劉會，譚洪文，龐軍，張曙影

1 貴州省人民醫(yī)院心內(nèi)科，貴陽 550002；2 大連大學附屬中山醫(yī)院心內(nèi)科

近年來，急性心肌梗死的發(fā)病率及病死率呈逐年上升趨勢［1］。再灌注治療是急性心肌梗死最有效的治療手段，但再灌注可能會進一步加重心肌結(jié)構(gòu)損傷及功能障礙，削弱再灌注治療的臨床效果。缺血再灌注時細胞內(nèi)線粒體ATP敏感的鉀通道（mito-KATPC）關(guān)閉，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）開放，導致細胞凋亡及壞死［2-4］。研究顯示，急診再灌注治療前給予負荷劑量的阿托伐他汀可降低血清心肌壞死標志物水平，提示阿托伐他汀可減輕缺血再灌注損傷［5］。缺氧復氧模型是體外細胞水平研究缺血再灌溉損傷的理想模型，但目前關(guān)于阿托伐他汀減輕缺血再灌注損傷的具體機制是否與mitoKATPC和MPTP有關(guān)尚未可知。2020年3月—2022年2月，本研究觀察了阿托伐他汀預處理對缺氧復氧后乳鼠心肌細胞的保護作用，并探討其機制是否與mitoKATPC和MPTP有關(guān)?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物：SPF級新生C57BL/6乳鼠50只，出生3 d內(nèi)，體質(zhì)量9～13 g，由北京維通利華實驗動物有限公司提供，動物合格證書編號：SCXK（京）2006-009。主要試劑：DMEM-H培養(yǎng)基、高糖DMEM培養(yǎng)基、無糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清均購自美國Gibco公司，胰蛋白酶、青—鏈霉素溶液、鈣離子熒光探針（Fluo-3 AM）檢測試劑盒、MPTP檢測試劑盒、活性氧（ROS）檢測試劑盒均購自中國碧云天生物科技有限公司，小鼠來源α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）一抗、辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗小鼠二抗均購自美國Abcam公司，阿托伐他汀購自美國輝瑞制藥有限公司，mitoKATPC通道阻斷劑5-羥基葵酸、CCK-8試劑盒均購自美國Sigma公司，MPTP開放劑氯尼達明購自中國Aladdin生物科技有限公司，JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒購自中國Beyotime生物科技有限公司。

1.2 乳鼠心肌細胞獲取與原代培養(yǎng) 取新生C57BL/6小鼠50只，采用頸椎脫臼法處死，置于75%乙醇中浸泡消毒，開胸后取出心臟；留取心尖部位，快速置于預冷的PBS溶液漂洗3次，剔除周圍結(jié)締組織，置于無菌平皿中。盡量將心尖組織剪碎，加入適量0.125%胰酶，在37 ℃培養(yǎng)箱中，采用分次消化的方法消化8～10次，每次消化5 min，消化后取上清液。在上清液中加入等量含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，輕輕混勻。用200目細胞過濾篩過濾含細胞的混合液，取過濾后的細胞懸液，1 000 r/min離心5 min，收集沉淀，用含15%胎牛血清+1%青—鏈霉素的DMEM-H培養(yǎng)基進行重懸，調(diào)整細胞密度為2×105/mL。將細胞接種于細胞培養(yǎng)瓶中，在培養(yǎng)箱（37 ℃、5% CO2、95% O2）中培養(yǎng)90 min左右，將未貼壁的細胞懸液吸出，放入新的培養(yǎng)瓶中（加入0.1 mmol/mL BrdU以阻止成纖維細胞增殖）繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 乳鼠心肌細胞鑒定 ①乳鼠心肌細胞形態(tài)觀察：取“1.2”培養(yǎng)瓶中的乳鼠心肌細胞，顯微鏡下觀察心肌細胞生長形態(tài)及生長狀況。結(jié)果顯示，培養(yǎng)24 h后可見單個細胞的自發(fā)收縮，繼而逐漸鋪展伸出偽足，形成不規(guī)則的星形（OSID碼圖1A）；培養(yǎng)4 d，細胞相互接觸交織成網(wǎng)，形成細胞單層或細胞簇，收縮搏動規(guī)律有力（OSID碼圖1B）。②乳鼠心肌細胞α-SMA表達：采用免疫組化法。將“1.2”原代分離的心肌細胞接種于細胞爬片上，在培養(yǎng)箱（37 ℃、5% CO2、95% O2）中培養(yǎng)6 h，PBS漂洗2 min ×2次，4%多聚甲醛室溫下固定20 min，PBS漂洗2 min×2次；0.5% Triton X-100室溫下穿膜20 min，PBS漂洗2 min×3次，3% H2O2室溫下處理15 min，PBS漂洗后加入山羊血清室溫封閉60 min，加入小鼠來源的α-SMA一抗（稀釋比例1∶100），4 ℃孵育過夜，次日PBS漂洗5 min×3次；加入HRP標記的山羊抗小鼠二抗（稀釋比例1∶50），37 ℃孵育30 min，PBS漂洗5 min×3次；避光情況下加入DAB顯色1～10 min，蒸餾水漂洗5 min×2次，蘇木素復染5 min，自來水洗返藍，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察顯示，心肌細胞α-SMA抗原表達呈陽性，細胞質(zhì)被染成棕黃色（OSID碼圖2）。證實“1.2”分離培養(yǎng)的細胞為心肌細胞。

1.4 細胞分組與阿托伐他汀干預處理 將“1.3”鑒定后的乳鼠心肌細胞隨機分為五組，即control組、H/R組、Ator組、5-HD+Ator組和LND+Ator組。control組加入含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，在常規(guī)培養(yǎng)箱（37 ℃、5% CO2、95% O2）中培養(yǎng)。其余各組吸去細胞培養(yǎng)液后進行缺氧復氧處理，即更換為95%N2+5% CO2混合氣體飽和的無糖DMEM培養(yǎng)基，置于缺氧罐中（95%N2+5% CO2混合氣體飽和，37 ℃、O2＜1%）；缺氧培養(yǎng)12 h，取出培養(yǎng)板，更換高糖DMEM培養(yǎng)液，放回5% CO2培養(yǎng)箱（95%空氣+5%CO2）中繼續(xù)培養(yǎng)6 h。Ator組缺氧復氧前給予1 μmol/L阿托伐他汀預處理3 h；5-HD+Ator組缺氧復氧前給予100 μmol/L 5-羥基葵酸干預20 min，洗掉5-羥基葵酸后，給予1 μmol/L阿托伐他汀干預3 h；LND+Ator組缺氧復氧前給予1 μmol/L阿托伐他汀干預3 h、30 μmol/L 氯尼達明干預20 min，再洗掉氯尼達明。

1.5 心肌細胞存活能力觀察 采用CCK-8法。取心肌細胞制備細胞懸液，調(diào)整細胞密度為1×105/mL，分別接種于96孔板中，每孔100 μL，每組設(shè)3個復孔。將96孔板移入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h，按照1.4進行分組處理，每孔加入CCK-8溶液10 μL，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～4 h，嚴格按照CCK-8試劑盒說明書操作。使用酶標儀在450 nm波長下測定各組細胞的光密度（OD）值，同時設(shè)置空白孔、對照孔，計算細胞存活率。

1.6 細胞內(nèi)鈣離子濃度檢測 采用流式細胞術(shù)。取分組處理后的各組細胞，去除培養(yǎng)液，PBS漂洗3次，加入終濃度為5 μmol/L的Fluo-3 AM工作液，溶液量以能充分覆蓋細胞為準，在37 ℃條件下避光孵育40 min，進行熒光探針裝載。PBS漂洗細胞3次，使用PBS重懸細胞，制成密度為1×105/mL的細胞懸液，37 ℃避光孵育20 min。上流式細胞儀檢測各組細胞內(nèi)Fluo-3熒光強度，F(xiàn)luo-3熒光強度越大提示細胞內(nèi)鈣離子濃度越大。激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為525 nm。

1.7 細胞內(nèi)線粒體膜電位測定 采用流式細胞術(shù)。取分組處理后的各組細胞，加入胰酶消化，離心后棄上清，加入0.5 mL 含血清和酚紅的細胞培養(yǎng)液重懸，加入0.5 mL JC-1 染色工作液，顛倒數(shù)次混勻，細胞培養(yǎng)箱中37 ℃孵育20 min。離心后棄上清，加入1 mL JC-1 染色緩沖液重懸細胞，上流式細胞儀檢測紅綠熒光強度，計算紅綠熒光強度百分比，該值下降表示線粒體膜電位下降。檢測 JC-1 單體時，激發(fā)波長為490 nm、發(fā)射波長為530 nm；檢測JC-1 聚合物時，激發(fā)波長為525 nm、發(fā)射波長為590 nm。

1.8 細胞MPTP開放情況觀察 采用流式細胞術(shù)。取分組處理后的各組細胞，制成細胞懸液，離心后棄上清，PBS漂洗2次，離心后收集細胞沉淀。按照試劑盒說明書配制鈣黃綠素乙酰氧基甲酯（Calcein AM）染色液及熒光淬滅工作液。在各組細胞沉淀中加入200 μL熒光淬滅工作液，顛倒數(shù)次混勻，37 ℃細胞培養(yǎng)箱中孵育30 min，離心5 min后棄上清；加入200 μL Calcein AM染色液進行重懸，上流式細胞儀分析綠色熒光強度，以此表示心肌細胞MPTP開放情況；綠色熒光強度越大提示MPTP開放程度越低。使用僅含檢測緩沖液的細胞樣品用于陰性對照設(shè)置，Calcein AM的激發(fā)波長為494 nm、發(fā)射波長為517 nm。

1.9 細胞ROS含量檢測 采用流式細胞術(shù)。取分組處理后的各組細胞，制成細胞懸液，轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中，離心后棄上清，加入DMEM培養(yǎng)基，并用移液管將細胞吹打均勻，配制成密度為5×104/mL的細胞懸液。將細胞懸液接種到6孔板，每孔2.5 mL，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h。收集細胞后PBS漂洗2次，離心后收集細胞沉淀。每管加入終濃度為10 μmol/L的熒光探針2，7-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA）100 μL，37 ℃條件下孵育60 min，DMEM培養(yǎng)基漂洗3次，上流式細胞儀檢測細胞ROS含量，激發(fā)波長為485 nm、發(fā)射波長為525 nm。1.10 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料采用S-W正態(tài)性檢驗，呈正態(tài)分布以表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗，重復測量數(shù)據(jù)采用重復測量的方差分析；非正態(tài)分布以M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

與control組比較，H/R組、Ator組、5-HD+Ator組、LND+Ator組細胞存活率均降低、鈣離子濃度均升高，H/R組、5-HD+Ator組、LND+Ator組線粒體膜電位均降低、MPTP開放程度及ROS含量均升高（P均＜0.05）。與H/R組、5-HD+Ator組、LND+Ator組比較，Ator組細胞存活率、線粒體膜電位均升高，鈣離子濃度、MPTP開放程度及ROS含量均降低（P均＜0.05）。見表1及OSID碼圖3～6。

表1 各組細胞存活率、鈣離子濃度、線粒體膜電位、MPTP開放情況及ROS含量比較（）

表1 各組細胞存活率、鈣離子濃度、線粒體膜電位、MPTP開放情況及ROS含量比較（）

注：與control組比較，*P＜0.05；與H/R組比較，#P＜0.05；與Ator組比較，△P＜0.05。

組別細胞存活率（%）control組H/R組Ator組5-HD+Ator組LND+Ator組ROS（平均熒光強度）23 245.2 ± 82.5 29 861.3 ± 168.5*26 315.2 ± 359.9#33 350.2 ± 520.5*△35 255.9 ± 778.7*△100.0 ± 0.2 23.7 ± 1.5*32.4 ± 1.3*#23.8 ± 1.8*△28.8 ± 1.3*△鈣離子濃度（Fluo-3熒光強度）18 132.2 ± 1 047.2 33 362.1 ± 1 145.4*27 188.8 ± 1 034.2*#42 671.6 ± 1 124.5*△33 325.4 ± 1 043.8*△線粒體膜電位（紅綠熒光強度百分比，%）73.5 ± 0.8 59.5 ± 1.3*66.8 ± 1.4#58.1 ± 1.2*△59.5 ± 1.1*△MPTP開放情況（綠色熒光強度）147 397.4 ± 1 323.9 85 620.4 ± 1 087.8*128 700.5 ± 1 135.4#87 127.1 ± 1 072.8*△94 836.3 ± 1 132.4*△

3 討論

在心肌梗死及再灌注初期，心肌細胞發(fā)生壞死、凋亡，導致心肌細胞數(shù)量銳減，非梗死區(qū)心肌細胞間質(zhì)纖維化，心肌收縮力下降，從而引起心功能不全。再灌注治療可縮小心肌梗死面積，保護心肌組織，但再灌注也有可能會進一步加重心肌結(jié)構(gòu)及功能障礙，削弱再灌注治療的效果。因此，防止缺血再灌注損傷意義重大。研究表明，阿托伐他汀能夠明顯增強細胞抗氧化酶活性，抑制脂質(zhì)過氧化，可減少缺血再灌注損傷誘導的心肌細胞凋亡，從而減輕再灌注造成的損傷，具有較好的心肌保護作用［4］。本研究建立心肌細胞缺氧復氧模型，發(fā)現(xiàn)心肌細胞進行缺氧復氧處理后的細胞存活率降低，應用阿托伐他汀預處理后的細胞存活率升高，這提示阿托伐他汀預處理可減輕心肌細胞的缺氧復氧損傷；而加入mito-KATPC 阻斷劑5-羥基葵酸及MPTP開放劑氯尼達明進行干預后，阿托伐他汀的心肌保護作用被減弱，這也提示阿托伐他汀預處理減輕心肌細胞缺氧復氧損傷的機制可能與mitoKATPC和MPTP有關(guān)。

線粒體膜電位的變化與心肌缺血再灌注損傷有著密切的關(guān)系，線粒體膜電位下降是細胞凋亡早期的一個標志性事件。當細胞受到凋亡誘導后，線粒體膜電位變化使得膜的通透性發(fā)生改變［2-3］。在心肌缺血再灌注損傷過程中，線粒體mitoKATPC關(guān)閉，MPTP持續(xù)開放，導致線粒體腫脹、線粒體膜電位去極化、線粒體膜電位下降、ATP合成受阻及線粒體膜損傷，線粒體內(nèi)ROS經(jīng)由開放的MPTP大量進入細胞質(zhì)，激活和釋放各種凋亡蛋白，導致心肌細胞內(nèi)鈣離子增加，形成鈣超載，迅速引起心肌細胞死亡［5-6］。線粒體mitoKATPC的激活會造成鉀離子內(nèi)流，導致膜電位去極化，抑制細胞內(nèi)的鈣離子向線粒體內(nèi)流，防止線粒體內(nèi)鈣超載，同時有助于維持適宜的線粒體體積和能量代謝、調(diào)節(jié)自由基生成、減少細胞凋亡，最終減輕心肌缺血再灌注損傷［7］。國內(nèi)外研究表明，開放mitoKATPC和抑制MPTP開放可引起線粒體膜電位下降，減少線粒體腫脹、鈣超載和ROS生成，從而保護再灌注心肌［8-9］。mitoKATPC開放劑二氮嗪可效仿缺血預處理（IPC）的心肌保護效應［10］，而選擇性的mitoKATPC阻斷劑5-羥基葵酸和MPTP開放劑蒼術(shù)苷則會減弱IPC的心肌保護效應［11］。IPC通過多種信號途徑促進細胞內(nèi)mitoKATPC開放、關(guān)閉MPTP，從而減少細胞損傷、凋亡，是目前惟一有效防止缺血再灌注損傷的方法［12-13］。因此，mitoKATPC-MPTP軸被認為是防治心肌缺血再灌注損傷的重要通路。研究表明，p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）是mito-KATPC的上游調(diào)控因子，可促使mitoKATPC開放，從而保護心?。?4］。也有研究發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀通過激活mitoKATPC而減輕缺血再灌注損傷，從而減少無復流［15］。

Fluo-3 AM是一種可以穿透細胞膜的熒光染料，F(xiàn)luo-3 AM的熒光非常弱，其熒光不會隨鈣離子濃度升高而增強。Fluo-3 AM進入細胞后可以被細胞內(nèi)的酯酶剪切形成Fluo-3，從而被滯留在細胞內(nèi)。Fluo-3可以和鈣離子結(jié)合，結(jié)合鈣離子后可以產(chǎn)生較強的熒光。因此，F(xiàn)luo-3 AM被廣泛用于檢測細胞內(nèi)鈣離子濃度。在正常線粒體內(nèi)，JC-1聚集在線粒體基質(zhì)中形成聚合物，聚合物發(fā)出強烈的紅色熒光；不健康的線粒體由于膜電位下降或喪失，JC-1只能以單體的形式存在于細胞質(zhì)中，產(chǎn)生綠色熒光；因此，常用紅綠熒光強度百分比來衡量線粒體膜電位是否下降，線粒體膜電位下降時紅綠熒光強度百分比下降。JC-1 是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位的理想熒光探針。因此，我們使用Fluo-3 AM檢測鈣離子濃度，使用JC-1檢測細胞內(nèi)線粒體膜電位。本研究對細胞進行缺氧復氧處理后，心肌細胞內(nèi)鈣離子濃度、ROS含量、MPTP開放情況增加，線粒體膜電位下降；應用阿托伐他汀預處理后，心肌細胞內(nèi)鈣離子濃度、ROS含量、MPTP開放程度有所下降，線粒體膜電位升高；而應用mitoKATPC阻斷劑5-羥基葵酸及MPTP開放劑氯尼達明進行干預后，心肌細胞內(nèi)鈣離子濃度、ROS含量、MPTP開放程度增加，線粒體膜電位下降；以上結(jié)果提示，阿托伐他汀可通過開放mitoKATPC及關(guān)閉MPTP逆轉(zhuǎn)心肌細胞缺氧復氧損傷。

綜上所述，阿托伐他汀可通過開放mitoKATPC和關(guān)閉MPTP而減輕乳鼠心肌細胞的缺氧復氧損傷，阿托伐他汀的這一心肌保護作用可被mitoKATPC阻斷劑5-羥基葵酸及MPTP開放劑氯尼達明逆轉(zhuǎn)。但阿托伐他汀是否通過別的信號通路減輕心肌細胞缺氧復氧損傷尚未可知，未來需進一步研究。