高 源，鄭 剛*，齊 靖，張 鳳

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712000；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院 科研科，陜西 咸陽 712046)

炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)在心臟病發(fā)病中扮演重要角色,抑制炎性反應(yīng)可有效治療心臟病[1]。炎性小體是多種蛋白質(zhì)復(fù)合物,在炎性反應(yīng)中處于關(guān)鍵位置,可以募集相關(guān)炎性細(xì)胞誘發(fā)炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)。目前發(fā)現(xiàn)的炎性小體主要有Nod樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白(Nod-like receptor pyrin domain-containing protein,NLRP)NLRP1、NLRP3、NLRC4、NLRP6、AIM2及Pyrin等。對(duì)NLRP3的研究較深入,其可以與ASC及pro-caspase-1形成炎性體,并進(jìn)一步引導(dǎo)IL-1β和IL-18炎性介質(zhì)的成熟和分泌,誘發(fā)炎性反應(yīng)。激活NLRP3炎性小體是誘發(fā)心臟病的主要因素,抑制其激活,可能是未來治療心臟病的潛在干預(yù)靶點(diǎn)[2]。

1 NLRP3炎性小體概述

NLRP3炎性小體由Nod樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NLRP3)、凋亡相關(guān)的斑點(diǎn)蛋白(apoptosis related spot protein,ASC)和半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-1(caspase-1)組成[3]。NLRP3包含3個(gè)結(jié)構(gòu)域:C端富含亮氨酸重復(fù)序列(leucine-rich-repeats,LRRs)、中心核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域(nucleotide-binding and oligomerization domain,NACHT),以及熱蛋白結(jié)構(gòu)域(N-terminal pyrin domain,PYD)。正常生理?xiàng)l件下NACHT與 LRRs 結(jié)合使NLRP3炎性小體處于抑制狀態(tài)。NLRP3炎性小體激活后促進(jìn)pro-caspase-1成熟為具有活性的caspase-1。caspase-1一方面是IL-1β、IL-18轉(zhuǎn)化酶,可將pro-IL-1β、pro-IL-18裂解為具有活性形式IL-1β、IL-18,另一方面通過促進(jìn)膜穿孔蛋白D(gasdermin-D,GSDMD)活化引導(dǎo)細(xì)胞焦亡[4]。

1.1 NLRP3炎性小體的激活

NLRP3激活的起始步驟是模式識(shí)別受體發(fā)出的“啟動(dòng)”信號(hào),通過NF-κB激活從而導(dǎo)致NLRP3、pro-IL-1β和pro-IL-18的過度表達(dá)?！皢?dòng)”之后使NLRP3激活,其分子機(jī)制尚不完全清楚,目前主要有4種觀點(diǎn)[5]。

1.1.1 K+外流與NLRP3 炎性小體的激活:NLRP3炎性小體激活需要細(xì)胞質(zhì)中K+外流,約50%細(xì)胞內(nèi)K+外流可引起ATP激活,并通過嘌呤離子通道型7(purinergic ionotropic,P2X7)受體激活NLRP3炎性小體。尼日利亞霉素是一種K+載體,可導(dǎo)致膜孔形成,從而觸發(fā)K+外流激活NLRP3炎性小體。降低細(xì)胞內(nèi)K+足以在體外誘導(dǎo)NLRP3炎性小體激活。相反,通過K+通道抑制劑格列本脲阻斷K+外流或增加細(xì)胞外K+濃度均可抑制NLRP3炎性小體激活[5]。

1.1.2 Ca2+信號(hào)失調(diào)與 NLRP3 炎性小體激活:NLRP3激活與細(xì)胞內(nèi)Ca2+儲(chǔ)存和釋放有關(guān),多種NLRP3激活劑可調(diào)控Ca2+信號(hào)調(diào)控。降低細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存的Ca2+及抑制細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流,從而抑制NLRP3激活[6]。

1.1.3 線粒體功能失調(diào)和活性氧(reactive oxygen species,ROS)與 NLRP3 炎性小體激活:已知的NLRP3激活劑都會(huì)產(chǎn)生ROS,ROS清除劑可抑制NLRP3炎性小體激活。ROS水平增加是NLRP3激活的必要條件,線粒體是NLRP3激活的主要ROS來源,線粒體DNA和線粒體外膜蛋白電壓依賴性陰離子通道(mitochondrial outer membrane protein voltage dependent anion channel,VDAC)對(duì)于線粒體產(chǎn)生ROS都是必不可少的。VDAC表達(dá)減少的細(xì)胞對(duì)NLRP3激活劑的活化受到抑制[7]。

1.1.4 溶酶體破裂與 NLRP3 炎性小體激活:細(xì)胞吞噬結(jié)晶樣物質(zhì)而不能將其溶解時(shí)會(huì)導(dǎo)致溶酶體損傷和破裂,進(jìn)而促使溶酶體組織蛋白酶B的釋放并激活細(xì)胞質(zhì)中NLRP3炎性小體,提示組織蛋白酶B可能作用于NLRP3炎性小體本身或者切割NLRP3炎性小體某一部分從而觸發(fā)其激活[8]。

2 NLRP3炎性小體與心力衰竭的關(guān)系

NLRP3炎性小體在心力衰竭(heart failure,HF)的發(fā)病和預(yù)后中起著重要作用[9]。有報(bào)道,隨著心肌肥厚、炎性反應(yīng)和心室擴(kuò)張,血清中NLRP3 mRNA水平升高。基因消融NLRP3或給予IL-1β受體拮抗劑可以減輕心臟炎性反應(yīng)并挽救心肌收縮功能障礙。雷公藤內(nèi)酯醇可通過抑制NLRP3炎性小體來減輕HF小鼠的心肌重塑和改善心功能。格列本脲抑制NLRP3炎性小體可改善心肌收縮功能障礙[10]。

HF患者血清中NLRP3、caspase-1和IL-1β水平隨心功能的嚴(yán)重程度而逐級(jí)增高。NLRP3水平與NT-proBNP水平及單核細(xì)胞計(jì)數(shù)直接相關(guān),與左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)呈負(fù)相關(guān)。HF患者的IL-1β和IL-18升高,其活性與HF癥狀和預(yù)后相關(guān)[11]。IL-1β和IL-18抑制心肌細(xì)胞收縮和對(duì)腎上腺素能受體刺激的敏感性。通過降低IL-1β或IL-18活性或阻斷IL-1β的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)更有利于改善HF患者臨床癥狀與預(yù)后。IL-1β抑制劑(IL-1βRa或canakinumab)在早期臨床試驗(yàn)中被證明對(duì)射血分?jǐn)?shù)保留性心力衰竭或射血分?jǐn)?shù)減低型心力衰竭患者有效[12]。一項(xiàng)涉及54例HF患者的臨床試驗(yàn)報(bào)告中顯示,與對(duì)照組相比,運(yùn)動(dòng)組的caspase-1募集域(apoptosis-associated speck-like protein with a caspase recruitment domain,ASC)甲基化增加,血漿IL-1和ASC mRNA水平降低,表明運(yùn)動(dòng)通過ASC的表觀遺傳調(diào)節(jié)促進(jìn)HF更好的結(jié)局[13]。心臟重塑和纖維化是HF發(fā)展的主要機(jī)制,成纖維細(xì)胞在NLRP3炎性小體激活過程中也表現(xiàn)出更早和更顯著的活動(dòng),抑制NLRP3炎性小體活化可以逆轉(zhuǎn)心肌纖維化過程,從而影響HF的發(fā)病過程。

3 NLRP3炎性小體與動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系

炎性反應(yīng)可導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)斑塊不穩(wěn)定和破裂,進(jìn)而引發(fā)急性冠脈綜合征。慢性炎性反應(yīng)可導(dǎo)致AS血栓形成的各個(gè)階段,包括早期斑塊形成、斑塊生長以及心肌梗死、卒中和心血管事件發(fā)生前的急性斑塊破裂[14]。

NLRP3炎性小體通過模式識(shí)別受體相關(guān)信號(hào)通路參與AS的炎性反應(yīng)過程。NLRP3炎性小體在AS中的重要作用,使用低密度脂蛋白受體(LDLR-)缺陷小鼠高脂飲食8周后,NLRP3、ASC、IL-1和IL-18表達(dá)水平降低,AS病變減弱。還發(fā)現(xiàn)IL-18結(jié)合蛋白不僅可以減弱主動(dòng)脈斑塊形成進(jìn)程,還可以減少病變中的淋巴細(xì)胞浸潤和脂質(zhì)含量,從而對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化起到保護(hù)作用[15]。

ROS在氧化應(yīng)激和AS斑塊形成過程中起著重要作用,ROS的過度生成誘導(dǎo)凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體-1(low-density lipoprotein receptor-1,LOX-1)的表達(dá),LOX-1是免疫系統(tǒng)的有效調(diào)節(jié)因子,并在AS的發(fā)展中起重要作用。在培養(yǎng)的人巨噬細(xì)胞THP-1暴露于脂多糖顯著誘導(dǎo)LOX-1和ROS的表達(dá),并引發(fā)線粒體DNA損傷,導(dǎo)致細(xì)胞自噬并激活NLRP3炎性小體。用結(jié)合抗體或siRNA抑制LOX-1可阻止隨后的一系列事件。ROS抑制劑和自噬誘導(dǎo)劑都降低了NLRP3炎性小體的表達(dá)。DNA酶Ⅱ siRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)也證實(shí)LOX-1介導(dǎo)的自噬和線粒體DNA損傷在多種心血管疾病發(fā)病中NLRP3炎性小體激活起著重要作用的假說[16]。

4 NLRP3炎性小體與心肌梗死的關(guān)系

炎性反應(yīng)在心肌梗死后組織損傷和修復(fù)的程度方面也起著重要作用。IL-1β受體拮抗劑anakina抑制IL-1β活性可顯著降低小鼠急性心肌梗死后的心肌肥厚和心肌功能障礙[17]。

NLRP3炎性小體識(shí)別各種危險(xiǎn)信號(hào)并誘導(dǎo)無菌炎性反應(yīng),在缺血性心肌病發(fā)病中可大量激活。有報(bào)道,siRNA或藥理學(xué)抑制劑抑制NLRP3和P2X7受體可防止炎性體激活并減少心肌細(xì)胞死亡,減輕小鼠冠狀動(dòng)脈結(jié)扎后的心臟重塑。NLRP3炎性小體抑制劑MCC950在經(jīng)腔球囊閉塞誘導(dǎo)的心肌梗死豬模型中減少了梗死面積,表明抑制NLRP3炎性小體激活可能對(duì)急性心肌梗死患者具有治療潛力[18]。

在心肌缺血/再灌注損傷的大鼠模型中,NLRP3的表達(dá)上調(diào),caspase-1活性增強(qiáng),IL-1β和IL-18增加,抑制NLRP3激活可減少梗死面積。心肌內(nèi)注射NLRP3 siRNA或腹腔內(nèi)注射炎性體抑制劑BAY-11-7028可減輕小鼠心臟中巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的浸潤,并減少心肌缺血/再灌注損傷[19]。

5 NLRP3炎性小體與心臟重構(gòu)的關(guān)系

心臟重塑導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)和功能一系列變化,心室重構(gòu)的主要原因,例如壓力超負(fù)荷(主動(dòng)脈瓣狹窄和高血壓)、容量超負(fù)荷(瓣膜返流和缺血)和其他疾病(如心肌梗死、心肌炎、擴(kuò)張型心肌病和瓣膜性心臟病)的適應(yīng)性反應(yīng),這些疾病逐漸導(dǎo)致心臟進(jìn)行性失代償。半胱天冬酶激活和募集結(jié)構(gòu)域3(CARD3)是心肌梗死后左心室重構(gòu)和功能障礙的積極調(diào)節(jié)劑,并且CARD3在調(diào)節(jié)一些細(xì)胞系中的半胱天冬酶-1活性中起著關(guān)鍵作用[20]。

盡管可以成功開通冠脈和適當(dāng)?shù)乃幬镏委熞约案淖兩罘绞?但是心臟重構(gòu)仍然很常見,并最終導(dǎo)致心力衰竭和死亡。心肌壞死會(huì)觸發(fā)炎性因子的產(chǎn)生,如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-18、IL-33和C-反應(yīng)蛋白,抑制這些炎性因子的產(chǎn)生可調(diào)節(jié)心肌重塑。誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)調(diào)節(jié)生物活性NO的產(chǎn)生,NO是NLRP3炎性小體激活的關(guān)鍵負(fù)調(diào)節(jié)因子之一。在心衰患者中,iNOS在巨噬細(xì)胞和心肌細(xì)胞中都有高表達(dá)。在iNOS敲除的慢性心衰(chronic heart failure,CHF)小鼠,其存活率、左心室功能、肥大、纖維化和炎性反應(yīng)激活方面表現(xiàn)出顯著改善,表明iNOS負(fù)責(zé)缺血性心衰的全身炎性反應(yīng)和心臟重塑。線粒體參與多種細(xì)胞生命活動(dòng),如能量、信號(hào)、細(xì)胞增殖、分化和凋亡,線粒體損傷釋放的線粒體DNA可激活NLRP3炎性小體。在高脂飲食和低劑量鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的T2D大鼠中,NLRP3基因沉默療法可改善心臟炎性反應(yīng)、纖維化和心功能不全。在一些實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中,NLRP3炎性小體信號(hào)干預(yù)也被證明可以減少心肌梗死面積并抑制心臟重構(gòu)和改善心功能[21]。

6 NLRP3炎性小體與心律失常的關(guān)系

有報(bào)道,在野生型和NLRP3純合子敲除(NLRP3-/-)的小鼠喂養(yǎng)高脂飲食或正常飲食。與正常飲食喂養(yǎng)的野生型小鼠相比,高脂飲食喂養(yǎng)的野生型小鼠更容易發(fā)生心律失常,且炎性反應(yīng)越劇烈心律失常持續(xù)時(shí)間越長。相反,高脂飲食喂養(yǎng)的NLRP3-/-小鼠發(fā)生心律失常的情況較少。NLRP3 炎性小體激活可引起超快速延遲整流K+通道的上調(diào),縮短導(dǎo)致心肌電位不應(yīng)期和動(dòng)作電位持續(xù)時(shí)間,這是促進(jìn)心臟電重構(gòu)的兩個(gè)關(guān)鍵因素。在高脂飼料誘導(dǎo)的野生型小鼠中,促纖維化信號(hào)和纖維化增加以及肌漿網(wǎng)異常Ca2+釋放與心律失常發(fā)生密切相關(guān)。相反,高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠中NLRP3-/-的敲除阻止了K+通道的上調(diào)和電重構(gòu)的演變、促纖維化基因的上調(diào)以及高脂飼料誘導(dǎo)的野生型小鼠中異常的肌漿網(wǎng) Ca2+釋放,這些結(jié)果提示NLRP3炎性小體激活可能是心律失常發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素[22]。

心肌梗死后常伴有室性心律失常,表明炎性反應(yīng)與此密切相關(guān)。鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ抑制物1(CaMK2N1)主要在心肌細(xì)胞中表達(dá),并抑制梗死邊緣區(qū)CaMKⅡδ的磷酸化。與野生型同窩小鼠相比,Camk2n1敲除小鼠表現(xiàn)為心肌梗死后心功能不全加重、纖維化面積增大、室性早搏發(fā)生率增高、室性心動(dòng)過速或室顫易感性增高。NLRP3炎性小體的過度激活導(dǎo)致心肌梗死,Camk2n1小鼠的炎性反應(yīng)加劇,從而導(dǎo)致心臟重構(gòu)。更重要的是,體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)均證實(shí),在,Camk2n1小鼠中NLRP3炎性小體激活通過CaMKⅡδ-p38/JNK途徑加劇心律失常的發(fā)生發(fā)展[23]。以上結(jié)果均提示NLRP3 炎性小體激活及其下游炎性因子釋放增加與心臟電活動(dòng)改變密切相關(guān),抑制炎性反應(yīng)有可能成為心律失常治療的潛在靶點(diǎn)。

7 問題與展望

NLRP3炎性小體激活對(duì)于心臟疾病發(fā)病至關(guān)重要,抑制NLRP3炎性小體及下游炎性因子IL-1β和IL-18的激活可以阻止心臟疾病的發(fā)生發(fā)展。NLRP3炎性小體可被多種信號(hào)系統(tǒng)激活,其分子機(jī)制迄今仍不明確。目前認(rèn)為抑制NLRP3炎性小體激活最有希望的治療方法是抗IL-1、抑制caspase-1和P2X7受體拮抗劑。針對(duì)NLRP3炎性小體的組裝和激活進(jìn)行靶向治療可能是心臟疾病未來的一個(gè)有效新療法。