蔡添娥，陳麗婷，于英

上海交通大學醫(yī)學院附屬上海兒童醫(yī)學中心海南醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心，海南三亞 572000

宮頸癌是全球女性三大常見惡性腫瘤之一，發(fā)病率和病死率逐年升高。人類乳頭瘤病毒（HPV）持續(xù)感染是宮頸癌的主要危險因素，宮頸癌的發(fā)生發(fā)展還受環(huán)境、基因影響［1-2］。宮頸癌篩查、診斷和治療方法是目前宮頸癌的臨床研究熱點。微小RNA（MicroRNA，miRNA）是一類約23 個堿基的單鏈非編碼RNA，可通過堿基互補配對與mRNA 的3'非編碼區(qū) （3'UTRs）結合，調(diào)控mRNA 的轉錄或降解該miRNA。miRNA 在細胞增殖、細胞凋亡、基因甲基化等生物學過程中發(fā)揮重要作用［3］。miRNA 異常表達可促進細胞生長、侵襲和轉移，抑制細胞凋亡和細胞分化，最終導致細胞生長失控，引發(fā)腫瘤［4］。研究［5-6］發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織、細胞系和宮頸癌患者血漿中miR-200a 均呈異常低表達，miR-200a 表達與宮頸癌患者的預后、轉移有關，可作為宮頸癌的預后預測指標。生物信息學分析表明，miR-200a 可通過與多個下游靶mRNA作用，調(diào)控細胞的運動能力，進而影響宮頸癌的轉移［6］。長鏈非編碼RNA（lncRNA）可以發(fā)揮“海綿作用”與miRNA 結合，從而減少miRNA對mRNA 表達的抑制作用［7］。因此miRNA 可與其靶向mRNA和lncRNA共同調(diào)控細胞的生物學過程。目前miR-200a 對宮頸癌增殖、凋亡及遷移的影響及其具體作用機制尚不明確。2022年3—9月，我們觀察了miR-200a 表達上調(diào)或下調(diào)后對宮頸癌細胞系HeLa 增殖遷移和侵襲的調(diào)控作用，運用生物信息學方法分析miR-200a 的靶向mRNA、靶向lncRNA及其生物學功能，以期為宮頸癌臨床診斷及靶向治療提供理論依據(jù)。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑及儀器 人宮頸癌細胞系HeLa、SiHa、CaSki、C33A及人正常上皮293T細胞由南方醫(yī)科大學提供；胰蛋白酶、胎牛血清和DMEM 培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司；Lipofecta mineTM2000轉染試劑購自美國Invitrogen 公司；miRNA 合成物和PCR引物由上海吉瑪公司合成；TRIzol、反轉錄試劑和SYBR?PCR試劑盒均購自大連TaKaRa公司；CCK-8試劑盒購自南京凱基公司；結晶紫購自碧云天生物技術研究所；Matrigel 購自美國BD Bioscience 公司；8.0 μm孔徑Transwell小室購自美國Millipore公司。

1.2 受試細胞系篩選、HeLa 細胞分組及miRNA 模擬物、miRNA 抑制物轉染方法 ①取293T、HeLa、SiHa、CaSki、C33A 細胞，采用qRT-PCR 法檢測細胞檢測miR-200a。TRIzol 試劑提取各組細胞總RNA，反轉錄試劑盒將RNA 反轉錄為cDNA，再用SYBR?PCR 試劑盒進行qPCR 檢測，用于PCR 的基因和引物如下：miR-200a上游引物為5'-UAACACUGUCUGGUAACGAUGU-3'，下游引物為5'-CAG CCACAAAAGAGCACAAT-3'；內(nèi)部參照基因U6 上游引物為5'-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3'，下游引物為5'-TTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。 以2-ΔΔCT代表基因的相對表達量。重復檢測3 次，取平均值。293T、HeLa、SiHa、CaSki、C33A細胞miR-200a相對表達量分別為1.02 ± 0.05、0.44 ± 0.10、0.68 ± 0.14、0.58 ± 0.21、0.88 ± 0.34。HeLa、SiHa、CaSki 細胞miR-200a 相對表達量均低于293T細胞（P均＜0.05），其中HeLa 細胞miR-200a 相對表達量最低，因此選取HeLa細胞為后續(xù)研究對象。②取對數(shù)生長期HeLa細胞，1.2×105/孔鋪于6孔板，分為1-4 組，每組6 個復孔，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，細胞培養(yǎng)箱溫度37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%，培養(yǎng)至細胞密度70%～80%時進行轉染。取無血清培養(yǎng)基稀釋miRNA 合成物（100 pmoL）和LipofectamineTM2000（0.25 μL），混合后靜置20 min 并加入6 孔板。對數(shù)生長1、2、3、4 組細胞分別轉染miRNA 模擬物miR-200a mimics、miRNA 抑制物miR-200a inhibitor、mimics NC、inhibitor NC。轉染后培養(yǎng)4～6 h 更換含血清DMEM 培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h 時進行后續(xù)實驗。

1.3 各組細胞miR-200a 檢測 培養(yǎng)48 h 時取各組細胞，采用qRT-PCR 法檢測miR-200a。操作方法同“1.2”，重復檢測3次，取平均值。

1.4 各組細胞增殖情況觀察 采用CCK8 法。培養(yǎng)24 h時取各組細胞， 5×103/孔鋪于96孔板，每組5個復孔。檢測時細胞加入CCK8 試劑10 μL /孔，并于培養(yǎng)箱孵育1.5 h 后用酶標儀測定在450 nm 處的光密度（OD）。以OD 值代表各組細胞的增殖能力，重復檢測3 次，取平均值。每24 h 檢測1 次，連續(xù)檢測4次。實驗重復檢測3次，取平均值。

1.5 各組細胞侵襲能力檢測 采用Transwell 小室。培養(yǎng)48 h 時取各組細胞，在鋪細胞前進行基質(zhì)膠鋪膠。Matrigel 膠于4 ℃溶解，用DMEM 培養(yǎng)基按照體積1：8 稀釋，70 μL/孔鋪于Transwell 小室上室，下室加700 μL 含血清DMEM 培養(yǎng)基，細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后取出上室并吸干液體，PBS 緩沖液清洗兩次。無水甲醇室溫固定20 min，PBS 清洗兩次后0.1%結晶紫染色15 min。37 ℃放置過夜后加50 μL/孔無血清培養(yǎng)基，37 ℃放置30 min。于倒置顯微鏡下隨機取3 個視野拍照（×200），計算各組侵襲細胞數(shù)。重復檢測3次，取平均值 。

1.6 各組細胞遷移情況觀察 采用Transwell 小室、細胞劃痕實驗。培養(yǎng)48 h時取各組細胞，所有操作均同“1.5”，測算各組遷移細胞數(shù)。取各組細胞，待細胞融合度為100%時，用200 μL 槍頭均勻劃3條劃痕。PBS 洗去劃下的細胞，加無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)0、24、48 h 時于顯微鏡下隨機取3個視野拍照（×10），并計算各組細胞遷移率。細胞遷移率=［Δ劃痕距離/劃痕距離（0 h）］×100%。實驗重復3次，取平均值。

1.7 miR-200a 的靶向mRNA、靶向lncRNA 預測及其生物學功能分析

① miR-200a 的靶向mRNA 和靶向lncRNA 預測運用數(shù)據(jù)庫microT-CDS（http：//www. microrna. gr/microT-CDS） 、 miRDB （http：//www. mirdb. org/miRDB/）、 TargetScan（http：//www. targetscan. org/vert_72/）預測miR-200a 的靶向mRNA，將三個數(shù)據(jù)庫得到的靶mRNA 取交集后獲得高可信度的miR-200a 靶向mRNA，進行后續(xù)分析。使用DIANA-Lnc-Base V2（http：//carolina. imis. athena-innovation. gr/diana_tools/web/index. phpr=lncbasev2% 2Findex）數(shù)據(jù)庫，預測模式選擇實驗驗證，組織選擇宮頸，預測對miR-200a具有靶向作用的lncRNA。

② miR-200a 靶向mRNA 和靶向lncRNA 功能分析 用DAVID（https：//david. ncifcrf. gov/）網(wǎng)站分析宮頸組織miR-200a 靶向mRNA 和lncRNA 的功能。背景基因為人類全基因組，分析嚴謹度中等，采用進行基因本體論（GO）功能注釋和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集聚類分析，GO 功能注釋包括生物功能（Biological Process， BP）和分子功能（Molecular Function， MF）。使用STRING （http：//string. Db.org）在線分析宮頸組織miR-200a 靶向mRNA、lncRNA 編碼蛋白的相互作用，用相互作用分數(shù)大于0.7 的靶基因蛋白繪制靶基因蛋白相互作用網(wǎng)絡圖。篩選與5 個或以上蛋白具有相互作用的蛋白的靶基因為作用網(wǎng)絡的關鍵節(jié)點基因。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS20.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，兩組比較采用獨立樣本均數(shù)t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組HeLa細胞miR-200a相對表達量比較 培養(yǎng)48 h時1、2、3、4組細胞miR-200a相對表達量分別為193.98 ± 10.84、0.36 ± 0.04、1.01 ± 0.16、1.04 ±0.32，與3 組比較，1 組細胞miR-200a 相對表達量升高，與4 組比較，2 組細胞miR-200a 相對表達量降低（P均＜0.05）。

2.2 各組細胞增殖能力比較 培養(yǎng)24、48、72、96 h時各組細胞增殖能力比較見表1。

表1 培養(yǎng)24、48、72、96 h時各組細胞增殖能力比較（± s）

注：與3組比較，*P＜0.05；與 4組比較，#P＜0.05。

組別1組2組3組4組細胞增殖能力培養(yǎng)24 h 0.35 ± 0.00 0.40 ± 0.01 0.35 ± 0.01 0.38 ± 0.04培養(yǎng)48 h 0.60 ± 0.03 0.65 ± 0.01 0.64 ± 0.01 0.63 ± 0.01培養(yǎng)72 h 0.94 ± 0.01*1.92 ± 0.03#1.37 ± 0.04 1.45 ± 0.04培養(yǎng)96 h 1.72 ± 0.08*2.56 ± 0.02#2.10 ± 0.10 2.07 ± 0.01

2.3 各組細胞侵襲、遷移細胞數(shù)及細胞遷移率比較 培養(yǎng)48 h 時1、2、3、4 組侵襲細胞數(shù)分別為（24.67 ± 5.69）、（144.00 ± 30.81）、（60.67 ±8.14）、（61.33 ± 14.05）個；遷移細胞數(shù)分別為（18.66 ± 6.51）、（134.00 ± 29.05）、（44.33 ±7.02）、（69.00 ± 11.53）個。與3組比較，1組侵襲細胞數(shù)、遷移細胞數(shù)少；與4 組比較，2 組侵襲細胞數(shù)、遷移細胞數(shù)多（P均＜0.05）。1、2、3、4 組培養(yǎng)24 h時細胞遷移率分別為10.53% ± 2.97%、22.58% ±2.94%、26.19% ± 1.49%、44.83% ± 3.51%，培養(yǎng)48 h 細胞遷移率分別為43.37% ± 1.17%、46.66% ± 3.38%、47.53% ± 1.59%、59.64% ±4.22%。與3 組比較，培養(yǎng)24、48 h 時1 組細胞遷移率低；與4組比較，培養(yǎng)24、48 h時2組細胞遷移率高（P均＜0.05）。

2.4 miR-200a 的靶向mRNA、靶向lncRNA 及生物學功能 microT-CDS、miRDB、TargetScan 數(shù)據(jù)庫分析得到宮頸組織中miR-200a 的靶向mRNA 分別為201、438、3 225 個，三者交集最終得到83 個高可信度宮頸癌組織中miR-200a 靶向mRNA。 DIANA-LncBase V2 數(shù)據(jù)庫分析得到6 個宮頸組織中對miR-200a 具有靶向作用的lncRNA。83 個宮頸組織miR-200a 的靶向mRNA 可聚類成16 個BP、11 個MP 和3 個KEGG 信號通路集群，主要涉及轉錄調(diào)控、自噬體組裝、神經(jīng)元遷移和軸突導向等生物學過程，DNA、RNA 結合等分子功能，Wnt信號通路、Hippo 信號通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工信號通路。MAPK8、PSEN1、YAP1 蛋白是宮頸組織miR-200a 靶基因蛋白相互作用網(wǎng)絡的關鍵節(jié)點。

3 討論

miRNA 是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要調(diào)控因子，對腫瘤干細胞、上皮間質(zhì)轉化和腫瘤微環(huán)境具有重要的調(diào)控作用。腫瘤細胞的調(diào)控通常由多個miRNA 共同作用，它們具有相似的化學結構和作用模式［4，8］。miR-200 家族共包含五個成員：miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429。研究［6，9］表明，miR-200家族與多種腫瘤相關，不同成員在不同腫瘤中可作為抑癌基因，也可作為致癌基因。

研究［10］發(fā)現(xiàn)，miR-200a 在膀胱癌組織中異常高表達，可以上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2 表達，從而促進膀胱癌細胞侵襲，但并不影響細胞遷移能力。miR-200a 在卵巢癌組織和細胞中高表達，可靶向抑制PCDH9基因表達，最終促進卵巢癌細胞增殖和侵襲［11］。miR-200a 在膀胱癌和卵巢癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了促進作用，但在某些癌癥疾病中則發(fā)揮抑癌基因的作用。在胃癌組織中，miR-200a 低表達時，miR-200a 靶向作用于KLF12 基因，抑制胃癌細胞增殖和遷移，并將細胞阻滯于G1/S 期［12-13］。miR-200a在黑色素瘤中低表達，miR-200a 水平的降低與黑色素瘤患者預后不良有關。miR-200a 可通過抑制GOLM1 基因表達，調(diào)控PI3K/Akt 信號通路和上皮間質(zhì)轉化抑制黑色素瘤的進展［14］。miR-200a 在不同腫瘤中發(fā)揮的作用不同，說明miR-200a 的表達具有疾病種類特異性。miR-200a 對不同腫瘤細胞的調(diào)控機制也不一致，但基本集中在細胞增殖和侵襲能力的調(diào)控。miR-200a 在宮頸癌中的研究目前還停留在檢測miR-200a 在組織、細胞和血漿中的表達，并且都呈低表達［5］。有關miR-200a 在宮頸癌細胞中的調(diào)控機制目前尚未見報道。本研究結果在細胞水平證實了miR-200a 可顯著抑制宮頸癌HeLa 細胞的增殖、遷移和侵襲能力，說明miR-200a 在宮頸癌中發(fā)揮著抑癌作用。

腫瘤發(fā)生發(fā)展受多種基因共同調(diào)控，miR-200a的上游和下游調(diào)控基因亦有多種，形成復雜的調(diào)控網(wǎng)。通過在線預測miR-200a 下游靶向mRNA 并對其進行功能分析，結果表明ZNF家族基因、KLF家族基因、ZBTB41等多個靶基因編碼蛋白為轉錄調(diào)控因子，功能與轉錄調(diào)控密切相關。信號通路預測則富集于Wnt 信號通路和Hippo 信號通路。Wnt 信號通路是促發(fā)宮頸癌的關鍵通路，F(xiàn)ZD 作為其下游調(diào)控基因共同參與調(diào)控宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展［15］。Hippo-YAP 信號通路由一系列蛋白激酶和轉錄因子構成，作為腫瘤抑制的一個重要信號通路，可通過影響細胞的增殖、凋亡、侵襲與遷移等生物學進程進而參與腫瘤的發(fā)生［16］。有研究［17］顯示Hippo-YAP信號通路可影響宮頸癌微環(huán)境中各種非腫瘤細胞的生物學，與EGFR信號通路和HPV癌蛋白共同調(diào)節(jié)宮頸癌發(fā)生發(fā)展［18］。本研究中，F(xiàn)ZD1 和YAP1 為miR-200a 的預測靶基因，且參與Wnt 信號通路或Hippo 信號通路，YAP1 在靶基因編碼蛋白作用網(wǎng)絡中還處于關鍵節(jié)點位置。miR-200a 抑制宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲能力可能是通過調(diào)控Wnt- FZD1信號通路或Hippo-YAP1 信號通路。其具體分子機制有待進一步實驗驗證。

miR-200a 可通過下調(diào)其下游mRNA 的表達水平，調(diào)控下游信號通路，同時也受上游lncRNA 或基因的調(diào)控。lncRNA、miRNA、mRNA 之間形成了緊密的競爭性內(nèi)源性RNA 調(diào)控網(wǎng)絡［19］。研究［20］發(fā)現(xiàn)，在缺氧條件下的在肝癌細胞中，LncRNA MALAT1可吸附miR-200a，使其調(diào)控功能下降，從而抑制細胞增殖和侵襲。在乳腺癌中，F(xiàn)EN1 可介導miR-200a 甲基化，使miR-200a 表達下調(diào)，并激活表皮生長因子受體信號通路、促進上皮間質(zhì)轉化，導致乳腺癌惡化［21］。LncRNA H19 和LncRNA MALAT1 在肺癌中通過海綿作用抑制miR-200a 調(diào)控ZEB1 和ZEB2 表達功能，進而促進肺癌細胞增殖和轉移［22-24］。本研究中，我們在LncRNA 數(shù)據(jù)庫中查詢到LncRNA MALAT1 在宮頸癌HeLa 細胞中與miR-200a 可靶向結合，LncRNA MALAT1 可能通過吸附miR-200a，從而抑制miR-200a 對mRNA 的調(diào)控作用，最終促進宮頸癌HeLa細胞增殖和侵襲。

綜合本研究對miR-200a 下游mRNA 和上游lncRNA 的預測分析，miR-200a對宮頸癌的抑制作用也可能受到多個lncRNA的調(diào)控，并隨后影響下游靶基因的表達。miR-200a 可能與ZNF 家族基因、KLF家族基因、FZD1、YAP1 等基因，以及l(fā)ncRNA MALAT1 共同作用，形成宮頸癌調(diào)控網(wǎng)絡。而其相互作用機制及其對宮頸癌細胞的影響還有待進一步深入探索。

綜上所述，上調(diào)miR-200a 表達可抑制HeLa 細胞的增殖、遷移和侵襲，抑制miR-200a 表達可促進HeLa細胞的增殖、遷移和侵襲。miR-200a可能通過轉錄調(diào)控、核酸結合等生物學過程，Wnt 信號通路、Hippo 信號通路及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工信號通路，參與調(diào)控宮頸癌的增殖、遷移和侵襲。miR-200a 可能作為預防、診斷和治療宮頸癌的一個潛在生物標志物。