周 聰，何麗娜，成小姣，黃廷磊，涂水平

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院腫瘤科，上海 200127；

2.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院普外科，上海 200040

R-脊椎蛋白（R-spondin，RSPO）家族共有4種分泌蛋白，包括RSPO3。大量研究發(fā)現(xiàn)，RSPO3在發(fā)育［1］、成骨［2-3］、血管生成和血管功能調(diào)節(jié)［4］、造血［5］、體脂分布［6］、胃腺的分泌分化［7］等方面發(fā)揮重要的生理作用。此外，RSPO3還是腸道產(chǎn)生的最主要的RSPO家族蛋白，主要來源于腸黏膜固有層中的淋巴內(nèi)皮細(xì)胞［8］，用于協(xié)調(diào)腸道干細(xì)胞的自我更新和分化，維持腸隱窩的穩(wěn)態(tài)［9］。多項研究表明，RSPO3主要通過激活Wnt信號通路維持腸干細(xì)胞的更新［10］和介導(dǎo)多種疾?。?1］。

RSPO家族蛋白在腫瘤方面的作用仍存在爭議。RSPO1被認(rèn)為是急性和慢性淋巴細(xì)胞白血病中潛在的腫瘤抑制基因［12］。RSPO2在穩(wěn)定表達(dá)叉頭框Q1（forkhead box Q1，F(xiàn)OXQ1）基因的人結(jié)直腸癌細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)［13］，并被認(rèn)為是與裸小鼠乳腺腫瘤發(fā)生相關(guān)的致癌基因［14］。關(guān)于RSPO3在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用，既往研究幾乎均認(rèn)為它具有促癌功能，例如，已有研究顯示，RSPO3能夠促進乳腺癌［15］、卵巢癌［16］、膀胱癌［17］和絨毛膜上皮癌［18］等惡性腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。但最近的一項研究［19］發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境來源的RSPO3能通過募集激活自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞抑制胰腺癌、黑色素瘤和乳腺癌的生長。因此，RSPO家族蛋白可能在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的不同階段發(fā)揮不同的作用，特別是RSPO3，目前有關(guān)RSPO3在結(jié)直腸癌生長中的作用罕見報道。

結(jié)直腸癌是中國常見的惡性腫瘤之一，結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展涉及多種癌基因的激活和抑癌基因的失活。先前研究［20］發(fā)現(xiàn)，約7.5%的結(jié)直腸癌患者存在K型蛋白酪氨酸磷酸酶受體K（protein tyrosine phosphatase receptor type K，PTPRK）（e7）-RSPO3（e2）基因融合突變，該突變能夠激活Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路并促進結(jié)直腸癌的生長，但野生型RSPO3在結(jié)直腸癌生長中的作用目前尚不清楚。本研究旨在探討RSPO3對結(jié)直腸癌生長的影響并探索其潛在機制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞、動物、組織及主要試劑

所有細(xì)胞均購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）細(xì)胞庫，包括正常腸上皮細(xì)胞系NCM460和結(jié)腸癌細(xì)胞系SW620、HT29、RKO、LOVO、HCT116、DLD1、SW480。6周齡BALB/c裸小鼠購自上海吉輝實驗動物飼養(yǎng)有限公司。RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶和青霉素-鏈霉素混合液購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，胎牛血清購自美國Gibco公司，短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）和慢病毒購自吉滿生物科技（上海）有限公司，反轉(zhuǎn)錄和實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（real time-polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司，RSPO3抗體購自美國Sigma-Aldrich公司，引物購自生工生物工程（上海）股份有限公司，酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購自美國R＆D Systems公司，流式抗體購自美國BD Bioscience公司，雙熒光素酶試劑盒E1910購自美國Promega公司。

1.2 PCR

采 用T R I z o l 提 取R N A 后，取1 μ g 反 轉(zhuǎn)錄為cDNA，設(shè)計RSPO3的上游引物序列為5‘-AGGCGCCAGCGAAGAAT-3‘，下游引物序列為5‘-TCCAGACTTTTGCTGTCAGGT-3‘。反轉(zhuǎn)錄按照Hifair?Ⅲ One Step RT-PCR SYBR Green Kit說明書操作。取2 μL cDNA進行PCR，通過瓊脂糖凝膠電泳觀察表達(dá)水平。

1.3 構(gòu)建基因修飾細(xì)胞株

使用重組質(zhì)粒（RSPO3-psin-EF2-puro、RSPO3 shRNA1、RSPO3 shRNA2）、空載對照質(zhì)粒（psin-EF2-puro、pSU-PER-retro-puro）、反轉(zhuǎn)錄包裝質(zhì)粒、慢病毒包裝質(zhì)粒和HEK-293T細(xì)胞包裝病毒，病毒感染細(xì)胞后，用含1 μg/mL嘌呤霉素的培養(yǎng)基篩選陽性細(xì)胞并擴大培養(yǎng)，分別建立RSPO3過表達(dá)、干擾的穩(wěn)定細(xì)胞株，提取RNA后采用反轉(zhuǎn)錄PCR驗證基因修飾細(xì)胞株的構(gòu)建是否成功。

1.4 ELISA

用包被緩沖液稀釋特異性抗體球蛋白后加入凹孔，4 ℃過夜。用含0.05%吐溫-20的洗滌緩沖液洗3次后加入含抗原的細(xì)胞培養(yǎng)上清液標(biāo)本，37 ℃溫育2 h。移去包被液后洗滌，加入0.2 mL稀釋緩沖液稀釋的酶標(biāo)記特異性抗體溶液，37 ℃作用2 h后再次洗滌并加入底物溶液，室溫溫育30 min后終止，用酶標(biāo)儀測定492 nm處的吸光度（D）值。

1.5 細(xì)胞計數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）檢測

待測細(xì)胞以4 000個細(xì)胞/100 μL/孔的密度接種在96孔培養(yǎng)板中，根據(jù)說明書，使用CCK-8檢測細(xì)胞活力。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)分析

裸小鼠脾臟經(jīng)70 μm濾網(wǎng)研磨或皮下瘤組織經(jīng)Ⅳ型膠原酶處理為單細(xì)胞懸液后，使用抗裸小鼠CD16/32封閉Fc受體，隨后用PE標(biāo)記的CD49b、AF700標(biāo)記的CD3和4‘,6-二脒基-2-苯基吲哚（4‘,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）流式抗體4 ℃避光染色30 min，上機并圈門分析NK細(xì)胞（CD3-CD49b+）［18］。細(xì)胞周期采用AmcYan染色，細(xì)胞經(jīng)70%乙醇溶液固定后于-20 ℃過夜，恢復(fù)至室溫后染色30 min，并采用流式細(xì)胞術(shù)和Flowjo軟件分析。

1.7 皮下移植瘤實驗

每只裸小鼠右側(cè)背部接種5×106個腫瘤細(xì)胞，待成瘤后每2 d測量長徑（L）和短徑（W），腫瘤體積 =L×W2/2［21］。

1.8 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?/h3>

構(gòu)建Wnt基因的3‘非翻譯區(qū)（3‘-untranslated region，3‘-UTR）-熒光素酶報告質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后按照Dual-Luciferase?Reporter Assay System試劑盒說明書操作，使用熒光素酶報告基因檢測儀進行測定，以熒光素酶活性和Renilla活性的比值計算實驗結(jié)果［22］。

1.9 生物信息學(xué)分析

通過Oncomine數(shù)據(jù)庫（http s://www.oncomine.org/resource/login.html）在線分析泛癌組織的基因芯片數(shù)據(jù)中RSPO3的表達(dá)［23］，通過癌細(xì)胞系百科全書（Cancer Cell Line Encyclopedia，CCLE）數(shù)據(jù)庫（https://sites.broadinstitute.org/ccle）在線分析泛癌細(xì)胞系測序數(shù)據(jù)中RSPO3的表達(dá)［24］，通過基于癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的腫瘤免疫系統(tǒng)交互數(shù)據(jù)庫（Tumor-Immune System Interactions Database，TISIDB）（http://cis.hku.hk/TISIDB/）在線分析RSPO3與免疫浸潤淋巴細(xì)胞的相關(guān)性［25］，通過基因表達(dá)譜交互分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA）數(shù)據(jù)庫（http://gepia.cancerpku.cn/detail.php）基于TCGA結(jié)腸癌和直腸癌數(shù)據(jù)庫中的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析RSPO3表達(dá)與NK細(xì)胞相關(guān)分子標(biāo)志物表達(dá)的相關(guān)性［26］。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理

基于GraphPad Prism 7.0和SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，根據(jù)資料分布情況，兩組比較采用t檢驗或非參數(shù)檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 RSPO3在結(jié)直腸癌及泛癌組織中的表達(dá)

通過Oncomine數(shù)據(jù)庫挖掘發(fā)現(xiàn)，RSPO3在多種實體腫瘤組織中的表達(dá)顯著低于癌旁組織，包括結(jié)直腸癌［結(jié)腸癌：1.17（0.42 ～ 2.01）vs2.51（2.30 ～ 3.73），P＜0.000 1；直腸癌：1.11（0.39 ～ 1.35）vs3.06（2.62 ～ 3.78），P＜0.000 1］、乳腺癌［1.50（1.02 ～ 2.19）vs4.08（3.50 ～ 4.52），P＜0.000 1］、膠質(zhì)瘤［0.25（0.11 ～ 0.51）vs2.90（2.80 ～ 3.20），P＜0.000 1］、頭頸鱗癌［0.58（0.25 ～ 1.14）vs1.15（1.10 ～ 1.89），P＜0.000 1］及前列腺癌 ［1.97（1.18 ～ 2.75）vs3.70（2.24 ～ 3.72），P＜0.000 1］等（圖1A、1B）。CCLE數(shù)據(jù)庫中大多數(shù)腫瘤細(xì)胞系的RSPO3表達(dá)水平較低，包括結(jié)直腸癌細(xì)胞系（圖1C）。TISIDB數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，RSPO3表達(dá)與多種免疫細(xì)胞的浸潤呈正相關(guān)，其中，結(jié)直腸癌中的RSPO3表達(dá)水平與NK細(xì)胞的浸潤呈顯著正相關(guān)（結(jié)腸癌：r= 0.649，P＜0.05；直腸癌：r= 0.629，P＜0.05），詳見圖1D。

圖1 RSPO3在泛癌種中的表達(dá)情況Fig.1 Expression of RSPO3 in pancarcinoma

2.2 構(gòu)建RSPO3敲減或過表達(dá)的腸癌細(xì)胞和對照細(xì)胞株

通過ELISA檢測人結(jié)腸上皮細(xì)胞系NCM460和多種腸癌細(xì)胞系上清液中RSPO3的表達(dá)，SW620、HT29、RKO、LOVO、HCT116及DLD1的RSPO3表達(dá)水平均比NCM460低，而SW480的RSPO3表達(dá)水平比NCM460高（圖2A）。因此，本研究進一步利用shRNA，構(gòu)建并驗證了RSPO3敲減的SW480-RSPO3-KD細(xì)胞株和對照細(xì)胞株SW480-Ctrl，此外，本研究還構(gòu)建并驗證了RSPO3過表達(dá)的HCT116-RSPO3-OE細(xì)胞株和對照細(xì)胞株HCT116-Ctrl，結(jié)果見圖2B、2C。

圖2 構(gòu)建RSPO3敲減或過表達(dá)的腸癌細(xì)胞株Fig.2 Construction of RSPO3 knockdown or overexpressed colon cancer cell lines

2.3 RSPO3敲減或過表達(dá)在體內(nèi)外對SW480和HCT116細(xì)胞生長的影響

通過CCK-8實驗檢測體外細(xì)胞增殖，通過AmcYan染色和流式細(xì)胞術(shù)分析檢測細(xì)胞周期，結(jié)果顯示，RSPO3在體外不影響SW480和HCT116細(xì)胞增殖（SW480：2.98±0.01vs2.85±0.02vs3.01±0.00，P＞0.05；HCT116：2.01±0.01vs2.02±0.01，P＞0.05），對結(jié)腸癌細(xì)胞SW480（G1期：25.02±1.58vs18.98±1.33；S期：52.26±4.01vs55.05±3.02；G2期/M期：20.03±3.03vs21.85±2.02）和HCT116（G1期：56.95±0.78vs59.25±3.97；S期：14.97±1.52vs16.27±1.05；G2期/M期：28.08±0.78vs24.47±4.48）的細(xì)胞周期也無顯著影響（P＞0.05，圖3A ～ 3D）。另外，本研究觀察到，RSPO3敲減在裸小鼠體內(nèi)能顯著促進SW480移植瘤的生長（260.2±162.4vs1 311.7±570.1，P＜0.05，圖3E ～ 3G），而RSPO3過表達(dá)在裸小鼠體內(nèi)則顯著抑制HCT116移植瘤的生長（1 549.0±241.2vs512.1±250.0，P＜0.05，圖3H ～ 3J）。上述結(jié)果提示RSPO3表達(dá)改變在體內(nèi)能夠影響結(jié)腸癌的生長。

圖3 RSPO3在體內(nèi)外對 SW480或HCT116細(xì)胞生長的影響Fig.3 Effects of RSPO3 on the growth of SW480 or HCT116 cell line in vitro and in vivo

2.4 RSPO3敲減或過表達(dá)對NK細(xì)胞比例的影響

到達(dá)觀察終點后，處死裸小鼠并取脾臟和移植瘤組織以制備單細(xì)胞懸液，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD3-CD49+NK細(xì)胞的比例，發(fā)現(xiàn)RSPO3敲減后裸小鼠的脾臟和移植瘤組織中的NK細(xì)胞比例顯著減少（脾臟：6.42±0.94vs5.25±0.59，P= 0.04；移植瘤：8.27±0.29vs6.48±1.48，P= 0.04），而RSPO3過表達(dá)后裸小鼠的脾臟和移植瘤組織中的NK細(xì)胞比例顯著增多（脾臟：5.29±0.16vs7.02±0.49，P= 0.01；移植瘤：6.39±0.39vs8.14±0.34，P＜0.05，圖4）。上述結(jié)果提示RSPO3表達(dá)與NK細(xì)胞浸潤增加有關(guān)。

圖4 RSPO3在體內(nèi)影響NK細(xì)胞的比例Fig.4 RSPO3 affects the proportion of NK cells in vivo

2.5 RSPO3與NK細(xì)胞及其激活標(biāo)志物的表達(dá)呈顯著正相關(guān)

基于TCGA數(shù)據(jù)庫中結(jié)腸癌和直腸癌轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的相關(guān)性分析結(jié)果表明，RSPO3表達(dá)水平與NK細(xì)胞的表面標(biāo)志物分子CD56（基因名NCAM1，r= 0.58，P＜0.05）和CD16（基因名FCGR3A，r= 0.64，P＜0.05）的表達(dá)顯著正相關(guān)，此外，RSPO3表達(dá)水平還與NK激活的標(biāo)志物分子CD69（r= 0.51，P＜0.05）和KLRB1（r=0.37，P＜0.05）的表達(dá)顯著正相關(guān)（圖5），表明RSPO3可能不僅能上調(diào)NK細(xì)胞，還可能參與NK細(xì)胞的激活。

圖5 RSPO3表達(dá)水平與NK細(xì)胞標(biāo)志物及其激活分子標(biāo)志物的相關(guān)性Fig.5 Correlation analysis of RSPO3 expression level with NK cell markers and NK activated markers

2.6 RSPO3敲減或過表達(dá)對Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響

雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果提示，與對照組相比，RSPO3敲減后Wnt熒光素酶活性下調(diào)（1.0±0.0vs0.45±0.09，P＜0.05），而RSPO3過表達(dá)后Wnt熒光素酶活性上調(diào)（1.0±0.0vs1.75±0.14，P＜0.05，圖6）。

圖6 RSPO3敲減或過表達(dá)對Wnt熒光素酶活性的影響Fig.6 Effect of RSPO3 knockdown or overexpression on luciferase activity of Wnt

3 討 論

既往研究通常認(rèn)為RSPO3在乳腺癌［15］、卵巢癌［16］、膀胱癌［17］和絨毛膜上皮癌［18］等惡性腫瘤中發(fā)揮促癌作用。先前研究［20］顯示，在7.5%的結(jié)腸癌組織中存在PTPRK（e7）-RSPO3（e2）融合突變，RSPO3融合突變可促進結(jié)腸癌的生長。本研究發(fā)現(xiàn)，RSPO3在結(jié)直腸癌組織和多數(shù)結(jié)直腸癌細(xì)胞系中低表達(dá)。通過構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)RSPO3的HCT116細(xì)胞株和RSPO3基因敲減的SW480細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)RSPO3過表達(dá)顯著抑制了結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞的皮下移植瘤的生長，而RSPO3敲減則顯著促進了SW480細(xì)胞的移植瘤生長，證實RSPO3能夠抑制結(jié)直腸癌在體內(nèi)的生長，是一個潛在的結(jié)腸癌的抑制基因。

目前對RSPO3抑制結(jié)直腸癌生長的機制尚缺乏研究。本研究發(fā)現(xiàn)，RSPO3過表達(dá)或基因沉默在體外并不影響SW480和HCT116細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期，而僅在體內(nèi)移植瘤實驗中觀察到RSPO3具有顯著的抑瘤作用，提示RSPO3可能是通過調(diào)節(jié)體內(nèi)的腫瘤免疫微環(huán)境發(fā)揮抑瘤作用。T細(xì)胞和NK細(xì)胞是體內(nèi)發(fā)揮抗腫瘤作用的主要免疫殺傷細(xì)胞。本研究采用T細(xì)胞免疫缺陷的裸小鼠移植瘤模型，觀察到RSPO3過表達(dá)顯著抑制了結(jié)直腸癌移植瘤的生長，而RSPO3敲減則促進了結(jié)直腸癌移植瘤的生長，提示RSPO3抑制腫瘤的作用不依賴于T細(xì)胞的免疫功能，NK細(xì)胞可能發(fā)揮重要作用。

NK細(xì)胞是典型的固有免疫細(xì)胞，具有非主要組織相容性復(fù)合體限制性，其數(shù)量和比例的增加有利于直接殺傷腫瘤細(xì)胞［27］。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)分析證實，接種RSPO3敲減的SW480穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，裸小鼠的脾臟和腫瘤組織中的NK細(xì)胞比例均顯著減少，而接種RSPO3過表達(dá)的HCT116細(xì)胞后，裸小鼠的脾臟和腫瘤組織中的NK細(xì)胞數(shù)量均顯著增多，提示RSPO3能夠促進外周循環(huán)和腫瘤微環(huán)境中的NK細(xì)胞浸潤，這一結(jié)果與Tang等［19］在胰腺癌和黑色素瘤中的發(fā)現(xiàn)一致。Tang等［19］研究發(fā)現(xiàn)，RSPO3過表達(dá)能夠抑制裸小鼠體內(nèi)黑色素瘤和胰腺癌移植瘤的生長，在接種RSPO3過表達(dá)的腫瘤細(xì)胞的移植瘤中，NK細(xì)胞的比例顯著升高，并且RSPO3促進黑色素瘤和胰腺癌腫瘤組織中NK細(xì)胞的顆粒酶和穿孔素的分泌，以及增加CD69的表達(dá)，而清除NK細(xì)胞降低了RSPO3抑制黑色素瘤和胰腺癌移植瘤生長的作用，提示NK細(xì)胞介導(dǎo)了RSPO3抑制腫瘤生長的作用。本研究的生物信息學(xué)分析結(jié)果也證實，RSPO3表達(dá)水平與結(jié)直腸癌中NK細(xì)胞的浸潤水平，與NK細(xì)胞表面標(biāo)志物CD16及CD56的表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)，與NK細(xì)胞激活標(biāo)志物CD69及KLRB1的表達(dá)水平也呈顯著正相關(guān)，表明RSPO3過表達(dá)不僅會增加NK細(xì)胞的浸潤，而且可能增加NK細(xì)胞的活性。本研究結(jié)果初步證實NK細(xì)胞可能在介導(dǎo)RSPO3抑制結(jié)直腸癌生長中發(fā)揮一定的作用。NK細(xì)胞是否為介導(dǎo)RSPO3抑制結(jié)直腸癌生長的關(guān)鍵免疫細(xì)胞，仍有待將來通過NK細(xì)胞清除實驗來進一步驗證。

有研究［28］表明，RSPO3參與調(diào)控經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，此外，RSPO3通過結(jié)合多配體聚糖4受體誘導(dǎo)非經(jīng)典的Wnt/平面細(xì)胞極化（planner cell polarity，PCP）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。本研究發(fā)現(xiàn)RSPO3敲減后SW480細(xì)胞的Wnt基因活性顯著下調(diào)，過表達(dá)RSPO3后HCT116細(xì)胞的Wnt基因活性顯著上調(diào)，然而RSPO3在體內(nèi)的抑瘤作用是否與Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路直接相關(guān)還需更多的實驗來驗證。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)RSPO3能夠在體內(nèi)顯著抑制結(jié)直腸癌的生長，并參與上調(diào)NK細(xì)胞和Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。將來需要進一步證實RSPO3是否主要通過調(diào)控NK細(xì)胞或Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制結(jié)直腸癌的生長，并探索通過恢復(fù)結(jié)直腸癌中的RSPO3表達(dá)水平來治療結(jié)直腸癌的可行性，從而為結(jié)直腸癌的治療提供一個新靶標(biāo)。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。