●李 彬 彭樹(shù)德 白和平 高桂生 史秋梅

（1.秦皇島撫寧區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局 河北 秦皇島 066004；2.唐山市食品藥品綜合檢驗(yàn)檢測(cè)中心 河北 唐山 063000；3.唐河縣和杰農(nóng)業(yè)專業(yè)合作社 河南 南陽(yáng) 473000；4.河北科技師范學(xué)院 河北 秦皇島 066004）

溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）屬于弧菌科（Vibrionaseae）、弧菌屬（Vibrio），是一種嗜鹽性、兼性厭氧、革蘭氏陰性短桿菌，是常見(jiàn)的海洋條件致病菌。近年來(lái)，水生生物感染溶藻弧菌后主要癥狀為皮膚潰瘍、爛尾、腹水、爛眼等，該病給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失；人體受傷時(shí)容易引起創(chuàng)傷部位感染，誤食容易引起腹瀉，免疫力降低時(shí)可引起結(jié)膜炎、耳炎、呼吸道感染、血液感染和顱內(nèi)感染等[1]，因此造成的食源性污染嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的生命安全。隨著半滑舌鰨養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，在養(yǎng)殖過(guò)程中各種疾病頻發(fā)，溶藻弧菌為重要的病原之一，給半滑舌鰨養(yǎng)殖造成了巨大的危害。

本試驗(yàn)室于2021年8月對(duì)河北省秦皇島市撫寧區(qū)某水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)送檢的5條瀕死半滑舌鰨進(jìn)行了臨床診斷和細(xì)菌分離鑒定，以及藥物敏感性敏試驗(yàn)，以期為溶藻弧菌病的臨床診斷和防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

河北省秦皇島市撫寧區(qū)某水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)送檢的患皮膚潰瘍病且瀕死的半滑舌鰨5條，體長(zhǎng)10～15 cm。

1.2 試劑及儀器

8%綿羊血瓊脂培養(yǎng)基、TCBS瓊脂培養(yǎng)基，購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；DNA提取試劑盒，購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；抗生素藥敏紙片，購(gòu)自廣州市益滿生物科技有限公司；ID32E生化鑒定試紙條、ATB全自動(dòng)生化鑒定儀，購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃股份有限公司；革蘭氏染色試劑盒，購(gòu)自北京博奧闊達(dá)生物科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)菌的分離純化及形態(tài)學(xué)觀察 在超凈臺(tái)中無(wú)菌取潰瘍病灶深部病變組織于1.5 mL EP離心管中，加5倍體積滅菌PBS充分勻漿，離心后用接種環(huán)蘸取上清液在血瓊脂平板上均勻涂布，30℃培養(yǎng)24 h后挑取優(yōu)勢(shì)菌純化至菌落形態(tài)單一，挑取分離菌劃線于TCBS培養(yǎng)基觀察菌落形態(tài)與生長(zhǎng)特性；另挑取分離菌進(jìn)行革蘭氏染色，觀察分離菌染色特性及菌體形態(tài)。

1.3.2 分離菌的生化鑒定 用比濁儀調(diào)整菌液濃度為0.5麥?zhǔn)媳葷岫?，使用ID32E生化鑒定試紙卡結(jié)合ABI自動(dòng)生化鑒定儀進(jìn)行分離菌的生化鑒定試驗(yàn)，試驗(yàn)操作及結(jié)果判定嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)執(zhí)行。

1.3.3 抗生素藥敏試驗(yàn) 采用K-B試紙法進(jìn)行抗生素藥敏試驗(yàn)，取100 μL過(guò)夜培養(yǎng)的分離菌菌液均勻涂布于TCBS瓊脂培養(yǎng)基，藥敏紙片等間距貼在培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)24 h后測(cè)量抑菌圈直徑，判斷藥物敏感性。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌的生長(zhǎng)特性與形態(tài)特征

分離菌在TCBS瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，光滑圓潤(rùn)，為凸起黃色菌落（圖1-A）；在血平板培養(yǎng)基上為大小中等、光滑乳白色的菌落（圖1-B）；經(jīng)革蘭氏染色，為陰性短桿菌、兩端頓圓，呈散在或成對(duì)存在（圖1-C）。

圖1 分離菌的培養(yǎng)及形態(tài)特征

2.2 分離菌的生化鑒定結(jié)果

經(jīng)24 h培養(yǎng)的生化鑒定試紙條，用ATB自動(dòng)生化鑒定儀讀取生化鑒定結(jié)果，如表1所示，分離菌生化特性與溶藻弧菌生化特性相似率達(dá)96%，符合率較高。

表1 生化鑒定結(jié)果

2.3 抗生素藥敏試驗(yàn)

取培養(yǎng)24 h后的藥敏瓊脂平板測(cè)量各種藥物抑菌直徑，結(jié)果見(jiàn)表2。分離菌對(duì)頭孢曲松、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氟苯尼考高度敏感，對(duì)阿米卡星、新霉素、卡那霉素、替米考星中度敏感，對(duì)氨芐西林、阿莫西林、多西環(huán)素、土霉素、磺胺間甲氧、磺胺鄰二甲氧、復(fù)方新諾明耐藥。

表2 抗生素藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論與結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)分離菌的生長(zhǎng)特性、革蘭氏染色、生化鑒定結(jié)果分析，初步鑒定分離菌為溶藻弧菌。在本研究中分離菌生化特性賴氨酸脫羧酶為陽(yáng)性，與徐曉麗等[2]分離的半滑舌鰨源溶藻弧菌為賴氨酸脫羧酶陰性的結(jié)果不同，但與李卓昱等[3]等分離的溶藻弧菌H1B6賴氨酸脫羧酶陽(yáng)性的結(jié)果相同，造成生化特性的差異可能與菌株、儀器、生化鑒定試紙條等因素有關(guān)。后續(xù)可使用弧菌科專用鑒定試紙條等進(jìn)一步驗(yàn)證分離菌的生化特性。通過(guò)對(duì)分離菌進(jìn)行抗生素藥敏試驗(yàn)結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)分離菌對(duì)頭孢曲松、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氟苯尼考高度敏感。臨床生產(chǎn)過(guò)程中建議選擇敏感藥物對(duì)該病進(jìn)行預(yù)防與治療，但要遵守水產(chǎn)用藥相關(guān)法規(guī)。