謝丹，吳 成，畢遠(yuǎn)林，胡建鋒，黃 魏，胡 峰，馮小兵，程平言

（貴州習(xí)酒股份有限公司，貴州習(xí)水 564622）

“酒乃曲之骨”，醬香型白酒發(fā)酵過(guò)程中的微生物主要源于高溫大曲[1]，大曲是一種富含多酶多菌的微生物發(fā)酵劑，具有“糖化、發(fā)酵、生香”等功能，是白酒發(fā)酵過(guò)程的重要物質(zhì)保障，其品質(zhì)的好壞決定了醬香型白酒的產(chǎn)量和質(zhì)量[2?5]。

醬香型高溫大曲采用生料制曲、添加母曲自然接種、經(jīng)40 d 發(fā)酵逐漸形成了以細(xì)菌、霉菌和酵母菌為主的群落結(jié)構(gòu)[6]。醬香型高溫大曲制作完成后，需進(jìn)行拆曲入庫(kù)儲(chǔ)存，使大曲進(jìn)入“后熟”階段。合理的儲(chǔ)存期對(duì)醬香型白酒釀造有至關(guān)重要的作用。在大曲儲(chǔ)存的理化特性研究方面，張麗等[7]研究結(jié)果表明高溫大曲儲(chǔ)存5～6 個(gè)月時(shí)，液化力、酯化力等理化特性趨于穩(wěn)定；劉建文等[8]發(fā)現(xiàn)儲(chǔ)存3～4 個(gè)月的大曲，其功能酶活力均達(dá)到最好狀態(tài)。在微生物多樣性研究方面，粱麗文等[9]研究結(jié)果表明高溫大曲存儲(chǔ)過(guò)程中主要優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為Bacillus，真菌屬為Pichia；梁晨等[10]研究發(fā)現(xiàn)大曲貯存4～6 個(gè)月，更有利于白酒的釀造，且Thermoactinomyces、Bacillus等是大曲儲(chǔ)存過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，未對(duì)真菌多樣性進(jìn)行相關(guān)研究。陳曉茹等[11]研究表明強(qiáng)化曲在貯存過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌屬是Bacillus、常規(guī)曲的優(yōu)勢(shì)菌屬為Weissella。目前，對(duì)醬香型白酒釀造過(guò)程中的微生態(tài)結(jié)構(gòu)分析方法主要是傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法，但該方法耗時(shí)長(zhǎng)，準(zhǔn)確性較低，且具有一定的局限性，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的認(rèn)識(shí)，但是傳統(tǒng)的可培養(yǎng)方法在微生物檢測(cè)上的作用是無(wú)法替代的。然而隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，能快速精確地揭示微生物種類(lèi)的多樣性，鑒定樣本中微生物群落組成的能力，可檢測(cè)到未發(fā)現(xiàn)的微生物，更加全面地了解系統(tǒng)中的微生物，客觀地認(rèn)識(shí)微生物的群落結(jié)構(gòu)及其演替變化。對(duì)于高溫大曲“后熟”質(zhì)量的評(píng)價(jià)主要依靠感官和理化指標(biāo)，且在儲(chǔ)存過(guò)程其影響因素有待于進(jìn)一步闡明。在實(shí)際生產(chǎn)中，大曲是否成熟主要依靠生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)判斷，存在著盲目性和不確定性。

因此，本文以“后熟”過(guò)程的醬香型白酒高溫大曲為研究對(duì)象，同時(shí)采用傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法和高通量測(cè)序技術(shù)解析細(xì)菌和真菌群落組成，并結(jié)合高溫大曲中各理化因子動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，分析微生物群落和理化指標(biāo)間的相互作用關(guān)系，以期為闡明醬香型白酒高溫大曲“后熟”過(guò)程各因素變化機(jī)理提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

高溫大曲樣品采集自GZXJ 制曲車(chē)間不同儲(chǔ)存時(shí)間成品曲。孟加拉紅培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；WL 培養(yǎng)基 上海博微生物科技有限公司；DNA 提取試劑盒 美國(guó)OMEGA BioTek 公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引物 上海翌圣生物科技股份有限公司。

SW-CJ-2F 無(wú)菌操作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；ZQPW-70 全溫振蕩培養(yǎng)箱 天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；KG-AP32L 自動(dòng)蒸汽滅菌器 日本ALP 公司；GL-88B 漩渦混合器 海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司；TND03-H-H 混勻型干式恒溫器 深圳托能達(dá)科技有限公司；ETC811 PCR 儀 北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；DYCZ-21 電泳儀北京市六一儀器廠；FR-1000 凝膠成像系統(tǒng) 上海復(fù)日科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集 選取GZXJ 公司制曲車(chē)間某一儲(chǔ)存曲庫(kù)，在儲(chǔ)存過(guò)程中進(jìn)行定點(diǎn)跟蹤取樣，每隔1 月取1 次，共計(jì)6 個(gè)樣品。樣品磨碎后置于無(wú)菌密封袋中，于?20 ℃下低溫保藏，按取樣時(shí)間依次標(biāo)記為GX-1（0 d）、GX-2（30 d）、GX-3（60 d）、GX-4（90 d）、GX-5（120 d）、GX-6（150 d）。

1.2.2 理化指標(biāo)的測(cè)定 溫度、水分、酸度、糖化力、液化力的測(cè)定具體參照QB/T 4257-2011《釀酒大曲通用分析方法》[12]。

1.2.3 可培養(yǎng)微生物的分離保藏、計(jì)數(shù)及鑒定 a.分離及保藏：稱(chēng)取10 g 樣品于90 mL 無(wú)菌水中，于25 ℃、180 r/min 條件下振蕩30 min，吸取1 mL 懸浮液稀釋備用，分別采用營(yíng)養(yǎng)瓊脂、WL 培養(yǎng)基和孟加拉紅培養(yǎng)基分離篩選細(xì)菌、酵母菌和霉菌，觀察菌落在培養(yǎng)基上的形態(tài)。細(xì)菌和酵母菌采用?80 ℃甘油保藏，絲狀真菌采用4 ℃斜面保藏，每株菌株平行保藏3 管。

b.計(jì)數(shù)：采用稀釋涂布的方法，分別采用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基于37 ℃條件下培養(yǎng)細(xì)菌；WL 培養(yǎng)基和孟加拉紅培養(yǎng)基于28 ℃條件下培養(yǎng)酵母菌和絲狀真菌培養(yǎng)結(jié)束后，用計(jì)數(shù)器對(duì)肉眼觀察的單菌落計(jì)數(shù)，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。

c.鑒定：根據(jù)菌落形態(tài)特征進(jìn)行初步分類(lèi)后，每種類(lèi)別挑選代表性菌株1～3 株[13]。分別采用Ezup柱式基因組DNA 試劑盒對(duì)菌株DNA 進(jìn)行提取，具體操作流程見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。參照吳成等[14]方法，細(xì)菌采用通用引物27F（AGTTTGATCMTGGCTC AG）和 1492R（GGTTACCTTGTTACGACTT）對(duì)16S rRNA 基因擴(kuò)增測(cè)序；酵母菌采用通用引物NL1（GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG）和 NL4（GGTCCGTGTTTCAAGACGG）對(duì)26S rRNA 基因D1/D2 片段擴(kuò)增測(cè)序；絲狀真菌采用通用引物ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）和ITS4（TCCTCCG CTTATTGATATGC）對(duì)內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1 和2 片段擴(kuò)增測(cè)序。

PCR 反應(yīng)體系為：模板DNA 0.5 μL，10×Buffer（with Mg2+）2.5 μL，dNTP2.5 μL，Taq 酶0.2 μL，正向及反向引物各0.5 μL，使用ddH2O 補(bǔ)齊體系至25 μL。PCR 擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性45 s；55 ℃退火45 s；72 ℃延伸1 min；30 次循環(huán)；72 ℃終延伸10 min 降至4 ℃。擴(kuò)增完成后，回收PCR 產(chǎn)物并純化。

1.2.4 大曲總DNA 提取及擴(kuò)增 總DNA 提取：按照DNA 試劑盒E.Z.N.A? Mag-Bind Soil DNA Kit 提取試劑盒方法提取DNA。細(xì)菌16S V3～V4 區(qū)域片段，選擇341F（5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'）和805R（5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3'）為擴(kuò)增引物；真菌采用ITS3（GCATCGATGAAGAAC GCAGC）和ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）為擴(kuò)增引物。

PCR 擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性20 s；55 ℃退火20 s；72 ℃延伸30 s；25 次循環(huán)；72 ℃終延伸5 min 降至4 ℃。PCR 反應(yīng)體系為：2×Hieff? Robust PCR Master Mix 15 μL，正向及反向引物各1 μL，DNA 模板20～30 ng，使用ddH2O 補(bǔ)齊體系至30 μL。

1.2.5 高通量測(cè)序 采用Illumina Miseq 測(cè)序平臺(tái)，分別對(duì)細(xì)菌16S rRNA 基因 V3～V4 區(qū)、真菌ITS3～I(xiàn)TS4 區(qū)進(jìn)行高通量測(cè)序分析（由上海生物工程有限公司完成）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用UNITE 為參考數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種注釋?zhuān)赟ilva 庫(kù)對(duì)97%相似水平的OTU 代表序列進(jìn)行分類(lèi)學(xué)注釋分析，細(xì)菌和真菌分別采用RDP 和UNITE數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。采用Microsoft Office Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和處理；理化因子動(dòng)態(tài)圖、可培養(yǎng)微生物動(dòng)態(tài)圖和物種相對(duì)豐度柱狀圖采用Origin 2017軟件進(jìn)行處理繪制；優(yōu)勢(shì)微生物和理化因子之間相關(guān)性熱圖先利用SPSS 22.0 軟件計(jì)算Spearman 相關(guān)性系數(shù)，再使用OmicShare Tools 平臺(tái)繪制組間動(dòng)態(tài)相關(guān)性熱圖；動(dòng)態(tài)豐度Venn 圖使用micShare Tools平臺(tái)繪制；冗余分析（Redundancy analysis，RDA）采用Canoco5.0 軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 儲(chǔ)存過(guò)程中理化指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化

大曲中的水分、酸度、液化力、糖化力等是評(píng)價(jià)大曲品質(zhì)好壞常用的理化指標(biāo)。由圖1 可知，隨著儲(chǔ)存時(shí)間的變化，儲(chǔ)存?zhèn)}溫度先上升后下降，曲坯的水分、酸度逐漸下降，糖化力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，液化力在（0.02±0.01）～（0.04±0.02）g/g·h 之間波動(dòng)。微生物可以利用大曲中淀粉、脂肪以及蛋白質(zhì)降解成小分子進(jìn)而代謝產(chǎn)酸，隨著儲(chǔ)存過(guò)程中曲坯水分逐漸揮發(fā)，微生物的生長(zhǎng)繁殖受到影響，導(dǎo)致酸度下降。有研究表明，大曲的酸度主要來(lái)源于生酸微生物降解蛋白質(zhì)、脂肪、淀粉等物質(zhì)和有機(jī)酸代謝產(chǎn)酸，是微生物綜合作用的結(jié)果[15～17]。大曲的糖化力受工藝控制參數(shù)的影響，并且與產(chǎn)品風(fēng)格密切相關(guān)[18]。由圖1 可知，隨著儲(chǔ)存時(shí)間的變化，糖化力先升高后下降，在儲(chǔ)存120 d（GX-5）時(shí)達(dá)最高，為248.97±0.02 mg/g·h。大曲的液化力反映大曲中液化型淀粉酶將淀粉水解為糊精的能力，主要是由霉菌和枯草芽孢桿菌產(chǎn)生[19]。

圖1 理化指標(biāo)的變化規(guī)律Fig.1 Variation law of physical and chemical indexes

2.2 可培養(yǎng)微生物的動(dòng)態(tài)變化

采用稀釋涂布平板法對(duì)儲(chǔ)存0～150 d 的可培養(yǎng)微生物進(jìn)行計(jì)數(shù)、分離，其結(jié)果分別表1、圖2 所示。

表1 可培養(yǎng)微生物菌落總數(shù)變化Table 1 Changes in the total number of culturable microorganisms

圖2 可培養(yǎng)方法分離篩選微生物形態(tài)特征Fig.2 Microbial characteristics revealed by culture-dependent approaches

由表1 可知，大曲初入儲(chǔ)存?zhèn)}時(shí)，細(xì)菌和霉菌均在104CFU/g 數(shù)量級(jí)，酵母菌在105CFU/g 數(shù)量級(jí)；大曲儲(chǔ)存到60 d（GX-3）時(shí)，可培養(yǎng)微生物數(shù)量最高，90 d（GX-4）時(shí)可培養(yǎng)微生物的數(shù)量緩慢下降。分析可能原因是在大曲初入曲房時(shí)，儲(chǔ)存?zhèn)}溫度較低，隨著儲(chǔ)存時(shí)間增加，曲房溫度升高，此階段大多數(shù)的芽孢細(xì)菌在此時(shí)形成芽孢，有利于微生物生長(zhǎng)繁殖。后期隨著儲(chǔ)存時(shí)間的變化，曲坯的水分降低，儲(chǔ)存?zhèn)}溫度下降，微生物數(shù)量緩慢下降。大曲在儲(chǔ)存過(guò)程中受成品曲倉(cāng)、曲坯內(nèi)部溫度、水分、酸度等參數(shù)的影響，同時(shí)也受曲坯內(nèi)部微生物生態(tài)結(jié)構(gòu)變化的調(diào)控，儲(chǔ)存過(guò)程中存在著一個(gè)雙向調(diào)控機(jī)制[20?21]。

本研究采用稀釋涂布平板法分離篩選到15 株細(xì)菌、6 株酵母菌和12 株霉菌，共保藏菌株99 株。選擇代表性菌株進(jìn)行分子鑒定為B.licheniformis、B.amyloliquifaciens、S.gallinarum三種細(xì)菌（a～c）；T.ciferrii、M.farinosa、S.cerevisiae三種酵母菌（d～f）；L.ramosa、A.sydowii、A.chevalieri（g～i）三種霉菌，其形態(tài)特征如圖2 所示。相關(guān)研究表明，高溫大曲中分離出的優(yōu)勢(shì)菌種也具有一定的相似性，王曉丹等[22]研究表明茅臺(tái)地區(qū)醬香型高溫大曲中的主要優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為Bacillus；張立強(qiáng)等[23]從瀘州老窖大曲中分離出高產(chǎn)纖溶酶的優(yōu)勢(shì)菌B.licheniformis：李子鍵等[24]從中高溫大曲中分離出耐高溫的微小根毛霉、布氏橫梗霉，并且分別具有產(chǎn)糖化酶、蛋白酶活性功能。

2.3 大曲在不同儲(chǔ)存時(shí)間免培養(yǎng)微生物的變化情況

2.3.1 Alpha 多樣性指數(shù)分析 樣品測(cè)序完成后，得到的原始序列經(jīng)去除嵌合體、過(guò)濾等處理后共得到498207 條有效序列，其中細(xì)菌202228 條、真菌295979 條。細(xì)菌和真菌測(cè)序覆蓋率都為0.99 以上，表明測(cè)序深度足夠，樣品中幾乎所有樣本都被檢出，測(cè)序結(jié)果可真實(shí)反映出醬香型高溫大曲在儲(chǔ)存過(guò)程中細(xì)菌和真菌群落多樣性組成情況。對(duì)于細(xì)菌而言，Shannon 指數(shù)呈先升后降，Simpson 指數(shù)先降低后趨于平穩(wěn)，表明大曲群落多樣性在儲(chǔ)存60 d（GX-3）、90 d（GX-4）、120 d（GX-5）時(shí)最高；對(duì)于真菌而言，Shannon 指數(shù)呈緩慢下降趨勢(shì)，Simpson 指數(shù)呈逐漸升高趨勢(shì)，表明隨著大曲儲(chǔ)存時(shí)間延長(zhǎng)，真菌群落多樣性逐漸降低（表2）。

表2 不同儲(chǔ)存時(shí)間真菌和細(xì)菌Alpha 多樣性Table 2 Alpha diversity of fungi and bacteria at different storage times

2.3.2 OTU 分布的Venn 圖 Venn 圖可以用來(lái)統(tǒng)計(jì)樣本中共有和獨(dú)有的OTU 的數(shù)目，直觀地展現(xiàn)樣品OTU 數(shù)目組成的相似性及重疊情況[25]。如圖3（a）所示，樣品GX-1（0 d）到GX-6（150 d）獨(dú)有的OTU數(shù)目依次為7、8、6、23、8 和14，其中GX-4（90 d）樣本中獨(dú)有的物種數(shù)所占比例高，那么樣本之間的相似性差，該樣本的獨(dú)特性高；6 個(gè)樣品共有的 OTU為11 個(gè)，其所代表的細(xì)菌物種長(zhǎng)期存在于儲(chǔ)藏期內(nèi)。圖3（b）所示，樣品GX-1（0 d）到GX-6（150 d）獨(dú)有的OTU 數(shù)目依次為3、1、2、11、5 和47，共有的OTU 為7 個(gè)，其中GX-6 樣本獨(dú)有的物種數(shù)所占比例高，獨(dú)特性高，GX-1～GX-5（0～120 d）與共有樣本的數(shù)量接近，說(shuō)明共有物種的占比高，因此樣本的相似性就高。

圖3 不同樣品的細(xì)菌（a）、真菌（b）OTU Venn 圖Fig.3 Venn profile of OTU of bacteria (a) and fungi (b) in different samples

2.3.3 不同儲(chǔ)存時(shí)間細(xì)菌、真菌群落動(dòng)態(tài)變化 樣品經(jīng)高通量測(cè)序后，細(xì)菌共檢出12 個(gè)門(mén)、21 個(gè)綱、43 個(gè)目、80 個(gè)科、119 個(gè)屬和179 個(gè)種，其中Firmicutes 為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)，儲(chǔ)存過(guò)程中平均占比71.69%；Kroppenstedtia（平均占比30.45%）、Lactobacillus（平均占比11.53%）、Staphylococcus（平均占比10.31%）為主要優(yōu)勢(shì)菌屬。真菌共檢5 個(gè)門(mén)、17 個(gè)綱、37 個(gè)目、89 個(gè)科、142 個(gè)屬和203 個(gè)種，其中Ascomycota 為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)真菌門(mén)，平均占比98.11%，Thermomyces（43.87%）、Trichomonascus（29.77%）為主要優(yōu)勢(shì)真菌屬。圖4、圖5 分別為平均相對(duì)豐度至少在一個(gè)大曲樣品中大于1%的菌群結(jié)構(gòu)。

圖4 大曲在門(mén)水平上細(xì)菌（a）、真菌（b）組成情況Fig.4 Composition of bacteria (a) and fungi (b) in hightemperature Daqu at the phylum

圖5 大曲在屬水平上細(xì)菌（a）、真菌（b）組成情況Fig.5 Composition of bacteria (a) and fungi (b) in hightemperature Daqu at the genus

由圖5 可知，Lactobacillus、Lactococcus、Saccharopolyspora、Virgibacillus細(xì)菌屬和Thermomyces、Trichomonascus、Aspergillus真菌屬物種多樣性呈現(xiàn)先增后降，在儲(chǔ)存到120 d（GX-5）以后，優(yōu)勢(shì)菌群的相對(duì)豐度含量逐漸下降。分析造成這種現(xiàn)象可能的原因是儲(chǔ)存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的曲塊，曲蟲(chóng)增多，使大曲中的淀粉等物質(zhì)流失，破壞大曲的微生物群落結(jié)構(gòu)，因而導(dǎo)致微生物多樣性降低[26]。

醬香制曲過(guò)程中的細(xì)菌主要來(lái)源于空氣、場(chǎng)地、原輔料及人體，在醬香型白酒釀造過(guò)程中的主要作用是產(chǎn)香，在發(fā)酵體系中能產(chǎn)生大量酶類(lèi)，是形成醬香型白酒風(fēng)味前體物質(zhì)的主要菌群[27?28]。相關(guān)研究表明，Bacillus是醬香型白酒發(fā)酵過(guò)程中主要的功能細(xì)菌種群，具有代謝水解酶、乙偶姻等風(fēng)味物質(zhì)功能，對(duì)醬香型白酒的風(fēng)味形成有重要貢獻(xiàn)[29?30]；Lactobacillus屬于乳酸菌菌系，大多是兼性厭氧或厭氧菌，在發(fā)酵過(guò)程具有重要的生物學(xué)調(diào)控作用[31]。真菌方面，釀酒酵母是產(chǎn)生酒精的主要功能菌種，曲霉菌和根霉菌具有很強(qiáng)的酶活力，且絕大多數(shù)的真菌屬于嗜熱真菌屬，可以在高溫下進(jìn)行生長(zhǎng)代謝，產(chǎn)酶豐富，具有分解酒醅中大分子物質(zhì)、產(chǎn)生白酒中風(fēng)味化合物及其前提物質(zhì)的作用[32]。

2.3.4 理化因子與微生物群落相關(guān)性分析 理化因子的變化對(duì)微生物的生長(zhǎng)繁殖及其行為具有較強(qiáng)的影響，進(jìn)而調(diào)控微生物群落的結(jié)構(gòu)及其演替[21]。如圖6（a）所示，RDA 分析結(jié)果表明大曲在儲(chǔ)存0 d（GX-1）時(shí)，大曲的后熟過(guò)程與溫度、水分、液化力和酸度呈正相關(guān)關(guān)系，與糖化力呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，表明該時(shí)期溫度和水分適宜，比較適合微生物生長(zhǎng)；儲(chǔ)存30～60 d（GX-2～GX-3）時(shí)，大曲中的微生物群落結(jié)構(gòu)不受水分、酸度等因素的影響，表明該時(shí)間段理化指標(biāo)對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)影響不大；儲(chǔ)存90～150 d（GX-4～GX-6）時(shí)，溫度、水分、酸度、液化力與儲(chǔ)存過(guò)程呈負(fù)相關(guān)，表明了大曲在存儲(chǔ)后期，曲倉(cāng)溫度降低，曲坯水分含量低，不適宜微生物代謝活動(dòng)，因此，微生物多樣性降低。

圖6 微生物群落結(jié)構(gòu)與大曲理化因子相關(guān)性分析Fig.6 Correlation analysis between microble community structure and physical and chemical factors of Daqu

為揭示理化因子對(duì)優(yōu)勢(shì)微生物群落的影響，選取相對(duì)豐度分別排名前10 的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬、優(yōu)勢(shì)真菌屬（相對(duì)豐度含量至少在一個(gè)大曲樣品中大于1%的菌群結(jié)構(gòu)）與儲(chǔ)存過(guò)程中理化因子進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果如圖6（b）所示，對(duì)細(xì)菌而言，Bacillus與水分、酸度、糖化力、液化力呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，與溫度呈正相關(guān)關(guān)系，表明了該細(xì)菌屬的生長(zhǎng)代謝等活動(dòng)受溫度的影響，在大曲儲(chǔ)存后期，曲倉(cāng)溫度降低，其相對(duì)豐度含量降低，高酸的環(huán)境也會(huì)抑制其生長(zhǎng)。Staphylococcus與溫度、水分呈正相關(guān)關(guān)系、與酸度、糖化力、液化力呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；Kroppenstedtia與溫度、水分、酸度、液化力呈正相關(guān)關(guān)系，與糖化力呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

對(duì)真菌而言，Aspergillus、Trichomonascus等菌屬與水分、酸度、糖化力、液化力呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，與溫度呈正相關(guān)關(guān)系；Byssochlamys、Dipodascus與溫度、水分、酸度、液化力呈正相關(guān)關(guān)系，與糖化力呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；Thermomyces與溫度、水分、酸度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；Rhizomucor與水分、溫度、酸度、液化力呈正相關(guān)關(guān)系。研究表明Thermomyces屬于嗜熱真菌屬，具有促進(jìn)蛋白質(zhì)降解的作用，使得微生物能充分利用釀酒原料進(jìn)行生長(zhǎng)代謝[33]。Rhizomucor具有糖化發(fā)酵能力，能形成大量乳酸[34]。Aspergillus、Thermomyces、Bacillus、Issatchenkia、Lactococcus等是大曲儲(chǔ)存過(guò)程中的主導(dǎo)菌群，這些菌群的存在有利于提升大曲的發(fā)酵性能[35]。

3 結(jié)論

本文同時(shí)采用了傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法和高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)醬香型白酒高溫大曲在儲(chǔ)存（后熟）過(guò)程中微生物群落組成情況及理化因子間的相互關(guān)系進(jìn)行了解析?？膳囵B(yǎng)結(jié)果表明，隨著儲(chǔ)存時(shí)間的增加，菌落總數(shù)呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)；高通量測(cè)序結(jié)果表明，在儲(chǔ)存過(guò)程中Kroppenstedtia、Lactobacillus、Staphylococcus、Thermomyces、Trichomonascus等為主要優(yōu)勢(shì)菌屬；RDA 分析結(jié)果表明大曲在儲(chǔ)存0 d 時(shí)，大曲的后熟過(guò)程與溫度、水分、液化力和酸度呈正相關(guān)關(guān)系，與糖化力呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，表明該時(shí)期溫度和水分適宜，比較適合微生物生長(zhǎng)；儲(chǔ)存30～60 d 時(shí)，大曲中的微生物群落結(jié)構(gòu)不受水分、酸度等因素的影響，表明該時(shí)間段理化指標(biāo)對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)影響不大；儲(chǔ)存90～150 d 時(shí)，溫度、水分、酸度、液化力與儲(chǔ)存過(guò)程呈負(fù)相關(guān)，表明了大曲在存儲(chǔ)后期，曲倉(cāng)溫度降低，曲坯水分含量低，不適宜微生物代謝活動(dòng)，因此，微生物多樣性降低。目前，對(duì)于醬香型高溫大曲微生物多樣性相關(guān)研究層出不窮，在優(yōu)勢(shì)微生物研究方面結(jié)論基本一致，說(shuō)明了醬香型高溫大曲的微生物生態(tài)系統(tǒng)基本保持一致。儲(chǔ)存過(guò)程中微生物群落與理化因子存在復(fù)雜的作用關(guān)系，大曲在儲(chǔ)存過(guò)程中微生物群落的多樣性受溫度、水分和酸度等理化因子的影響，表明了儲(chǔ)存過(guò)程中各微生物、生化指標(biāo)間相互關(guān)聯(lián)，性質(zhì)上相互影響，使醬香型大曲在最佳的貯存期進(jìn)行釀造，從而達(dá)到良好的產(chǎn)酒、產(chǎn)香風(fēng)味。通過(guò)相關(guān)性計(jì)算可知微生物與環(huán)境因子之間的關(guān)系，目前主要是基于數(shù)學(xué)模型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，但其內(nèi)在的相互作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。理化因子在儲(chǔ)存過(guò)程中對(duì)微生物的生長(zhǎng)繁殖及其行為具有較強(qiáng)的影響，進(jìn)而調(diào)控微生物群落的結(jié)構(gòu)及其演替，但具體的影響過(guò)程還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。醬香型白酒高溫大曲“后熟”時(shí)間的長(zhǎng)短關(guān)系著大曲的品質(zhì)及產(chǎn)酒的質(zhì)量，但是目前沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)界定具體的儲(chǔ)存時(shí)間，因此，該研究為進(jìn)一步闡明醬香型白酒高溫大曲后熟機(jī)理提供了理論參考。