張金山，楊詩涵，楊 紅 ，張秀娟，劉治廷，陳小強,4,5,6,

（1.東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150040；2.東北林業(yè)大學(xué)化學(xué)化工與資源利用學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040；3.西藏農(nóng)牧學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院，西藏林芝 860000；4.東北林業(yè)大學(xué)林業(yè)生物制劑教育部工程研究中心，黑龍江哈爾濱 150040；5.黑龍江省林業(yè)活性物質(zhì)生態(tài)利用重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150040；6.生物資源生態(tài)利用國家地方聯(lián)合工程實驗室，黑龍江哈爾濱 150040）

沙棘屬（HippophaeLinn.）植物廣泛分布于亞歐大陸，具有防風(fēng)固沙的作用[1]。沙棘作為一種藥食同源植物富含多種活性物質(zhì)與營養(yǎng)成分，被廣泛應(yīng)用于保健和醫(yī)療領(lǐng)域[2]。黃酮類化合物是沙棘中的重要活性成分，具有抗腫瘤、抗氧化和抑菌等多種藥理功效[3?4]，沙棘也因含有豐富的黃酮類化合物受到了廣泛的關(guān)注。

金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌是生活中常見的食源性細(xì)菌，易造成食物腐敗等食品安全問題[5?6]；白色念珠菌作為一種真菌，可在人體口腔、皮膚等多處引發(fā)炎癥[7]。目前使用抗生素是解決由細(xì)菌和真菌引起的疾病有效方式，但會對生物體產(chǎn)生副作用，且隨著抗生素大量使用，一些病原菌已經(jīng)對整類抗生素產(chǎn)生耐藥性[8?9]。因此，尋求更健康有效的方法來對抗由病原菌引發(fā)的疾病日益成為人們的共識[10]。天然植物源抑菌劑以其天然、安全、高效等特性受到越來越多關(guān)注[11]。有研究表明，黃酮類化合物對多種細(xì)菌具有良好抑制效果，對人體產(chǎn)生的副作用小且不會使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性[12]。因此，將沙棘屬植物中黃酮類化合物制作為天然抑菌劑具有廣泛的前景。目前，對沙棘果實黃酮類化合物的研究多涉及沙棘果實黃酮提取工藝的優(yōu)化及總黃酮的抑菌效果，但關(guān)于黃酮單體抑菌活性的研究較少。

為探究沙棘果實黃酮類化合物對常見病原菌的抑菌活性，本研究選取金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌等4 株病原菌作為供試菌，采用濾紙片法測定沙棘果實黃酮提取物的抗菌性能，通過UPLC-MS/MS 和HPLC 技術(shù)檢測黃酮類化合物的主要成分及含量，并測定3 種主要黃酮類成分的最低抑菌濃度（Minimum inhibitory concentration，MIC）以及細(xì)菌的蛋白流出含量，討論3 種黃酮類成分的抑菌效果，以期提高沙棘果實資源的利用效率，為云南沙棘果實黃酮類物質(zhì)的深入研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

云南沙棘果實 2020 年11 月采自西藏林芝市巴宜區(qū)，經(jīng)東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點實驗室張瑩副研究員鑒定為胡頹子科植物云南沙棘（Hippophae rhamnoidessubsp.yunnanensis）的果實，樣品經(jīng)室溫干燥（25±5 ℃）至恒重，研磨后過0.425 mm篩，?20 ℃冷藏備用；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，ATCC 6538）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，ATCC 6633）、大腸桿菌（Escherichia coli，ATCC 8739）、白色念珠菌（Candida albicans，ATCC 10231）

黑龍江省科學(xué)院應(yīng)用微生物研究所；Qu-3-R、Is-3-G 純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司；Is-3-G-7-Rh 純度≥98%，四川維克奇生物科技有限公司；營養(yǎng)肉湯（Nutrient broth，NB）、營養(yǎng)瓊脂（Nutrient agar，NA）北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；甲醇（色譜級）、考馬斯亮藍(lán)G-250 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲酸、磷酸 均為國產(chǎn)分析純。

JP-100ST 超聲波清洗機 深圳潔盟超聲科技有限公司；NEO 15 離心機 上海力申科學(xué)儀器有限公司；Q-focus 高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀（配有電噴霧離子源（ESI）及Xcalibur4.1 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)）美國Thermo Scientific 公司；1260 高效液相色譜儀 美國Agilent公司；Synergy2 多功能酶標(biāo)儀 美國BioTek 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 云南沙棘總黃酮的制備 采用超聲輔助提取法[13]，取干燥沙棘果實粉末1 g，加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液30 mL，振蕩混勻后靜置30 min，在50 ℃環(huán)境下以400 W 的功率超聲提取30 min，離心（10000 r/min，10 min）后取上清液。參考康瑩[14]的方法將上清液利用AB-8 大孔樹脂進行純化，旋轉(zhuǎn)蒸干（80 r/min，60 ℃），得到純度為56.11%的黃酮提取物。

1.2.2 菌懸液的制備 用消毒的接種環(huán)蘸取少量供試菌種，加入到30 mL 無菌NB 培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。取活化好的供試菌種，用NB 培養(yǎng)基將菌液濃度稀釋至1×108CFU/mL 備用[15]。

1.2.3 總黃酮抑菌圈的測定 采用濾紙片法測定云南沙棘總黃酮對4 種供試菌的抑菌活性。稱取純化后的黃酮提取物溶于生理鹽水中配成1 mg/mL 的黃酮待測液。將滅菌后的NA 培養(yǎng)基（20 mL）倒入培養(yǎng)皿（90 mm×15 mm）中，培養(yǎng)基凝固后，將直徑為6 mm，提前浸泡在待測液中取出風(fēng)干后的濾紙片置于已涂布200 μL 菌液的瓊脂板上，生理鹽水為陰性對照，甲硝唑為陽性對照。將培養(yǎng)皿置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑[16]。

1.2.4 UPLC-MS/MS 法鑒定云南沙棘黃酮提取物

1.2.4.1 色譜條件 色譜柱：Hyperil Gold（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；柱溫25 ℃；流動相：流動相A 為0.1%甲酸水溶液（v/v），流動相B 為甲醇；梯度洗脫程序：0～1 min，2% B；1～9 min，2%～98% B；9～12 min，98% B；12～12.1 min，98%～2% B；12.1～15 min，2% B。流速0.3 mL/min；進樣量10 μL。

1.2.4.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI），負(fù)離子模式掃描；毛細(xì)管電壓為3800 V；氣體溫度為350 ℃；毛細(xì)管溫度為320 ℃；輔助氣為10 arb；碰撞能量為20、40 和60 V；一級掃描分辨率為70000，二級掃描分辨率為17500；質(zhì)譜掃描范圍為m/z 70～1000。

1.2.5 黃酮類成分的含量測定

1.2.5.1 HPLC 條件 色譜柱：Curosil-PFP（250 mm×4.6 mm，5 μm）反向色譜柱；柱溫：30 ℃；流動相A和B 分別為0.03%（v/v）甲酸的水溶液和甲醇；梯度洗脫條件：0 min，30% B；10 min，50% B；20 min，70% B；25 min，75% B；28 min，30% B；紫外檢測波長：370 nm；流速：1 mL/min；進樣量：20 μL[17]。

1.2.5.2 樣品含量測定 精確稱取Is-3-G-7-Rh、Qu-3-R、Is-3-G，用甲醇溶解，配成適量濃度范圍內(nèi)的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，精密吸取不同濃度梯度對照品溶液20 μL，根據(jù)色譜條件進樣測定峰面積，計算含量。以質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，根據(jù)如下公式建立標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線。

式中：a 為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率，b 為標(biāo)準(zhǔn)曲線截距。

準(zhǔn)確稱取純化后的黃酮提取物10 mg，加入10 mL 甲醇溶解配制成1 mg/mL 樣品溶液，將溶液用0.22 μm 微孔濾膜過濾，作為待測液。精密吸取20 μL 待測液進樣測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算含量[18]。

1.2.6 MIC 的測定 用二倍稀釋法[19]測定云南沙棘總黃酮及單一黃酮樣品對4 種供試菌的最低抑制濃度。將純化后的沙棘總黃酮樣品溶解在DMSO 中，0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌，用無菌生理鹽水將母液依次稀釋成質(zhì)量濃度為1000、500、250、125、62.5、31.25、15.63 μg/mL 的總黃酮樣品溶液。將4 種供試菌懸浮液（1×108CFU/mL，100 μL）分別添加到96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。然后依次添加不同濃度的總黃酮樣品溶液100 μL。將培養(yǎng)板放置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。使用酶標(biāo)儀測量每個孔在600 nm 處的吸光度，MIC 定義為最后一個孔中未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌生長的樣品濃度[20]。使用相同的方法測定3 種單一黃酮成分的MIC，3 種成分的濃度梯度為500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.81 μg/mL。

1.2.7 細(xì)胞外蛋白含量的測定 采用考馬斯亮藍(lán)法[21]將濃度為MIC 的總黃酮和單一黃酮溶液分別作用到大腸桿菌懸浮液（1×108CFU/mL）中，培養(yǎng)4 h 后離心（5000 r/min，6 min）取上清液，測量上清液在595 nm 處吸光度，以此來檢測上清液中的蛋白含量，每隔4 h 檢測一次，記錄處理后的24 h 內(nèi)菌液中的蛋白含量變化。

1.3 數(shù)據(jù)處理

上述實驗均重復(fù)3 次，實驗數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 26 軟件進行分析處理，實驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；采用origin 2019 b 軟件進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌圈測定結(jié)果

紙片法測定云南沙棘果實總黃酮對供試菌種的抑制效果見表1 和圖1。由表1 可知，沙棘果實黃酮提取物對4 種供試菌的抑菌圈直徑均在8 mm 以上。總黃酮對枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑達(dá)到10.56±0.42 mm，顯著大于其他3 個菌種的抑菌圈直徑（P<0.05），對白色念珠菌的抑制效果次之（9.02±0.96 mm），對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制效果較弱，抑菌圈直徑分別為8.36±0.36 mm 和8.43±0.53 mm。結(jié)果表明，云南沙棘果實黃酮提取物對4 種供試菌均有一定抑菌活性，且對不同供試菌的抑制效果不同。由提取物中總黃酮為大量成分，參考相關(guān)文獻(xiàn)的研究結(jié)果[22?23]，推測黃酮類成分可能是其抑菌作用的主要活性成分。

圖1 總黃酮對4 種供試菌的抑菌效果Fig.1 Bacteriostatic effect of total flavonoids against four tested microorganisms

表1 總黃酮對4 種供試菌的抑菌圈直徑（n=3）Table 1 Diameter of inhibition zone of total flavonoids against four tested microorganisms (n=3)

2.2 UPLC-MS/MS 分析結(jié)果

使用UPLC-MS/MS 對云南沙棘果實黃酮提取物進行了分析，負(fù)離子流圖如圖2，根據(jù)保留時間、相對分子質(zhì)量、分子離子峰、二級質(zhì)譜圖碎片離子峰，利用mzCloud 數(shù)據(jù)庫并參考文獻(xiàn)[24?26]鑒定出12 種黃酮類成分，時間分布范圍為5.14～7.39 min，結(jié)果見表2。云南沙棘中的黃酮類化合物主要是以異鼠李素、山奈酚和槲皮素為苷元和糖結(jié)合形成的黃酮醇苷類物質(zhì)，這與王婉寧[27]所得結(jié)論一致。

圖2 負(fù)離子模式下沙棘黃酮總離子流圖Fig.2 Total ion chromatogram of sea buckthorn flavonoids in negative ion mode

表2 沙棘果實中黃酮類化合物的UPLC-MS/MS 鑒定結(jié)果Table 2 Identified flavonoid compounds in sea buckthorn berries by UPLC-MS/MS

參考樊輕亞等[28]的方法根據(jù)峰強度選取3 種含量最高的黃酮類成分：Is-3-G-7-Rh（5.87 min）、Qu-3-R（5.92 min）、Is-3-G（6.33 min），利用高效液相色譜對其進行定量檢測。

2.3 黃酮含量測定結(jié)果

利用HPLC 對云南沙棘果實總黃酮中3 種主要黃酮類成分進行了定量分析，液相色譜圖如圖3 所示，峰1～峰3 分別為Is-3-G-7-Rh、Qu-3-R、Is-3-G。Is-3-G-7-Rh 質(zhì)量濃度在10～50 mg/L 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，回歸方程Y=5.3226X?4.9282（R2=0.9992），Qu-3-R 質(zhì)量濃度在3～36 mg/L 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，回歸方程Y=10.98X+2.8071（R2=0.9996），Is-3-G 質(zhì)量濃度在6～27 mg/L 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，回歸方程Y=16.769X?9.2253（R2=0.9991）。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)品（A）和樣品（B）液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of flavonoids standards (A) and sea buckthorn flavonoids (B)

沙棘果實總黃酮中，Is-3-G-7-Rh 的含量為38.43±0.85 mg/g，Qu-3-R 含量為29.44±0.42 mg/g，Is-3-G含量為21.11±0.55 mg/g。Ma 等[29]的研究發(fā)現(xiàn)，‘Pertsik’沙棘（Finland）中含量最高的黃酮類化合物為Is-3-G-7-Rh，這與本文的檢測結(jié)果是一致的。而‘Vitaminaya ’ 沙 棘（Canada）中 Is-3-G-7-Rh（3.9±0.6 mg/100 g 鮮果）的含量要低于Is-3-G（5.8±0.7 mg/100 g 鮮果），不同的研究結(jié)果表明不同產(chǎn)地沙棘中的黃酮類成分含量是不同的，造成這種現(xiàn)象的原因可能是氣候、地理等因素[30]。

2.4 MIC 的測定結(jié)果

沙棘總黃酮和3 種主要黃酮類成分進行了4 種供試菌的MIC 測定，結(jié)果見表3。結(jié)果表明單一黃酮類成分對4 種供試菌的抑制效果普遍高于沙棘總黃酮。Is-3-G 和Is-3-G-7-Rh 對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌表現(xiàn)出比Qu-3-R 更優(yōu)秀的抑制效果，對金黃色葡萄球菌的MIC 值均為62.5 μg/mL，對大腸桿菌的MIC 值更是達(dá)到了31.25 μg/mL，推測二者是沙棘果實總黃酮中發(fā)揮抗菌作用的主要物質(zhì)。

表3 黃酮類化合物對4 種供試菌的MIC（n=3）Table 3 MIC of flavonoids against four tested microorganisms (n=3)

Qu-3-R 對大腸桿菌和白色念珠菌的MIC 均為125 μg/mL。Gutierrez-Venegas 等[31]研究發(fā)現(xiàn)一定濃度的Qu-3-R 溶液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長都起到了抑制作用，并且對于這兩種細(xì)菌的抑制效果要明顯優(yōu)于柚皮苷等其他黃酮類化合物，這為Qu-3-R 作為替代抗生素的天然抑菌劑來對抗這些細(xì)菌提供了重要支持。對于白色念珠菌，總黃酮和Is-3-G 和Is-3-G-7-Rh 的MIC 值普遍高于其他幾種細(xì)菌，總黃酮的MIC 值更是達(dá)到500 μg/mL，說明白色念珠菌對黃酮類化合物不敏感，所以將沙棘果實中提取的黃酮類化合物用作白色念珠菌抑菌劑還需考究。此外，Janeczko 等[32]發(fā)現(xiàn)有些黃酮類化合物可以通過相互作用來達(dá)到更佳的抑菌效果。本研究中總黃酮和Qu-3-R 對于金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的MIC 值相同，Is-3-G 和Is-3-G-7-Rh 對兩種菌的MIC 值要低于總黃酮，總黃酮并未表現(xiàn)出更佳的抑制效果，所以Qu-3-R、Is-3-G 和Is-3-G-7-Rh 是否具有協(xié)同抑菌作用有待考究。

2.5 細(xì)胞外蛋白含量測定結(jié)果

將濃度為MIC 的總黃酮和單一黃酮樣品作用于大腸桿菌，測量24 h 內(nèi)大腸桿菌的蛋白釋放量，結(jié)果見圖4。隨著時間延長，Is-3-G 和Is-3-G-7-Rh 作用的菌液中蛋白含量要明顯高于總黃酮和Qu-3-R作用的菌液。當(dāng)時間達(dá)到24 h，Is-3-G 和Is-3-G-7-Rh 作用的菌液中蛋白含量分別達(dá)到了37.55±1.24 μg/mL 和34.41±0.76 μg/mL，而總黃酮和Qu-3-R作用的菌液中蛋白質(zhì)含量分別為24.29±0.93 μg/mL和26.15±0.64 μg/mL，并且增加趨勢變緩，這與MIC的測定結(jié)果一致。推測沙棘黃酮類化合物可能是通過破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，使細(xì)菌內(nèi)的物質(zhì)流出導(dǎo)致的細(xì)菌死亡[33]，而黃酮類成分如何破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)導(dǎo)致蛋白流出，有待更深層次的研究。

圖4 胞外蛋白濃度曲線Fig.4 Extracellular protein concentration curves

3 結(jié)論

通過UPLC-MS/MS 技術(shù)對云南沙棘果實總黃酮進行了成分分析，共鑒定出了12 種黃酮類化合物，并利用HPLC 法測定3 種主要黃酮類化合物含量分別為Is-3-G-7-Rh：38.43±0.85 mg/g、Qu-3-R：29.44±0.42 mg/g、Is-3-G：21.11±0.55 mg/g。沙棘果實總黃酮及3 種主要黃酮類成分對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌4 種常見致病菌均有一定抑制作用，單一黃酮類成分的抑制效果均優(yōu)于總黃酮，尤其是Is-3-G-7-Rh 和Is-3-G 對4 種細(xì)菌的抑制作用最強，Qu-3-R 對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑制效果和沙棘總黃酮相同，由體外蛋白流出曲線推測黃酮類成分可能通過破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)使胞內(nèi)蛋白流出導(dǎo)致菌體死亡。