楊錫金，王 艷，陳梓瀚，劉明蕓，吳 俊，向 楊，陳榮祥, ，周亞平,

（1.遵義醫(yī)科大學藥學院，貴州遵義 563000；2.遵義醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，貴州遵義 563000）

景天三七（Sedum aizoonL）為景天科景天屬的多年生草本植物[1]，別名費菜、養(yǎng)心草、救心菜等，在我國主要分布于福建、江蘇、河北、河南等地。景天三七可作藥用，具有良好的抗氧化、抗炎、抗菌和止血等生物活性，用于止血止痛、消腫散瘀、寧心安神、消炎和高血壓等病癥[2-3]。據(jù)文獻報道，民間廣泛將景天三七作為藥食兩用的天然物用于高血脂、高血壓和一些心臟疾病的防治，故被稱為“救心菜”，中科院武漢植物園曾立項將其作為莖葉類蔬菜進行開發(fā)利用[4]，并且被中國綠色食品發(fā)展中心認定為AA 級綠色食品[5]。景天三七始載于《救荒本草》，其化學成分主要包括酚酸類、黃酮類、糖類、揮發(fā)油、生物堿以及三萜類等[6-7]。其中黃酮和酚酸類成分為景天三七中的主要活性成分[8]，如原兒茶酸、咖啡酸、楊梅素、槲皮素、木犀草苷等[9-10]。

現(xiàn)有對景天三七指紋圖譜與活性的研究多是在抗炎、止血和安神等藥理作用，如林珠燦等[9]采用HPLC指紋圖譜法研究其抗炎活性成分；蔡揚帆等[10]采用HPLC 法建立不同產(chǎn)地景天三七指紋圖譜，篩選安神活性部位?；蚴菃我韵嗨贫仍u價藥材質(zhì)量，如林珠燦等[11]對景天三七HPLC 指紋圖譜的研究。景天三七抗氧化活性多集中于總酚和總黃酮，如王佰靈等[12]對景天三七中總多酚提取工藝的優(yōu)化及抗氧化研究，對具體作用成分的分析較少?；騿我陨贁?shù)成分研究其抗氧化活性，如Gong 等[13]以不同干燥方法研究對景天三七不同部位酚類化合物及抗氧化能力的影響。目前，景天三七與抗氧化活性的譜效關(guān)系尚未有明確報道，而液相色譜指紋圖譜可以表征植物活性物質(zhì)，是評價食源性植物質(zhì)量和一致性的重要方法，結(jié)合譜效關(guān)系可篩選食源性植物中的生物活性成分[14]。常用的檢測器中，電化學檢測器因其選擇性好、靈敏度高、響應快，且能夠更快速檢測分析具有高電化學活性、易氧化的化合物，如：酚酸、雜環(huán)化合物，目前已廣泛應用于生物、化學和醫(yī)學等領(lǐng)域[15-16]。

綜上，本研究擬建立高效液相色譜-電化學檢測（HPLC-ECD）指紋圖譜，通過相似度評價對各批次樣品進行質(zhì)量評價；同時，測定1,1-二苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除活性、2,2-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis（ 3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid） ，ABTS）自由基清除活性以及鐵離子還原能力（ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP），結(jié)合偏最小二乘回歸分析和灰色關(guān)聯(lián)分析等化學計量學方法，研究景天三七指紋圖譜與抗氧化活性之間的譜效關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

景天三七 采集自貴州、重慶、云南、河南、河北、安徽、江蘇等不同地區(qū)，經(jīng)遵義醫(yī)科大學孟令杰博士鑒定為景天科植物景天三七（Sedum aizoonL）的地上部分，經(jīng)45 ℃烘干至恒重后粉碎。樣品信息見表1；乙腈 色譜級，北京伊諾凱科技有限公司；沒食子酸、原兒茶酸、色氨酸、沒食子酸甲酯、表沒食子兒茶素（epigallocatechin，EGC）、咖啡酸、楊梅苷、迷迭香酸、槲皮苷 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG） 四川維克奇生物科技有限公司；異槲皮苷 成都普菲德生物技術(shù)有限公司；鳶尾酚酮

成都植標化純生物技術(shù)有限公司；對照品純度均大于97%；所有其余試劑均為分析純。

UltiMate 3000 bio-RS 超高效液相色譜儀（配備Chromeleon 7.2 工作站、ECD-3000 RS 電化學檢測器，檢測池為安培檢測池）、ST8R 小型臺式離心機、1510 酶標儀 美國Thermo-fisher；ME104E/02 電子分析天平、FE28 型pH 計 梅特勒-托利多；SB-5200DT 型超聲波清洗機 寧波新芝生物科技有限公司；Purelab Chorus 2 超純水系統(tǒng) 英國埃爾格。

1.2 實驗方法

1.2.1 供試液的制備 參考文獻[17-18]，分別精密稱取23 批景天三七粉末（過60 目篩）0.7 g，料液比按1 g:20 mL 加入80%甲醇，超聲提取30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用80%甲醇補足失重；于10000 r/min離心5 min 后，取上清液用0.22 μm 有機濾膜過濾。

1.2.2 對照品溶液的配制 分別精密稱取沒食子酸、原兒茶酸、色氨酸、沒食子酸甲酯、EGC、咖啡酸、EGCG、楊梅苷、異槲皮苷、迷迭香酸、槲皮苷等適量對照品，甲醇溶解，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的標準品儲備液，于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 色譜條件 色譜柱：XBridge BEH shield RP18色譜柱（3.0 mm×150 mm，2.5 μm）；流動相：A:乙腈，B:50 mmol/L 檸檬酸緩沖溶液（pH2.75），梯度洗脫：0～20 min，2.5%～25% A；20～25 min，25%～42.5% A；25～33 min，42.5%～75% A。體積流量：0.6 mL/min；柱溫：45 ℃；檢測電壓：600 mV；進樣體積：4 μL。

1.2.4 多成分含量測定 稱取景天三七樣品粉末，按“1.2.1”方法制備供試品溶液，按上述“1.2.3”色譜條件條件測定并記錄峰面積，計算其含量。

1.2.5 抗氧化活性的測定

1.2.5.1 DPPH 自由基清除能力的測定 參考文獻[19-20]，將樣品提取液稀釋80 倍作為供試液，于2 mL 離心管中加入60 μL 供試液和140 μL 80%甲醇，再加入400 μL DPPH 溶液（0.1 mg/mL），混合均勻后于室溫下避光靜置30 min。在波長517 nm 處測定吸光值，DPPH 自由基清除能力以Trolox 當量（mg TE/g DW）表示。

1.2.5.2 ABTS 自由基清除能力的測定 參考文獻[19-20]，配制ABTS 溶液，734 nm 處吸光度為0.70±0.02。樣液稀釋250 倍作為供試液。分別取40 μL供試液和160 μL 80%甲醇，加入400 μL ABTS 工作液，混合均勻后，于暗處反應30 min，734 nm 處測定吸光度，計算Trolox 當量（mg TE/g DW）。

1.2.5.3 鐵離子還原能力（FRAP）的測定 參考文獻[19-20]，工作液由20 mmol/L FeCl3溶液、冰醋酸-醋酸鈉緩沖溶液（pH3.6）和10 mmol/L TPTZ 溶液按1:10:1 配制而成。將提取液稀釋60 倍作為供試液，取60 μL 供試液和40 μL 80%甲醇置于2 mL 離心管中，加入300 μL TPTZ 工作液，于37 ℃水浴中反應10 min，測定其在593 nm 處的吸光度，F(xiàn)RAP以Trolox 當量（mg TE/g DW）表示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 版）建立HPLC-ECD 指紋圖譜；采用SPSS 軟件，對 23 批樣品進行系統(tǒng)聚類分析；采用SIMCA 14.1 軟件，建立PLSR 模型；采用Excel 進行GRA 分析；參考文獻[21-22]，通過RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫獲取蛋白結(jié)構(gòu)，將化合物與GSTP1、ROS-1、TNF、HO-2 和NO-1導入Discover Studio 2016 進行分子對接。

2 結(jié)果與分析

2.1 指紋圖譜方法學考察

2.1.1 精密度試驗 按“1.2.1”項下制備供試液，“1.2.3”項條件下連續(xù)進樣6 次。各共有峰保留時間RSD 在0.05%～0.29%之間，峰面積的RSD 在1.98%～6.20%之間。表明儀器精密度良好。

2.1.2 穩(wěn)定性試驗 按“1.2.1”項下制備供試液，分別于0、2、4、6、12、24 h 進樣一次。各共有峰保留時間RSD 在0.07%～0.78%之間，峰面積的RSD 在2.48%～7.18%。表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.3 重復性試驗 按“1.2.1”項下制備6 份供試液，“1.2.3”項條件下進樣分析。各共有峰保留時間RSD 均在0.01%～0.39%之間，峰面積的RSD 在0.29%～6.44%之間。表明方法重復性良好。

2.2 指紋圖譜的建立及相似度評價

景天三七HPLC-ECD 指紋圖譜見圖1，共標定17 個共有峰。以S1 為參照圖譜，依次進行多點校正、峰匹配后以平均數(shù)法生成對照圖譜（見圖2）并進行相似度計算。通過圖2 與混合標準品溶液的色譜圖比對（圖3），2 號峰為沒食子酸，4 號峰為原兒茶酸，6 號峰為色氨酸，7 號峰為沒食子酸甲酯，8 號峰為EGC，9 號峰為咖啡酸，11 號峰為EGCG，12 號峰為鳶尾酚酮，13 號峰為楊梅苷，14 號峰為異槲皮苷，15 號峰為迷迭香酸，17 號峰為槲皮苷。各批樣品的相似度結(jié)果見表2，其相似度較高，范圍在0.852～1.000 之間，表明各批景天三七樣品間一致性較高。

圖1 23 批景天三七HPLC-ECD 指紋圖譜Fig.1 HPLC-ECD fingerprint of 23 batches of Sedum aizoon L.

圖2 23 批景天三七樣品指紋圖譜的共有模式圖Fig.2 Common pattern of the fingerprint of 23 batches of Sedum aizoon L.

圖3 混合對照品溶液色譜圖Fig.3 Chromatogram of standard solution

表2 23 批景天三七的相似度結(jié)果Table 2 Similarity evaluation of 23 batches of Sedum aizoon L.

2.3 多成分含量測定

2.3.1 線性關(guān)系 分別精密吸取“1.2.2”項下的對照品溶液，配制成不同濃度的混合對照品溶液，按上述色譜條件進樣分析，記錄峰面積。以對照品的濃度（μg/mL）為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，計算線性回歸方程，見表3。12 種化合物在線性范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，r在0.9990～0.9999 范圍內(nèi)。

表3 方法學考察Table 3 Method validation of the proposed method

2.3.2 精密度試驗 按“1.2.1”項下制備供試液，連續(xù)進樣6 次。各共有峰保留時間RSD 在0.05%～0.26%之間，峰面積RSD 在1.85%～5.93%之間。表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 按“1.2.1”項下制備供試液，分別于0、2、4、6、12、24 h 進樣一次。各共有峰保留時間RSD 在0.12%～0.95%之間，峰面積RSD 在2.15%～6.86%。表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 重復性試驗 按“1.2.1”項下制備6 份供試液，進樣分析。各共有峰保留時間RSD 均在0.03%～0.28%之間，峰面積RSD 在1.24%～6.25%之間。表明該方法重復性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗 取同一批含量已知的景天三七粉末6 份，每份約0.35 g，加入適量對照品，按“1.2.1 樣品制備”方法制備供試液，進樣測定，計算回收率。結(jié)果見表3，平均加樣回收率在93.08%～99.35%之間，其RSD 在2.01%～6.35%之間。

2.3.6 樣品測定 含量測定結(jié)果見表4。其中，沒食子酸、色氨酸、EGCG、楊梅苷和異槲皮苷的含量較高，其含量分別為207.52～2319.45、338.28～1136.17、25.97～2476.61、433.39～2675.31 和7.69～759.54 μg/g；各批樣品之間也存在較大差異。任平等[23]的研究表明，土壤元素中的鈣、銅、鐵對景天三七活性成分含量影響較大。同時，充足的降水量可保證植物的正常生長代謝和次生代謝物質(zhì)的累積。多個溫度因子對黃酮含量呈現(xiàn)負相關(guān)，因而適度低溫有利于黃酮類物質(zhì)的合成，并且較大的溫差有利于景天三七谷甾醇、總黃酮和景天庚糖的累積，尤其是總黃酮含量的增加最為明顯。何晶晶等[24]的研究結(jié)果表明，不同采收期的景天三七含量存在差異。因此，景天三七樣品間的差異不僅與產(chǎn)地間的多種生態(tài)因子有關(guān)，同時還與采收季節(jié)有關(guān)，也可能是藥材的成熟程度不同而導致。

表4 23 批景天三七中12 種化合物含量測定結(jié)果（μg/g）Table 4 Contents of 12 compounds in 23 batches of Sedum aizoon L. (μg/g)

2.4 抗氧化活性評價

體外抗氧化活性的測定結(jié)果見表5。DPPH、ABTS 自由基清除能力和鐵離子還原能力的范圍分別為5.87～100.92、25.57～274.66 和8.54～122.12 mg TE/g DW。其中，S12 的抗氧化活性最強；抗氧化活性較弱的樣品為S3 和S14，二者原兒茶酸、沒食子酸甲酯、EGC、楊梅苷、異槲皮苷、迷迭香酸和槲皮苷的含量均較低，故而活性較弱。因此這幾種成分可能與景天三七的抗氧化活性密切相關(guān)。

表5 23 批景天三七抗氧化能力測定結(jié)果Table 5 Results of antioxidant activity in 23 batches of Sedum aizoon L.

2.5 化學計量學分析

2.5.1 聚類分析 如圖4 所示，當平方歐氏距離為5 時，23 批樣品可被分為五類，第Ⅰ類包括S1、S4、S5、S8、S9、S14、S15、S16、S17、S18、S20、S21、S22，化合物間的含量差異較小，且含量較高。其中，多數(shù)樣品的產(chǎn)地為江蘇，與湖南、山東、貴州、河南、河北等地的樣品有少許交叉，而江蘇一帶為亞熱帶季風氣候-溫帶季風氣候。夏季高溫多雨，降水量充足，有利于生物活性物質(zhì)的積累。第Ⅱ類僅含S2 和S19；而樣品S3 被單獨分為第Ⅲ類，S3 中大多數(shù)化合物含量均低于其他樣品，故而被單列為一類。研究表明，適度的低溫和較大的溫差，有利于黃酮類化合物的合成。S3 樣品產(chǎn)地為云南省昆明市，全年溫差較小，日照長；多數(shù)化合物含量均為最低，故而證實了溫差對景天三七中活性成分的含量有一定影響；第Ⅳ類包括S6、S10、S11、S13、S23，該類中樣品產(chǎn)地較為分散，但均為鄰省，差異較小而聚為一類；第Ⅴ類為S7 和S12，二者的成分含量差異較小，且含量較高，同為鄰省。綜上，景天三七中活性成分的含量與產(chǎn)地有一定關(guān)聯(lián)，但關(guān)聯(lián)性較小，可能是受其生長環(huán)境、生態(tài)因子的影響而產(chǎn)生了樣品之間的差異，過度的土壤酸化可能會抑制景天三七的生長，出現(xiàn)功能紊亂，鋅、鎂、錳和速效鉀等土壤因素影響會其活性物質(zhì)的合成量；其次，景天三七的營養(yǎng)物質(zhì)含量還與光照強度有關(guān)，過強或過弱的光照均會抑制其生長。

圖4 23 批景天三七的聚類樹狀圖Fig.4 Cluster dendrogram of 23 batches of Sedum aizoon L.

2.5.2 偏最小二乘回歸分析 圖5A 結(jié)果表明，12 種化合物均與ABTS、DPPH 自由基清除能力及FRAP 呈正相關(guān)，沒食子酸、原兒茶酸、EGC、EGCG、鳶尾酚酮、楊梅苷、異槲皮苷、迷迭香酸和槲皮苷與抗氧化活性的相關(guān)性較好，3 種體外抗氧化活性測定指標間的相關(guān)性差異較小。

圖5 景天三七12 種化合物與抗氧化活性的PLSR 模型回歸系數(shù)（A）及VIP 值（B）Fig.5 PLSR model regression coefficients (A) and VIP values(B) of the 12 compounds in Sedum aizoon L. and antioxidant activity

VIP 值越大，說明該自變量對因變量的貢獻率越大，當VIP 值＞1 時，自變量與因變量呈顯著相關(guān)。沒食子酸、原兒茶酸、EGC、EGCG、迷迭香酸和槲皮苷的VIP 值均大于1（圖5B），與DPPH、ABTS 自由基清除能力和FRAP 具有顯著相關(guān)性。其中，槲皮苷＞沒食子酸＞EGCG＞迷迭香酸，原兒茶酸與EGC 的抗氧化能力差異較小。董馨等[25]推測酚羥基化合物的構(gòu)效關(guān)系為鄰三酚羥基＞鄰對三酚羥基＞間三酚羥基，鄰二酚羥基＞對二酚羥基＞間二酚羥基。黃酮類化合物結(jié)構(gòu)中B 環(huán)酚羥基活性高于A 環(huán)，且B 環(huán)上3,4-鄰苯二酚結(jié)構(gòu)活性最強[26]。槲皮苷具有鄰二酚羥基和間二酚羥基，其中3,4-鄰苯二酚活性較強，雖然含量不及沒食子酸，其活性卻略強于沒食子酸，但二者差異較?。粵]食子酸具有鄰三酚羥基，且其含量較高，為景天三七中的主要活性成分，ECCG 具有兩個鄰三酚羥基和1 個間二酚羥基，迷迭香酸具有2 個鄰二酚羥基。因此，本研究對體外抗氧化活性的研究與前人的研究結(jié)果基本一致。

2.5.3 灰色關(guān)聯(lián)分析 關(guān)聯(lián)度越大，化學成分的抗氧化活性作用越強。結(jié)果表明（表6），各化合物與體外抗氧化活性的關(guān)聯(lián)度均大于0.6，均與體外抗氧化活性密切相關(guān)，是多種化合物共同作用的結(jié)果。對ABTS 自由基清除能力貢獻較大的共有峰（關(guān)聯(lián)度＞0.7）主要有：沒食子酸＞迷迭香酸＞槲皮苷＞EGC＞異槲皮苷＞原兒茶酸＞EGCG＞楊梅苷＞鳶尾酚酮，其中沒食子酸的關(guān)聯(lián)度高達0.8168，對抗氧化活性的影響較大。槲皮苷、迷迭香酸、沒食子酸、鳶尾酚酮、EGC、楊梅苷和異槲皮苷的關(guān)聯(lián)度均大于0.7，對DPPH 自由基清除能力的貢獻較大，相關(guān)性較顯著，其中的槲皮苷關(guān)聯(lián)度大于0.8。除色氨酸、沒食子酸甲酯、咖啡酸外，其余9 種化合物與FRAP 的關(guān)聯(lián)度較大，其中沒食子酸、槲皮苷和迷迭香酸的關(guān)聯(lián)度均大于0.8，對FRAP 的貢獻極大。

表6 12 種化合物與抗氧化活性的灰色關(guān)聯(lián)結(jié)果Table 6 Results of gray correlation between 12 compounds and antioxidant activity

以ABTS、DPPH 和FRAP 三者的關(guān)聯(lián)度之和來看，景天三七中體外抗氧化活性較強的前5 種化合物為：沒食子酸、槲皮苷、迷迭香酸、EGC 和異槲皮苷，該結(jié)果與偏最小二乘回歸分析結(jié)果有些許差異，但可以確定的是沒食子酸、迷迭香酸和槲皮苷與抗氧化活性的關(guān)聯(lián)度極大，可將其作為一個質(zhì)控指標。而沒食子酸甲酯和咖啡酸，它們雖具有酚羥基結(jié)構(gòu)，但其含量較低，發(fā)揮的作用較小，故而關(guān)聯(lián)度較小。而HPLC-ECD 中較為特殊的一個色譜峰為色氨酸，其含量較高，但是與抗氧化活性的關(guān)聯(lián)度較小。其他化合物均為酚類化合物，在體外具有很強的抗氧化作用，主要抗氧化能力存在于酚環(huán)中的雙鍵，羥基側(cè)鏈和糖基化都有助于清除自由基活性。而色氨酸在結(jié)構(gòu)上不同，由于吲哚環(huán)的不穩(wěn)定性，在ECD 上可以被氧化[27]，與自由基結(jié)合生成穩(wěn)定物質(zhì)而發(fā)揮抗氧化作用?；谶胚岘h(huán)和異吲哚環(huán)在ECD 上的良好響應，常用來分析氨基酸類化合物[28]。但是，其抗氧化能力相對于酚類化合物較差。如鉤藤中的鉤藤堿和利血平均為吲哚類生物堿[29-30]，鉤藤堿的主要藥理活性體現(xiàn)在心血管系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的保護作用[31]，利血平主要藥理活性為降壓作用，而抗氧化并不是它們的主要活性。

2.6 分子對接

結(jié)果以Libdock Score 表示（見表7），Libdock Score 越高，小分子與受體結(jié)合的活性越高。12 種化合物均能與活性靶點的關(guān)鍵活性氨基酸殘基結(jié)合，與各靶點的對接結(jié)果基本一致，表明對接參數(shù)較為合理，結(jié)果可靠。EGC、EGCG、楊梅苷、異槲皮苷、迷迭香酸和槲皮苷與各個靶點的對接評分較高，其中與NO-1 靶點的LibDock Score 最高。EGC、EGCG、楊梅苷、異槲皮苷、迷迭香酸和槲皮苷與NO-1 的對接結(jié)果見圖6?；钚猿煞峙c靶點蛋白NO-1 的氨基酸殘基主要通過氫鍵、Pi-Alkyl 鍵、pi-pi Stacked 結(jié)合。綜上，12 種化合物均能與GSTP1、ROS-1、TNF、HO-1 和NO-1 蛋白相結(jié)合，從而發(fā)揮抗氧化作用，具有良好的自由基清除能力。

圖6 不同化合物與NO-1 的分子對接2D 圖Fig.6 2D diagram of molecular docking between different compounds and NO-1

表7 12 種化合物的LibDock 評分Table 7 LibDock Score of 12 compounds

3 結(jié)論

綜上，本研究成功建立了景天三七HPLC-ECD指紋圖譜，結(jié)合多種化學計量方法對不同產(chǎn)地的景天三七進行質(zhì)量評價及抗氧化作用的譜效關(guān)系研究。其中，沒食子酸、EGCG、迷迭香酸和槲皮苷等具有良好的體外抗氧化活性。分子對接研究結(jié)果表明，EGCG、楊梅苷、異槲皮苷、迷迭香酸和槲皮苷等化合物具有良好的自由基清除活性，且能與GSTP1、ROS-1、TNF、HO-1 和NO-1 蛋白相結(jié)合。綜上，本研究可為景天三七抗氧化活性質(zhì)量標志物的篩選和質(zhì)量控制提供了一定的參考依據(jù)。