姜博涵，張寧，郭亞麗，王玉光*

1.北京中醫(yī)藥大學，北京 100029

2.首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京 100010

特發(fā)性肺纖維化（IPF）是慢性、漸進性、纖維化性肺疾病，臨床表現(xiàn)為進行性呼吸困難、活動耐力下降、低氧血癥以及呼吸衰竭[1]。IPF 的病理特征為普通型間質(zhì)性肺炎（UIP），表現(xiàn)為遠端肺實質(zhì)中出現(xiàn)片狀纖維化重構(gòu)區(qū)域及成纖維母細胞灶。近年來，IPF 發(fā)病率逐年上升，中位生存期僅2～3 年[2]。現(xiàn)代醫(yī)學以吡非尼酮和尼達尼布等抗纖維化治療為主，雖能一定程度上延緩肺功能下降，延緩疾病進展，但存在較多不良反應(yīng)[3]。

中醫(yī)學將IPF 歸為“肺痹”“肺痿”范疇，認為其病機為本虛標實，以肺、脾、腎虧虛，尤以肺氣虧虛為主，痰、瘀、熱互結(jié)致病[4-5]。本病源于氣虛血瘀，肺腎虧虛，痰瘀互結(jié)，故臨床中常以益氣活血、補肺固腎療法為主[6-7]。補肺活血膠囊由黃芪、赤芍、補骨脂組成，具有益氣活血、補肺固腎的功效[8]。臨床研究表明，補肺活血膠囊治療IPF 療效明顯，可以一定程度上延緩肺功能下降，提高活動耐力，改善臨床癥狀及生活質(zhì)量[9]，但其抗纖維化作用機制尚不明確。磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路主要參與細胞生長、分化、凋亡和血管生成等過程，是調(diào)控肺纖維化的重要通路[3,10]。本研究通過觀察羥脯氨酸（HYP）、Ⅰ型膠原蛋白（COL-I）、纖連蛋白1（Fn1）、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、磷酸化磷脂酰肌醇-3-激酶（p-PI3K）和磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）的表達情況，分析補肺活血膠囊對于PI3K/Akt 通路的調(diào)控作用，探究其對IPF 的作用及機制。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF 級C57BL/6J 雄性小鼠60 只，年齡7～8 周，體質(zhì)量20～24 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)公司，許可證編號（京）2021-0007，飼養(yǎng)于北京市中醫(yī)研究所，飼養(yǎng)條件為SPF 級，每日動物處于12 h 光照/12 h 黑暗交替環(huán)境（溫度22～25 ℃，濕度60%～70%），通風良好，常規(guī)顆粒飼料喂養(yǎng)，攝食飲水自由，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。動物實驗經(jīng)北京中醫(yī)醫(yī)院研究所倫理委員會批準（批準號BJTCM-M-2021-05-02）。

1.2 藥物與試劑

補肺活血膠囊由廣東雷允上藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，規(guī)格0.35 g/粒，產(chǎn)品批號20220309。吡非尼酮由北京康蒂尼藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品批號 150816；注射用鹽酸博來霉素由浙江翰輝制藥有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品批號15374。4%多聚甲醛（北京蘭杰柯科技有限公司，批號BL.539A）；無水乙醇（中國醫(yī)藥集團有限公司，批號10009218）；二甲苯（中國醫(yī)藥集團有限公司，批號10023418）。伊紅（MDL）、蘇木素染液（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號ZLI-9609），Masson 三色染色試劑盒（索萊寶，批號G1340），Van Gieson 染色液（LEAGENE，批號DC0047），Mouse HYP ELISA Kit（MDL，批號MD120463），TRIZOL 試劑（Invitrogen，批號10296028），異丙醇（中國醫(yī)藥集團有限公司，批號40064360），核酸酶抑制劑（MDL，批號MD911875），UltraPure Agarose（ABI-invitrogen，批號6500100），SuperScript III RT 逆轉(zhuǎn)錄kit（ABI-invitrogen，批號11752050），Sybr qpcr mix（ABI-invitrogen，批號4472920），Citrate 檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0）（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，ZLI-9064），磷酸鹽緩沖液（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號ZLI-9061），DAB kit（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號ZLI-9017），磷酸化磷脂酰肌醇-3-激酶（p-PI3K）抗體（Affinity，批號AF3241），磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）抗體（Affinity，批號AF0016），通用型SPkit（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號SP-9000），封閉液（武漢博士德生物工程有限公司，批號AR0150），抗體稀釋液（武漢博士德生物工程有限公司，批號AR1016）。

1.3 實驗儀器

ASP200S 型全自動脫水機（德國Leica 公司），RM2235 型石蠟切片機（德國Leica 公司），HI1220型烤片臺（德國Leica 公司），HI1220 型水浴缸（德國Leica 公司），G1150 H 型加熱石蠟包埋系統(tǒng)（德國Leica 公司），DM3000 型顯微鏡（德國Leica 公司），DM3000 型正置熒光顯微鏡（德國Leica 公司），550 型酶標儀（美國BIO-RAD 公司），GL-88B 型旋渦混勻器（海門市其林貝爾公司），AXTGL16M 型離心機（湖南恒諾儀器設(shè)備公司），LEGEND MICRO 21R 型臺式高速冷凍離心機（美國THERMO 公司），Nanodrop lite 型分光光度計（美國THERMO 公司），StepOne Software 型熒光定量PCR 儀（美國Applied biosystems 公司)，EPS 300 型電泳儀（美國BIORAD 公司），2500 型凝膠成像儀（美國BIO-RAD公司），移液器（德國Eppendorf 公司）。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將60 只C57BL/6J 小鼠分為5 組，每組12 只，分別為對照組、模型組、吡非尼酮組及補肺活血膠囊高、低劑量組。除對照組外，其余各組小鼠建立肺纖維化模型，即單次氣管內(nèi)滴注博來霉素，劑量為5 mg/kg。

參考相關(guān)文獻方法[11]，于造模后第1 天開始干預(yù)治療，對照組、模型組按實際體質(zhì)量ig 等量生理鹽水10 mg/(kg?d)，1 次/d。吡非尼酮組按實際體質(zhì)量ig 吡非尼酮200 mg/kg。按補肺活血膠囊說明書，以成人（60 kg）4 200 mg/d 的標準劑量換算，則小鼠等效劑量為4 200 mg/d÷60 kg×70 kg×0.002 6/20 g≈630 mg/(kg?d)，補肺活血膠囊高、低劑量（臨床標準劑量）組分別ig 配制好的補肺活血膠囊630、315 mg/(kg?d)，1 次/d。連續(xù)給藥28 d 后取材。

2.2 小鼠一般情況觀察

實驗過程中觀察小鼠一般情況，包括精神狀態(tài)、活動程度、呼吸頻率、進食量和皮毛色澤等。記錄各組小鼠體質(zhì)量變化和死亡數(shù)量等。

2.3 肺組織病理切片觀察

取小鼠肺組織右下葉，用4%多聚甲醛溶液固定24 h 后，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片，脫蠟后，再分別用蘇木精–伊紅（HE）和馬松（Masson）的試劑盒染色。然后將切片浸入95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ各1 min，無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ中各3 min脫水，脫水后將切片浸入二甲苯Ⅰ溶液和二甲苯Ⅱ溶液中各3 min，最后將切片晾干，封片。在光學顯微鏡下對小鼠肺組織病理切片進行觀察并攝片。

2.4 肺組織HYP 含量測定

采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測各組小鼠肺組織HYP 水平。分別設(shè)標準孔、空白孔與待測樣品孔。標準孔依次加入100 μL 不同濃度（0、2.5、5、10、20、40 ng/mL）的標準品溶液；空白孔加入100 μL 標準品稀釋液，待測樣品孔加待測樣品100 μL，在酶標板上蓋上覆膜，37 ℃溫育1 h。洗板5 次，洗滌后用吸水紙徹底拍干。各孔中加入顯色劑A 100 μL，酶標板覆蓋，37 ℃溫育30min，棄去孔中液體，洗板5 次，拍干；再向各孔中加入顯色劑B 100μL，37 ℃溫育30 min，棄去孔中液體，洗板5 次，拍干。在20-25℃下避光反應(yīng)10min 后，各孔加入50μL 終止液終止反應(yīng)。立即將反應(yīng)板置于已設(shè)好波長的450nm 的酶標儀，在30min 內(nèi)讀出OD 值。按照樣品讀數(shù)及稀釋濃度計算出小鼠肺組織HYP 水平。

2.5 RT-qPCR 法檢測肺組織COL-Ⅰ、Fn1 和α-SMA的mRNA 相對表達水平

采用Trizol 法提取樣本總RNA，使用核酸濃度測定儀測定RNA 濃度和純度。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以β-actin為內(nèi)參，進行PCR 的擴增。反應(yīng)總體積為20 μL，反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，重復(fù)40個循環(huán)，熔解曲線分析，95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，95 ℃、15 s，采用2?△△Ct法計算COL-Ⅰ、Fn1、α-SMAmRNA 相對表達量，引物序列見表1。

表1 RT-qPCR 引物序列Table 1 Primer sequences for RT-qPCR

2.6 肺組織p-PI3K 和p-Akt 蛋白表達水平

將肺組織依次進行4%多聚甲醛固定、包埋、切片、脫蠟、抗原修復(fù)。3%過氧化氫溶液孵育10 min30 min。滴加適宜濃度的一抗置濕盒中4 ℃孵育過以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，在濕盒中室溫封閉夜。滴加生物素化二抗工作液，室溫置濕盒中孵育20 min，加入DAB 顯色液，顯微鏡下控制顯色時間，陽性為棕黃色，自來水沖洗切片終止顯色，蘇木素染色液復(fù)染3 min，自來水沖洗；1%的鹽酸酒精分化數(shù)秒、沖洗返藍，乙醇梯度脫水、二甲苯透明、封片。用40 倍顯微鏡分析切片，并用Image J軟件進行評分。

2.7 統(tǒng)計學方法

分別采用IBM SPSS Statistics 25.0、GraphPad Prism 8.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析、做圖。計量資料符合正態(tài)分布用表示，不符合正態(tài)分布用中位數(shù)和四分位間距表示。兩組間比較符合正態(tài)分布采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；組間比較不符合正態(tài)分布采用非參數(shù)檢驗。

3 結(jié)果

3.1 小鼠體質(zhì)量與生活狀態(tài)觀察

造模及給藥后，對照組小鼠一般狀態(tài)較好，精神狀態(tài)佳，反應(yīng)敏捷，活潑好動，進食、飲水量正常，皮毛光亮，尾部無缺損。模型組小鼠精神狀態(tài)較差，反應(yīng)緩慢，活動量明顯減少，進食量減少，飲水量減少，體型瘦弱，皮毛晦暗無光、凌亂，較多小鼠尾部出現(xiàn)缺損。補肺活血膠囊高劑量組與吡非尼酮組小鼠一般狀態(tài)表現(xiàn)接近，反應(yīng)較緩慢，活動量稍減，進食、飲水量減少，皮毛尚有光澤，部分尾部出現(xiàn)缺損，均優(yōu)于補肺活血膠囊低劑量組與模型組。對照組無小鼠死亡，模型組小鼠死亡3 只，吡非尼酮組死亡2 只，補肺活血膠囊高劑量組死亡2 只，補肺活血膠囊低劑量組死亡3 只。

由表2 可知，給藥7 d 后，吡非尼酮組與模型組小鼠體質(zhì)量最低，吡非尼酮組小鼠體質(zhì)量較低可能與前期小鼠ig 給藥時不配合相關(guān)，給藥14、28 d，小鼠體質(zhì)量由高到低排序為對照組、補肺活血膠囊高劑量組、吡非尼酮組、補肺活血膠囊低劑量組、模型組。

表2 造模后各組小鼠體質(zhì)量變化（n=12）Table 2 Changes of body weight of mice in each group after modeling (n =12)

3.2 HE 染色結(jié)果

如圖1 所示，對照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰正常，輪廓完整，肺泡間隔未見明顯增厚，未見明顯滲出及炎性細胞浸潤。模型組小鼠肺組織見肺泡結(jié)構(gòu)明顯破壞，肺泡間隔增厚或（和）斷裂，纖維組織增生明顯，可見膠原沉積，肺泡腔內(nèi)可見明顯炎性細胞浸潤。與模型組比較，補肺活血膠囊低、高劑量組及吡非尼酮組小鼠肺組織上述病理變化均有不同程度的好轉(zhuǎn)，肺泡融合塌陷較少，肺組織結(jié)構(gòu)較完整，病變范圍局限，炎性滲出物減少。

圖1 各組小鼠肺組織病理變化（HE 染色，×20）Fig.1 Pathological changes of lung tissue of mice in each group (HE staining,×20)

3.3 Masson 染色結(jié)果

如圖2 所示，對照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰正常，輪廓完整，肺泡間隔未見明顯增厚，未見明顯滲出及炎性細胞浸潤。模型組小鼠肺組織見肺泡結(jié)構(gòu)明顯破壞，肺泡間隔增厚或（和）斷裂，纖維組織增生明顯，可見膠原沉積，肺泡腔內(nèi)可見明顯炎性細胞浸潤。與模型組比較，補肺活血膠囊高劑量組、補肺活血膠囊低劑量組、吡非尼酮組小鼠肺組織藍色膠原纖維的沉積不同程度地減少。

圖2 各組小鼠肺組織病理變化（Masson 染色，×20）Fig.2 Pathological changes in lung tissue of mice in each group (Masson staining,×20)

3.4 各組小鼠肺組織中HYP 含量比較

如表3 所示，與對照組相比，模型組小鼠肺組織中HYP 含量顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與模型組相比，補肺活血膠囊低、高劑量組及吡非尼酮組小鼠肺組織中HYP 含量均顯著降低（P＜0.05、0.01）；與補肺活血膠囊低劑量組相比，補肺活血膠囊高劑量組、吡非尼酮組小鼠肺組織中HYP 含量顯著降低（P＜0.01）；補肺活血膠囊高劑量組與吡非尼酮組小鼠肺組織中HYP 含量接近，差異無統(tǒng)計學意義。

表3 各組小鼠肺組織HYP 含量比較（, n=12）Table 3 Comparison on HYP content in lung tissue of mice in each group (,n=12)

表3 各組小鼠肺組織HYP 含量比較（, n=12）Table 3 Comparison on HYP content in lung tissue of mice in each group (,n=12)

與對照組比較：**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與補肺活血膠囊低劑量組比較：△△P＜0.01**P < 0.01 vs control group;#P＜0.05 ##P < 0.01 vs model group;△△P <0.01 vs Bufei Huoxue Capsules low dose group

3.5 各組小鼠肺組織中COL-Ⅰ、Fn1 和α-SMA mRNA 相對表達水平比較

如表4 所示，與對照組相比，模型組小鼠肺組織中COL-Ⅰ、Fn1、α-SMA的mRNA 相對表達量均顯著上調(diào)（P＜0.01）；與模型組相比，補肺活血膠囊高劑量組、吡非尼酮組小鼠肺組織中COL-Ⅰ、Fn1、α-SMAmRNA 相對表達量均顯著下調(diào)（P＜0.01）；與模型組相比，補肺活血膠囊低劑量組小鼠肺組織中COL-ⅠmRNA 相對表達量下調(diào)（P＜0.05），F(xiàn)n1、α-SMA的mRNA 相對表達量的差異無統(tǒng)計學意義；與補肺活血膠囊低劑量組相比，補肺活血膠囊高劑量組、吡非尼酮組小鼠肺組織中COL-Ⅰ的mRNA 相對表達量顯著下調(diào)（P＜0.01），α-SMA的mRNA 相對表達量下調(diào)（P＜0.05），F(xiàn)n1的mRNA相對表達量差異無統(tǒng)計學意義。

表4 各組肺組織中COL-I、Fn1 和α-SMA 的mRNA 相對表達水平（, n=12）Table 4 Relative mRNA expression levels of COL-Ⅰ,Fn1 and α-SMA in lung tissues of each group (,n=12)

表4 各組肺組織中COL-I、Fn1 和α-SMA 的mRNA 相對表達水平（, n=12）Table 4 Relative mRNA expression levels of COL-Ⅰ,Fn1 and α-SMA in lung tissues of each group (,n=12)

與對照組比較：**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與補肺活血膠囊低劑量組比較：△P＜0.05 △△P＜0.01

3.6 各組小鼠肺組織中p-PI3K 和p-Akt 蛋白表達水平比較

如圖3、表5 所示，與對照組相比，模型組小鼠肺組織中p-PI3K、p-Akt 蛋白含量均顯著上調(diào)（P＜0.01）。與模型組相比，補肺活血膠囊低、高劑量及吡非尼酮組小鼠肺組織中p-PI3K、p-Akt 蛋白含量均顯著下調(diào)（P＜0.05、0.01）。與補肺活血膠囊低劑量組相比，補肺活血膠囊高劑量組和吡非尼酮組小鼠肺組織中p-PI3K 蛋白表達量顯著降低（P＜0.01），p-Akt蛋白表達量降低（P＜0.05）；補肺活血膠囊高劑量組與吡非尼酮組小鼠肺組織中p-PI3K、p-Akt 蛋白含量接近，差異無統(tǒng)計學意義。

圖3 p-PI3K 和p-Akt 免疫組化（Masson 染色，×40）Fig.3 Immunohistochemistry of p-PI3K and p-Akt (Masson staining,×40)

表5 各組小鼠肺組織p-PI3K 和p-Akt 蛋白表達水平（, n=12）Table 5 Expression levels of p-PI3K and p-Akt proteins in lung tissues of each group (,n=12)

表5 各組小鼠肺組織p-PI3K 和p-Akt 蛋白表達水平（, n=12）Table 5 Expression levels of p-PI3K and p-Akt proteins in lung tissues of each group (,n=12)

與對照組相比：**P＜0.01；與模型組相比：#P＜0.05 ##P＜0.01；與補肺活血膠囊低劑量組相比：△P＜0.05 △△P＜0.01**P < 0.01 vs control group;#P＜0.05 ##P < 0.01 vs model group;△P < 0.05 △△P < 0.01 vs Bufei Huoxue Capsules low dose group

4 討論

在中醫(yī)學中沒有與IPF 完全相對應(yīng)的病名，現(xiàn)代研究中將IPF 歸屬為“肺痿”“肺痹”者居多。“肺痹”濫觴于《黃帝內(nèi)經(jīng)》。《素問·玉機真臟論》曰：“風寒客于人，使人毫毛畢直，皮膚閉而為熱……弗治，病入舍于肺，名曰肺痹，發(fā)咳上氣”?！端貑枴け哉摗吩唬骸帮L寒濕三氣雜至，合而為痹……皮痹不已，復(fù)感于邪，內(nèi)舍于肺……凡痹之客五臟者，肺痹者，煩滿喘而嘔，……淫氣喘息，痹聚在肺……其入臟者死”。其所論之肺痹，多與皮痹相關(guān)，主要由于肺氣虧虛、少陰不足、風寒濕邪入舍于肺而成，其證可見咳嗽，虛喘，胸中煩滿，喘而嘔。“肺痿”一詞，源于《金匱要略·肺痿肺癰咳嗽上氣病脈證治第七》：“熱在上焦者，因咳為肺痿。肺痿治病，何從得之？師曰：或從汗出，或從嘔吐，或從消渴，小便利數(shù)，或從便難，又被快藥下利，重亡津液，故得之”“肺痿吐涎沫而不咳者，其人不渴，必遺尿，小便數(shù)，所以然者，以上虛不能制下故也。此為肺中冷，必眩，多涎唾……”。肺痿病因或為熱在上焦，邪熱傷陰；或因誤治汗、吐、下傷陰；或消渴津液耗傷等，從而導致肺陰虧損和肺氣虛冷、氣不化津、津液不布、肺失濡養(yǎng)，導致肺葉萎弱不用。

本病總由肺氣虛損，氣不行血，以致瘀血內(nèi)停，或肺氣不足，氣不布津，聚而成痰，日久肺腎虧虛，痰瘀互結(jié)。當屬虛實夾雜、本虛標實之證。周平安教授認為，本病大致可分為早期，緩解期，急性加重期，晚期。氣虛血瘀貫穿疾病的始終，久病后肺腎虧虛，故當以益氣活血，補肺固腎法治療為主[12]。補肺活血膠囊由黃芪、赤芍、補骨脂組成，其功效為補益肺腎，益氣活血。臨床研究表明[9]，補肺活血膠囊治療IPF 療效明顯，可以在一定程度上改善肺功能，提高活動耐力，改善臨床癥狀及生活質(zhì)量。

大量研究證明，肺泡上皮細胞（AEC）在IPF 發(fā)病機制中的關(guān)鍵作用[13]，AEC 的持續(xù)損傷與異常修復(fù)促成了肺纖維化的形成。上皮細胞–間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）亦是肺纖維化發(fā)展的關(guān)鍵過程[14]。在這一過程中，上皮細胞標志物E-cadherin 的表達降低，間充質(zhì)細胞標志物如COL-Ⅰ、α-SMA 的表達上調(diào)[15]，促進了肺纖維化的發(fā)展。Fn1 屬于纖連蛋白，通過與膠原特異性結(jié)合，為膠原的沉積構(gòu)成基質(zhì)支架[16]，與纖維化進程息息相關(guān)。本次研究結(jié)果表明，與模型組相比，補肺活血膠囊高劑量組小鼠的COL-I、Fn1、α-SMAmRNA 表達量均顯著降低（P＜0.01），證明其抗纖維化的作用。

PI3K/Akt 信號通路為參與調(diào)控肺纖維化過程的重要通路，該通路通常由其受體酪氨酸激酶的激活觸發(fā)，導致PI3K 從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到質(zhì)膜。這種易位激活了其催化亞基（p110a），進而誘導磷酸肌醇的磷酸化，導致第二信使（PI3,4-二磷酸和PI3,4,5-三磷酸）的形成，第二信使結(jié)合Akt 導致其結(jié)構(gòu)的改變，暴露出2 個氨基酸殘基，絲氨酸473 和蘇氨酸308 分別被PDK1 和PDK2 磷酸化[17]。從而導致Akt的激活，誘導下游信號分子，最終導致肌成纖維細胞增殖活化，細胞質(zhì)基質(zhì)沉積，膠原堆積，纖維化形成。本次研究結(jié)果表明，與模型組小鼠相比，補肺活血膠囊高劑量組小鼠的p-PI3K，p-Akt 表達量均顯著降低（P＜0.01），表示其作用機制與PI3K/Akt信號通路相關(guān)。

綜上所述，補肺活血膠囊可能通過PI3K/Akt 信號通路發(fā)揮抗纖維化的作用，從而治療IPF。本研究為補肺活血膠囊治療IPF 提供了實驗理論支持，但是尚且需要進行更加完備的臨床試驗和基礎(chǔ)實驗進一步驗證和闡明其具體的作用機制。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突