張苗苗，任宇翔，王伊睿，孫宛婧，白紀(jì)剛，呂 毅，嚴(yán)小鵬*

（1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科，西安 710061；2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院精準(zhǔn)外科與再生醫(yī)學(xué)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，西安 710061；3.西安交通大學(xué)宗濂書院，西安 710061；4.西安交通大學(xué)啟德書院，西安 710061）

0 引言

磁吻合是利用特殊設(shè)計(jì)的磁性裝置，借助磁體間的磁場(chǎng)力來實(shí)現(xiàn)空腔臟器吻合重建的方法。由于磁吻合形式的特殊性而被稱為繼手工縫線吻合和機(jī)械釘式吻合之后的第三種吻合模式，又因磁吻合與內(nèi)鏡技術(shù)和介入技術(shù)相結(jié)合可實(shí)現(xiàn)常規(guī)方法無法實(shí)現(xiàn)的吻合，因此又被譽(yù)為“智慧吻合”[1]。消化道是磁吻合基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用最廣泛的領(lǐng)域，相關(guān)研究涉及食管磁吻合[2-4]、食管胃磁吻合[5]、胃空腸磁吻合[6-7]、小腸磁吻合[8-9]、結(jié)腸磁吻合[10-11]等。磁吻合裝置也可用于泌尿系統(tǒng)如輸尿管膀胱吻合[12]，還可用于氣管食管瘺病理動(dòng)物模型的建立[13-14]以及治療性造瘺[15-16]等領(lǐng)域。

利用磁吻合裝置實(shí)現(xiàn)消化系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)管腔吻合重建時(shí)，受壓組織發(fā)生缺血—壞死—脫落，而受壓旁組織則發(fā)生粘連—修復(fù)—愈合的病理變化過程[17]，在吻合口建立后磁吻合裝置可經(jīng)消化系統(tǒng)或泌尿系統(tǒng)的自然腔道排出體外[18-21]。當(dāng)利用磁吻合裝置進(jìn)行血管吻合時(shí)，不管是端端吻合還是側(cè)側(cè)吻合，磁吻合裝置可能需要永久留置體內(nèi)，因此血管磁吻合對(duì)吻合裝置的生物相容性提出了更高的要求。血管端端吻合時(shí)，磁環(huán)位于血管外，不與血液接觸，因此做好磁體的防腐蝕即可滿足應(yīng)用需求。血管側(cè)側(cè)吻合時(shí)，磁環(huán)位于血管內(nèi)，與血液直接接觸，因此磁環(huán)需要有良好的血液相容性。

電鍍鎳是目前釹鐵硼材料最常見的表面改性方法，能夠滿足工業(yè)和日常生活環(huán)境下的防腐蝕需求，但在胃液環(huán)境下抗腐蝕能力較差[22]。有研究顯示，氮化鈦鍍層后的釹鐵硼磁體抗體液腐蝕能力優(yōu)于鎳鍍層[23]。但有關(guān)氮化鈦鍍層和鎳鍍層釹鐵硼磁體生物相容性的評(píng)價(jià)較少，尤其是當(dāng)其應(yīng)用場(chǎng)景為血管側(cè)側(cè)吻合時(shí)。因此，本文通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)對(duì)課題組自行設(shè)計(jì)的用于血管側(cè)側(cè)吻合的氮化鈦鍍層和鎳鍍層的2 種釹鐵硼磁環(huán)的生物相容性進(jìn)行測(cè)試和評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所用儀器有超聲清洗儀（SB5200DT，寧波新芝生物科技股份有限公司）、視頻光學(xué)接觸角測(cè)量?jī)x（OCA-20，德國(guó)Dataphsics 公司）、酶標(biāo)儀（Multiskan Skyhigh，美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）、掃描電鏡（KYKY-2000，日本HITCH 公司）；試劑有戊巴比妥鈉（美國(guó)Sigma）、無菌生理鹽水（陜西華山制藥廠）、無菌雙蒸水（實(shí)驗(yàn)室自制）、稀釋的抗凝健康人全血（新鮮人血∶生理鹽水=4∶5）、富血小板血漿（PRP）（健康人全血提取而成）、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（上海研拓生物科技有限公司）、2.5%戊二醛（上海源葉生物科技有限公司）、1%鋨酸（上海雅吉生物公司）、100%乙酸異戊酯（上海百舜生物科技有限公司）。

本實(shí)驗(yàn)所用磁環(huán)由N45 燒結(jié)型釹鐵硼永磁材料加工而成，其中氮化鈦鍍層磁環(huán)為跑道型，長(zhǎng)16 mm、寬9 mm，寬度和厚度均為1 mm，單個(gè)磁環(huán)質(zhì)量為0.215 g；鎳鍍層磁環(huán)為橢圓形，長(zhǎng)軸10 mm、短軸4 mm，寬度和厚度均為1mm，單個(gè)磁環(huán)質(zhì)量為0.186 g。上述磁環(huán)由陜西金山電器有限公司加工，實(shí)物圖如圖1 所示。

圖1 磁環(huán)實(shí)物圖

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 接觸角測(cè)試

各取3 枚氮化鈦鍍層和鎳鍍層磁環(huán)經(jīng)超聲清洗儀清洗后利用OCA-20 視頻光學(xué)接觸角測(cè)量?jī)x測(cè)量接觸角。測(cè)量時(shí)先設(shè)置電荷耦合器（charge couple device，CCD）的亮度，并調(diào)節(jié)載物套和針頭使之處于合適的位置。然后調(diào)節(jié)鏡頭進(jìn)行對(duì)焦并設(shè)定標(biāo)尺，進(jìn)一步調(diào)節(jié)基線的位置。設(shè)定液體體積為0.5 L 后開始進(jìn)行試驗(yàn)，待液滴滴落后再一次調(diào)節(jié)基線和液滴輪廓線，然后即可畫出接觸角。

1.2.2 組織相容性測(cè)試

該實(shí)驗(yàn)經(jīng)西安交通大學(xué)生物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過。選取SD 大鼠12 只（購(gòu)于西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），體質(zhì)量為180～220 g，雌雄各半，并隨機(jī)分為2 組，每組6 只。一組置入氮化鈦鍍層磁環(huán)作為實(shí)驗(yàn)組，另一組置入鎳鍍層磁環(huán)作為對(duì)照組，另以正常大鼠作為空白對(duì)照，僅僅獲取正常的肌肉組織和大網(wǎng)膜組織。實(shí)驗(yàn)方法如下[24]：氮化鈦鍍層和鎳鍍層磁環(huán)經(jīng)超聲清洗儀清洗后用環(huán)氧乙烷滅菌備用。所有大鼠采用3%戊巴比妥鈉（0.1 mL/100 g）腹腔注射麻醉，麻醉生效后仰臥位固定，用剃毛器剃除右后肢股部及腹部體毛，并于術(shù)區(qū)消毒鋪無菌巾。用組織剪剪開大鼠右后肢股內(nèi)側(cè)皮膚，長(zhǎng)約10 mm，避開大血管及神經(jīng)，鈍性分離肌肉將磁環(huán)埋于肌肉組織間，之后縫合皮膚。取大鼠腹部正中切口，長(zhǎng)約10 mm，將磁環(huán)置入大網(wǎng)膜處，關(guān)閉腹腔。術(shù)后3 個(gè)月，再次麻醉大鼠，探查磁環(huán)包埋部位的組織粘連情況并獲取磁環(huán)周圍肌肉組織和大網(wǎng)膜行HE 及Masson 染色。以大鼠正常肌肉組織及大網(wǎng)膜病理切片為對(duì)照，觀察炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及膠原纖維沉積情況。

1.2.3 溶血實(shí)驗(yàn)

溶血實(shí)驗(yàn)參照劉敬肖等[25]的實(shí)驗(yàn)方法。取6 支無菌試管分別裝入預(yù)先用環(huán)氧乙烷滅菌處理的氮化鈦鍍層磁環(huán)和鎳鍍層磁環(huán)作為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每支試管內(nèi)加入10 mL 無菌生理鹽水，氮化鈦鍍層磁環(huán)編號(hào)為A 組，鎳鍍層磁環(huán)編號(hào)為B 組。另取6 支試管，其中3 支內(nèi)加入10 mL 無菌生理鹽水作為陰性對(duì)照組（C 組）；剩余3 支試管內(nèi)加入10 mL 無菌雙蒸水作為陽性對(duì)照組（D 組）。將上述試管置入37 ℃恒溫水浴箱內(nèi)預(yù)熱30 min，在每支試管內(nèi)加入0.2 mL稀釋的抗凝健康人全血（新鮮人血∶生理鹽水=4∶5），繼續(xù)置于37 ℃恒溫水浴箱內(nèi)。60 min 后取出試管，然后以3000 r/min 離心5 min。對(duì)每支試管取離心后的上清液3 份，每份100 μL，加入到96 孔培養(yǎng)板中，用酶標(biāo)儀測(cè)量每份樣本在540 nm 處的吸光度。根據(jù)以下公式計(jì)算溶血率：

式中，Dt為待測(cè)樣品吸光度；Dnc為陰性對(duì)照組吸光度；Dpc為陽性對(duì)照組吸光度。

1.2.4 血小板黏附實(shí)驗(yàn)

血小板黏附實(shí)驗(yàn)參照吳勃等[26]文獻(xiàn)中介紹的實(shí)驗(yàn)方案：（1）在12 孔培養(yǎng)板中分別放置預(yù)處理過的氮化鈦鍍層磁環(huán)和鎳鍍層磁環(huán)，緩慢加入3 mL 事先制備的PRP，PRP 的制備參照文獻(xiàn)[27]的方法，然后放入CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)0.5 h 和3 h；（2）預(yù)定培養(yǎng)時(shí)間結(jié)束后，去除PRP 后用PBS 反復(fù)緩慢漂洗3次，每次1 min，棄去漂洗液，加入2.5%戊二醛使磁環(huán)完全被浸泡，然后在4 ℃冰箱中固定12 h；（3）棄去戊二醛固定液，用PBS 漂洗后加入1%鋨酸使磁環(huán)完全被浸泡，然后置于4 ℃冰箱中固定1 h；（4）棄去鋨酸，加入蒸餾水進(jìn)行漂洗，然后依次加入體積百分比為50%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液進(jìn)行梯度脫水10 min；（5）用100%乙酸異戊酯浸泡樣品10 min，之后用臨界點(diǎn)干燥儀進(jìn)行干燥；（6）對(duì)經(jīng)上述處理后的樣品進(jìn)行噴金，用掃描電鏡觀察樣品表面的血小板黏附數(shù)量和聚集狀態(tài)。

2 結(jié)果

2.1 接觸角測(cè)試

測(cè)試結(jié)果顯示，3 枚氮化鈦鍍層磁環(huán)接觸角分別為98°、99°、100°，3 枚鎳鍍層磁環(huán)接觸角分別為100°、101°、106°，均＞90°，提示磁環(huán)表面為疏水性，說明液體不易在其表面浸潤(rùn)吸附。

2.2 組織相容性測(cè)試

磁環(huán)置入過程順利，所有大鼠均存活至觀察終點(diǎn)。磁環(huán)周圍肌肉組織及大網(wǎng)膜的HE 及Masson 染色可見肌肉組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，以正常肌肉組織及大網(wǎng)膜組織病理為參照，未見明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和組織異物反應(yīng)（如圖2、3 所示）。

圖2 磁環(huán)留置后肌肉組織學(xué)觀察結(jié)果

圖3 磁環(huán)留置后大網(wǎng)膜組織學(xué)觀察結(jié)果

2.3 溶血實(shí)驗(yàn)

各組吸光度測(cè)試結(jié)果見表1。根據(jù)公式計(jì)算氮化鈦鍍層磁環(huán)的溶血率為0.23%，鎳鍍層磁環(huán)的溶血率為0.84%?？梢姷佸儗哟怒h(huán)的溶血性能優(yōu)于鎳鍍層磁環(huán)。

表1 各組上清液在540 nm 處的吸光度測(cè)試結(jié)果

2.4 血小板黏附實(shí)驗(yàn)

2 種磁環(huán)分別與PRP 共培養(yǎng)0.5 h 后，掃描電鏡顯示氮化鈦鍍層磁環(huán)表面未見明顯血小板黏附，而鎳鍍層磁環(huán)表面可見少量血小板黏附（如圖4 所示）；當(dāng)磁環(huán)與PRP 共培養(yǎng)3 h 后，氮化鈦鍍層磁環(huán)表面有散在血小板黏附，并且可見偽足生長(zhǎng)，鎳鍍層磁環(huán)表面黏附的血小板數(shù)量明顯增多并呈聚集性黏附，偽足生長(zhǎng)明顯（如圖5 所示）。

圖4 磁環(huán)與PRP 共培養(yǎng)0.5 h 后掃描電鏡觀察結(jié)果

圖5 磁環(huán)與PRP 共培養(yǎng)3 h 后掃描電鏡觀察結(jié)果

3 討論

血管磁吻合包括血管端端磁吻合和血管側(cè)側(cè)磁吻合。與血管端端磁吻合不同，血管側(cè)側(cè)磁吻合時(shí)磁環(huán)位于血管腔內(nèi)，與血液直接接觸，因此對(duì)磁環(huán)的生物相容性要求極高。既往有研究報(bào)道利用釹鐵硼磁環(huán)進(jìn)行冠狀動(dòng)脈搭橋手術(shù)，術(shù)后磁環(huán)留置在人體內(nèi)，該磁環(huán)使用氮化鈦鍍層，在患者服用抗凝藥的情況下吻合口可獲得良好的長(zhǎng)期通暢性[28]，但也有個(gè)別患者因停用抗凝藥而導(dǎo)致吻合口閉塞的發(fā)生[29]。本研究團(tuán)隊(duì)前期首次提出血管側(cè)側(cè)吻合用于門靜脈高壓的限制性分流，并設(shè)計(jì)了用于血管側(cè)側(cè)吻合的磁環(huán)[30]。在本團(tuán)隊(duì)前期研究過程中發(fā)現(xiàn)，磁吻合門腔分流術(shù)后，與血液接觸的磁環(huán)表面將形成一層薄的血管內(nèi)膜覆蓋整個(gè)磁環(huán)[31]，這樣的病理變化提示，磁環(huán)早期需要具備較高的血液相容性，避免短期內(nèi)形成大量附壁血栓，為血管內(nèi)膜的覆蓋創(chuàng)造條件。

釹鐵硼磁體表面改性方案多樣，在具體應(yīng)用時(shí)根據(jù)不同的環(huán)境可選擇最適宜的表面改性方案。血管磁吻合裝置的磁體表面改性方法研究較少，尚無公認(rèn)的最優(yōu)化表面改性方案，這是導(dǎo)致血管磁吻合裝置臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用較慢的重要原因之一。因此對(duì)不同表面改性方案的釹鐵硼磁環(huán)的生物相容性進(jìn)行比較，對(duì)血管磁吻合裝置的設(shè)計(jì)、加工具有重要的參考價(jià)值。

生物相容性評(píng)價(jià)包括組織相容性和血液相容性2 個(gè)方面。磁外科技術(shù)中磁體的體內(nèi)留置分為暫時(shí)留置、短期留置、中-長(zhǎng)期留置、長(zhǎng)期-永久留置等類型[32]，根據(jù)留置部位可分為器官組織內(nèi)留置如磁性水凝膠輔助內(nèi)鏡黏膜下剝離術(shù)[33-34]、器官腔隙內(nèi)留置如磁錨定輔助腹腔鏡手術(shù)[35-36]，不同留置類型和留置部位下對(duì)磁體的表面改性要求差異巨大。本研究中磁環(huán)的留置屬于器官腔隙內(nèi)的永久留置。本研究通過SD 大鼠肌肉和大網(wǎng)膜包埋評(píng)價(jià)了氮化鈦鍍層和鎳鍍層磁環(huán)的組織相容性，大體標(biāo)本及組織學(xué)觀察未見明顯組織粘連、異物肉芽腫形成及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。溶血實(shí)驗(yàn)顯示氮化鈦鍍層磁環(huán)優(yōu)于鎳鍍層磁環(huán)。血小板黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明磁環(huán)與PRP 共培養(yǎng)0.5 h和3 h 后，氮化鈦鍍層磁環(huán)的血小板黏附少于鎳鍍層磁環(huán)。本文從接觸角、組織相容性、溶血率及體外血小板黏附等多維度評(píng)價(jià)了氮化鈦鍍層與鎳鍍層釹鐵硼磁環(huán)的生物相容性，但缺乏在體的血液相容性評(píng)價(jià)，下一步研究中可考慮將磁環(huán)置入大動(dòng)物血管內(nèi)評(píng)價(jià)其血栓形成情況。

綜上所述，氮化鈦鍍層釹鐵硼磁環(huán)與鎳鍍層釹鐵硼磁環(huán)相比在接觸角、組織相容性指標(biāo)上相近，但在溶血率和血小板黏附指標(biāo)方面，氮化鈦鍍層磁環(huán)明顯優(yōu)于鎳鍍層磁環(huán)，這提示磁外科體內(nèi)置入裝置應(yīng)將氮化鈦鍍層作為優(yōu)先考慮的表面改性方案。