式。栽培品與野生品粉末特征無明顯區(qū)別。見圖1。

圖1 三葉青全草粉末顯微特征圖（10×40）

2.4 薄層色譜鑒別 從圖譜可見，1～9號樣品與對照品在相同位置均有斑點顯示，但呈不同顏色斑點，說明各樣品中可均含槲皮素，但還夾雜其他成分，該方法需要再次優(yōu)化升級，方可達到有相同和清晰斑點呈現(xiàn)。見圖2。

圖2 三葉青藥材薄層色譜圖

2.5 水分、總灰分及酸不溶性灰分測定結果

2.5.1 水分 9批三葉青藥材中水分含量范圍為8.86%～11.15%。由表2可知，野生品因產(chǎn)地不同，水分含量變化較為明顯，以貴陽產(chǎn)藥材水分含量較高，安順產(chǎn)藥材含量較低，但各地栽培品藥材水分含量變化差異不明顯。

表2 三葉青藥材水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物含量測定結果 單位：%

2.5.2 總灰分、酸不溶性灰分 9批三葉青藥材中總灰分含量范圍為6.91%～9.76%，野生品以六盤水和貴陽產(chǎn)藥材較高，栽培品各產(chǎn)地藥材無顯著差異。酸不溶性灰分含量范圍為0.75%～1.49%，野生品同一地區(qū)不同批次間存在顯著差異，不同地區(qū)間亦存在顯著差異；栽培品各產(chǎn)地藥材變化較小，相對穩(wěn)定。

2.6 浸出物測定

2.6.1 提取方法考察 通過對不同溶劑和不同提取方法進行試驗發(fā)現(xiàn)，溶劑以60%乙醇提取效率較高，用冷浸法提取為宜（表3）。

表3 三葉青藥材不同提取方法浸出物測定結果（n = 3）

2.6.2 樣品浸出物含量 9批三葉青藥材（全草）浸出物含量范圍為12.17%～13.58%。各產(chǎn)地的樣品浸出物含量差異不顯著，同一產(chǎn)地不同批次間差異亦不顯著，其中以栽培品浸出物含量相對較高（表4）。

表4 9批三葉青藥材浸出物測定結果（n = 3）

3 討論

本研究對黔喀斯特地區(qū)三葉青經(jīng)過長期觀察對比發(fā)現(xiàn)，其特征與《中國植物志》[6]和劉培剛等[7]等對三葉青原植物描述，形態(tài)特征基本一致，但葉片較之略寬長，花期稍有后移，且莖有較明顯五縱棱紋。藥材塊根部稍大，表面網(wǎng)狀紋較清晰；莖可見五縱棱，暗棕褐色或黃綠色，節(jié)稍大，斷面纖維性，葉皺縮，多破碎，黃綠色或暗綠色，下表面色稍淺，《湖南省中藥材標準（2009年版）》《浙江省中藥材質(zhì)量標準（2017年版）》（下稱“湖標”“浙標”）中未見描述。栽培品較野生品偏長橢圓狀，稍光滑，莖無顯著區(qū)別，葉片顏色偏黃。在粉末特征方面，本研究對象為全草（含塊根），淀粉粒、草酸鈣針晶和簇晶與“浙標”和崔偉亮等[8]描述一致，但未對網(wǎng)紋細胞進行描述。此外，全草粉末中可見角質(zhì)層組織，螺紋導管、孔紋導管，纖維束、平軸式或不定式氣孔等。

參照李鶴[4]、崔偉亮等[8]薄層鑒別法，以稀乙醇為溶劑制備供試品和槲皮素作對照展開發(fā)現(xiàn)，三葉青全草在相同的位置出現(xiàn)相同斑點，但斑點顏色與對照不一致，經(jīng)過增加萃取次數(shù)、活性炭吸附處理欲排除色素干擾，但斑點顏色并未呈現(xiàn)相同顏色，說明對于三葉青全草需要進一步探索合適的提取方法和展開系統(tǒng)，但樣品與對照品在相同的位置有斑點出現(xiàn)，側面印證了前者研究結果。

4 結論

喀斯特地區(qū)三葉青栽培品與野生品植物外觀形態(tài)上區(qū)別較小，藥材形態(tài)差異為塊根偏長橢圓狀，稍光滑，莖五棱狀特征清晰，葉片顏色偏黃，破壞率相對較低；全草粉末中均可見角質(zhì)層組織，螺紋導管、孔紋導管，纖維束、平軸式或不定式氣孔等；水分、總灰分、酸不溶性灰分含量，因產(chǎn)地和環(huán)境差異而表現(xiàn)出不同程度的差異，但從數(shù)據(jù)分析，較野生品穩(wěn)定，變化幅度??；栽培品浸出物含量較野生品高。綜合分析，喀斯特地區(qū)三葉青馴化栽培品生物特性相對突出，標示性較強，水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物含量等生理指標較具優(yōu)勢，在三葉青資源開發(fā)及產(chǎn)業(yè)化發(fā)展中可作為有效路徑進行探索，栽培替代野生品，亦可對野生三葉青資源進行保護。同時可補充黔產(chǎn)三葉青理論依據(jù)，為其質(zhì)量標準的制定提供參考。