李敏，楊素清，王偉*，李洪峰，張慧欣

1.冀中能源峰峰集團(tuán)有限公司總醫(yī)院 骨科，河北 邯鄲 056201

2.邯鄲市第一醫(yī)院 胸外科，河北 邯鄲 056000

3.冀中能源峰峰集團(tuán)有限公司總醫(yī)院 消化科，河北 邯鄲 056201

食管癌是常見消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其主要組織病理學(xué)以食管鱗癌為主，發(fā)病率與死亡率較高，目前食管鱗癌的治療方式以手術(shù)聯(lián)合放化療為主，由于腫瘤耐藥性，患者5 年生存率很低，尋找新的治療藥物是提高患者生存率的重要途徑[1-2]。鐵死亡是細(xì)胞內(nèi)鐵依賴的脂質(zhì)過氧化損傷導(dǎo)致的非凋亡性死亡，研究顯示，鐵死亡與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]。褪黑素是由松果體分泌的吲哚類物質(zhì)，具有抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)的作用，研究顯示，褪黑素可抑制胃癌[4]、卵巢癌[5]等腫瘤細(xì)胞的增殖與遷移，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，且在食管癌中，褪黑素可協(xié)同5-氟尿嘧啶（5-FU）抑制食管癌細(xì)胞遷移與侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提高5-FU 對食管癌細(xì)胞的敏感性[6]。溶質(zhì)運(yùn)載蛋白7 家族成員11（SLC7A11）是調(diào)節(jié)鐵死亡的蛋白酶，在維持細(xì)胞內(nèi)外的谷胱甘肽氧化還原平衡中發(fā)揮重要作用，SLC7A11 過表達(dá)可抑制鐵死亡，與胃癌、乳腺癌等腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)[7-8]。研究顯示，SLC7A11 在食管鱗癌組織中表達(dá)水平升高，與食管鱗癌的臨床分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、及分化程度、患者預(yù)后及新輔助化療耐藥有關(guān)[9]。因此，本研究通過探究褪黑素對食管鱗癌細(xì)胞鐵死亡及對SLC7A11 表達(dá)的影響，旨在揭示褪黑素調(diào)控食管鱗癌細(xì)胞鐵死亡的作用機(jī)制，為食管鱗癌的分子靶向治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 細(xì)胞與動物

人食管鱗癌KYSE150 細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。5～6 周齡SPF 級BALB/c 雄性裸鼠，體質(zhì)量16～20 g，購自武漢大學(xué)動物實驗中心[生產(chǎn)許可證號SCXK（鄂）2019-0004]。所有實驗按照《實驗動物護(hù)理和使用指南》執(zhí)行，均經(jīng)過冀中能源峰峰集團(tuán)有限公司總醫(yī)院批準(zhǔn)（動物實驗倫理批號2022019）。

1.2 主要試劑與儀器

褪黑素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，貨號M5250）、碘化丙啶（PI，規(guī)格10 mg，貨號P4170）、鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1（Fer-1，規(guī)格5 mg，貨號SML0583）、鐵含量檢測試劑盒（貨號MAK025）購自Sigma 公司；DMEM 培養(yǎng)基（貨號10566016）購自美國Gibco公司；SLC7A11 過表達(dá)質(zhì)粒及空載質(zhì)粒（pcDNA）購自廣州銳博生物科技有限公司；MTT 細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒（貨號E-CK-A341）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（貨號E-BC-K318-M）購自Elabscience 公司；RIPA 裂解液（貨號R0010）購自北京索萊寶生物科技有限公司；兔抗人SLC7A11（貨號ab175186）、β-actin（貨號ab8227）及辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG 二抗（貨號ab205718）購自Abcam 公司；總谷胱甘肽（GSH）檢測試劑盒（貨號S0052）、活性氧（ROS）檢測試劑盒（貨號S0033S）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

JEM-1230 透射電子顯微鏡購自日本電子公司；FACS Calibur 流式細(xì)胞儀購自美國BD 公司；Flexstation-3 多功能酶標(biāo)儀購自美國 Molecular Devices 公司。

2 方法

2.1 鐵死亡細(xì)胞模型的建立

KYSE150 細(xì)胞接種至DMEM 培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)至對數(shù)期時，以每孔4×103個細(xì)胞接種至96 孔板中，分別使用濃度為0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mmol/L 的褪黑素處理KYSE150 細(xì)胞24 h，并單獨(dú)設(shè)置空白組，MTT 檢測細(xì)胞存活率。

另選擇對數(shù)生長期的KYSE150 細(xì)胞，使用1.0 mmol/L 褪黑素處理KYSE150 細(xì)胞為褪黑素組；另設(shè)置褪黑素＋Fer-1 組，使用5 μmol/L Fer-1[10]與1.0 mmol/L 褪黑素共同處理KYSE150 細(xì)胞。褪黑素組、褪黑素＋Fer-1 組處理24 h，MTT 檢測細(xì)胞活性[490 nm 處吸光度（A490）值]。

2.2 細(xì)胞分組

將KYSE150 細(xì)胞分成4 組，分別為對照組、褪黑素組、褪黑素＋pcDNA 組、褪黑素＋SLC7A11組。褪黑素組使用1.0 mmol/L 褪黑素處理24 h，褪黑素＋pcDNA（轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒）組、褪黑素＋SLC7A11（轉(zhuǎn)染SLC7A11 過表達(dá)質(zhì)粒）組先進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染24 h 后，使用1.0 mmol/L 褪黑素處理24 h，每組設(shè)置6 個復(fù)孔。

2.3 細(xì)胞線粒體形態(tài)觀察

離心收集各組處理的細(xì)胞，PBS 洗滌后，使用2.5%戊二醛4 ℃固定過夜，加入1%鋨酸放置1 h，PBS 洗滌3 次，分別使用50%、70%、90%乙醇及丙酮脫水，包埋固化后，切成50～60 nm 的切片，3%醋酸鈾–枸櫞酸鉛雙染色，透射電子顯微鏡觀察并拍照。

2.4 PI 染色檢測細(xì)胞死亡

將各組處理后的細(xì)胞1 500 r/min 離心5 min，收集細(xì)胞，PBS 洗滌，加入70%乙醇4 ℃固定30 min，PBS 洗滌，加入500 μL PI（50 μg/mL）避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞死亡。

2.5 細(xì)胞內(nèi)Fe2+及GSH 水平檢測

離心收集各組處理的細(xì)胞，PBS 洗滌后加入RIPA 裂解液裂解2 h 后，分別使用鐵含量檢測試劑盒及總GSH 檢測試劑盒檢測細(xì)胞中Fe2+及GSH 的水平。

2.6 細(xì)胞中ROS 的檢測

離心收集各組處理的細(xì)胞，PBS 洗滌后加入10 μmol/L DCFH-DA，37 ℃孵育20 min，去除多余的液體，熒光酶標(biāo)儀（488 nm 激發(fā)波長，525 nm 發(fā)射波長）檢測熒光強(qiáng)度，熒光越強(qiáng)則表示ROS 的含量越高。

2.7 Western blotting 法檢測SLC7A11 蛋白表達(dá)

離心收集細(xì)胞PBS 洗滌2 遍，加入RIPA 裂解液裂解，超聲破碎3 min，12 000 r/min 離心20 min取上清，采用BCA 法進(jìn)行蛋白定量，每組取25 μg蛋白煮沸變性后進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜后5%的脫脂牛奶封閉，加入兔抗人SLC7A11 和β-actin 抗體，4 ℃孵育過夜，再加入HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG 二抗，室溫孵育1 h，ECL 顯色液顯色，以β-actin 為內(nèi)參，Image J 軟件分析目的蛋白相對表達(dá)量。

2.8 裸鼠荷瘤實驗

將BALB/c 裸鼠分為模型組、褪黑素組、褪黑素＋pcDNA 組、褪黑素＋SLC7A11 組，每組各10只。KYSE150 細(xì)胞使用PBS 調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個/mL，模型組與褪黑素組在無菌條件下，在裸鼠右側(cè)腋下注射100 μL 細(xì)胞液，褪黑素＋pcDNA組、褪黑素＋SLC7A11 組按照同樣方法在在裸鼠右側(cè)腋下注射100 μL 分別轉(zhuǎn)染過空載質(zhì)粒（pcDNA）和SLC7A11 過表達(dá)質(zhì)粒（SLC7A11）的KYSE150細(xì)胞，接種第8 天，褪黑素組、褪黑素＋pcDNA 組、褪黑素＋SLC7A11 組小鼠ip 給藥25 mg/kg，2 d 給藥1 次，給藥劑量參考文獻(xiàn)報道[6]，第23 天脫頸處死小鼠，取腫瘤組織，測量體積并稱質(zhì)量，免疫組化法檢測腫瘤組織SLC7A11 蛋白表達(dá)。

2.9 統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 褪黑素誘導(dǎo)KYSE150 細(xì)胞鐵死亡模型的建立

結(jié)果顯示，不同濃度的褪黑素均可顯著降低KYSE150 細(xì)胞增殖活性，當(dāng)褪黑素濃度為 1.0 mmol/L 時，細(xì)胞存活率約70%，因此選用1.0 mmol/L 的褪黑素用于后續(xù)實驗，見圖1A。

圖1 不同濃度褪黑素對KYSE150 細(xì)胞存活率（A）和褪黑素對鐵死亡細(xì)胞模型（B）的影響Fig.1 Effects of different concentrations of melatonin on KYSE150 cell survival (A) and on iron-dead cell models (B)

為驗證褪黑素通過鐵死亡誘導(dǎo)KYSE150 細(xì)胞死亡，使用1.0 mmol/L 褪黑素與Fer-1 共同處理KYSE150 細(xì)胞。結(jié)果顯示，與褪黑素組比較，褪黑素＋Fer-1 組KYSE150 細(xì)胞增殖活性顯著升高，表明Fer-1 可逆轉(zhuǎn)褪黑素對KYSE150 細(xì)胞的增殖抑制作用，見圖1B。

3.2 褪黑素對KYSE150 細(xì)胞形態(tài)的影響

如圖2 所示，透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，褪黑素組細(xì)胞內(nèi)的線粒體較對照組變小，線粒體膜密度增加；褪黑素＋SLC7A11 組細(xì)胞線粒體較褪黑素＋pcDNA 組正常，線粒體膜密度減少。

圖2 透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)（×50 000）Fig.2 Cell morphology observed by transmission electron microscope (×50 000)

3.3 褪黑素對KYSE150 細(xì)胞死亡的影響

如圖3 所示，死亡細(xì)胞的細(xì)胞核被PI 染成紅色，褪黑素組KYSE150 死亡細(xì)胞數(shù)較對照組增多，褪黑素＋SLC7A11 組死亡細(xì)胞數(shù)較褪黑素＋pcDNA 組減少。

圖3 褪黑素對KYSE150 細(xì)胞死亡的影響Fig.3 Effect of melatonin on KYSE1500 cell death

3.4 褪黑素對KYSE150 細(xì)胞內(nèi)Fe2+水平的影響

與對照組比較，褪黑素組KYSE150 細(xì)胞內(nèi)Fe2+水平顯著升高（P＜0.05）；與褪黑素＋pcDNA 組比較，褪黑素＋SLC7A11 組細(xì)胞內(nèi)Fe2+水平顯著降低（P＜0.05），見表1。

表1 褪黑素對KYSE150 細(xì)胞內(nèi)Fe2+水平的影響（，n =6）Table 1 Effect of melatonin on Fe2+ level in KYSE150 cells(,n =6)

表1 褪黑素對KYSE150 細(xì)胞內(nèi)Fe2+水平的影響（，n =6）Table 1 Effect of melatonin on Fe2+ level in KYSE150 cells(,n =6)

與對照組比較：*P＜0.05；與褪黑素＋pcDNA 組比較：#P＜0.05*P <0.05 vs control group;#P <0.05 vs melatonin+pcDNA group

3.5 褪黑素對KYSE150 細(xì)胞內(nèi)ROS、GSH 水平的影響

與對照組比較，褪黑素組KYSE150 細(xì)胞內(nèi)GSH 水平顯著降低，ROS 水平顯著升高（P＜0.05），DCF 熒光強(qiáng)度增加；與褪黑素＋pcDNA 組比較，褪黑素＋SLC7A11 組細(xì)胞內(nèi)GSH 水平顯著升高，ROS水平顯著降低（P＜0.05），DCF 熒光強(qiáng)度降低，見圖4、表2。

表2 褪黑素對KYSE150 細(xì)胞內(nèi)ROS、GSH 水平的影響（，n =6）Table 2 Effects of melatonin on ROS and GSH levels in KYSE150 cells (,n =6)

表2 褪黑素對KYSE150 細(xì)胞內(nèi)ROS、GSH 水平的影響（，n =6）Table 2 Effects of melatonin on ROS and GSH levels in KYSE150 cells (,n =6)

與對照組比較：*P＜0.05；與褪黑素＋pcDNA 組比較：#P＜0.05*P <0.05 vs control group;#P <0.05 vs melatonin+pcDNA group

圖4 DCFH-DA 熒光探針檢測細(xì)胞內(nèi)ROS 的變化Fig.4 Changes of intracellular ROS detected by DCFH-DA fluorescent probe

3.6 褪黑素對KYSE150 細(xì)胞SLC7A11 表達(dá)的影響

Western Blotting 結(jié)果顯示，與對照組比較，褪黑素組KYSE150 細(xì)胞SLC7A11 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與褪黑素＋pcDNA 組比較，褪黑素＋SLC7A11 組細(xì)胞SLC7A11 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），見圖5、表3。

表3 褪黑素對KYSE150 細(xì)胞SLC7A11 表達(dá)的影響 (,n =6)Table 3 Effect of melatonin on SLC7A11 expression in KYSE150 cells (,n =6)

表3 褪黑素對KYSE150 細(xì)胞SLC7A11 表達(dá)的影響 (,n =6)Table 3 Effect of melatonin on SLC7A11 expression in KYSE150 cells (,n =6)

與對照組比較：*P＜0.05；與褪黑素＋pcDNA 組比較：#P＜0.05*P <0.05 vs control group;#P <0.05 vs melatonin+pcDNA group

圖5 各組KYSE150 細(xì)胞SLC7A11 蛋白表達(dá)情況Fig.5 SLC7A11 protein expression of KYSE150 cells in each group

3.7 褪黑素對荷瘤小鼠腫瘤體積與質(zhì)量的影響

與對照組比較，褪黑素組腫瘤質(zhì)量與體積顯著降低（P＜0.05）；與褪黑素＋pcDNA 組比較，褪黑素＋SLC7A11 組腫瘤質(zhì)量與體積顯著降低顯著升高（P＜0.05），見表4。

表4 褪黑素對荷瘤小鼠腫瘤體積與質(zhì)量的影響（，n =10）Table 4 Effects of melatonin on tumor volume and mass in tumor-bearing mice (,n =10)

表4 褪黑素對荷瘤小鼠腫瘤體積與質(zhì)量的影響（，n =10）Table 4 Effects of melatonin on tumor volume and mass in tumor-bearing mice (,n =10)

與對照組比較：*P＜0.05；與褪黑素＋pcDNA 組比較：#P＜0.05*P <0.05 vs control group;#P <0.05 vs melatonin+pcDNA group

3.8 褪黑素對荷瘤小鼠腫瘤組織SLC7A11 表達(dá)的影響

免疫組化結(jié)果顯示，對照組腫瘤組織褐色或中褐色細(xì)胞較多，SLC7A11 呈強(qiáng)陽性表達(dá)，褪黑素組與褪黑素＋pcDNA 組細(xì)胞SLC7A11 陽性顆粒表達(dá)較對照組減少，褪黑素＋SLC7A11 組細(xì)胞SLC7A11陽性顆粒表達(dá)較褪黑素＋pcDNA 組增多，見圖6。

圖6 免疫組化檢測腫瘤組織SLC7A11 蛋白表達(dá)（SP，×200）Fig.6 Immunohistochemical detection of SLC7A11 protein expression in tumor tissue (SP,×200)

4 討論

褪黑素是一種吲哚類神經(jīng)內(nèi)分泌激素，在多種人類腫瘤中具有抗腫瘤的作用，通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)免疫等多種途徑發(fā)揮抗癌作用[11]。為驗證褪黑素對食管鱗癌的抑制作用，本研究建立食管鱗癌細(xì)胞裸鼠移植瘤模，ip 一定的褪黑素治療后，結(jié)果顯示，褪黑素可顯著抑制食管鱗癌細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長。除抗腫瘤作用，褪黑素還可增加腫瘤細(xì)胞對紫杉醇、多柔比星等化療藥物敏感性[12]。另有研究顯示，褪黑素通過激活核因子E2 相關(guān)因子2（Nrf2）/血紅素加氧酶-1（HO-1）信號通路抑制高葡萄糖誘導(dǎo)2 型糖尿病骨質(zhì)疏松癥的鐵死亡[13]。鐵死亡是一種依賴性的脂質(zhì)過氧化物介導(dǎo)的細(xì)胞死亡方式，與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[14]。褪黑素對食管鱗癌細(xì)胞鐵死亡的影響尚不清楚，本研究結(jié)果顯示，使用 0.25～4.0 mmol/L 褪黑素均可顯著降低KYSE150 細(xì)胞增殖活性，且使用1.0 mmol/L 褪黑素與鐵死亡抑制劑Fer-1 共同處理KYSE150 細(xì)胞顯示，F(xiàn)er-1 可逆轉(zhuǎn)褪黑素對KYSE150 細(xì)胞的增殖抑制作用，表明褪黑素可通過鐵死亡誘導(dǎo)KYSE150細(xì)胞死亡。

鐵死亡是一種鐵依賴性氧化細(xì)胞死亡，GSH 是維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡的重要成分，ROS 水平反映細(xì)胞抗氧化能力，細(xì)胞鐵死亡發(fā)生時，表現(xiàn)為線粒體變小、線粒體膜密度增高、線粒體嵴減少或消失，細(xì)胞內(nèi)抗氧化能力降低，細(xì)胞內(nèi)ROS 大量生成，F(xiàn)e2+升高，GSH 水平降低[15]。本研究使用1.0 mmol/L 褪黑素處理KYSE150 細(xì)胞24 h 后，細(xì)胞死亡數(shù)目增加，細(xì)胞線粒體變小，線粒體膜密度增加，細(xì)胞內(nèi)Fe2+水平與ROS 水平升高，GSH 水平顯著降低，符合鐵死亡特征，表明褪黑素可誘導(dǎo)KYSE150 細(xì)胞鐵死亡。

SLC7A11 為一種氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，屬于溶質(zhì)載體家族成員，可與溶質(zhì)載體家族3 成員2（SLC3A2）組成胱氨酸/谷氨酸反轉(zhuǎn)運(yùn)體，抑制胱氨酸/谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體可促進(jìn)細(xì)胞鐵死亡，導(dǎo)致SLC7A11 表達(dá)代償性的增加，研究顯示，SLC7A11 在肝癌、食管鱗癌等腫瘤中上調(diào)表達(dá)，SLC7A11 可通過攝取胱氨酸與合成還原性GSH 保護(hù)細(xì)胞損傷及鐵中毒[16-17]。研究顯示，SLC7A11 在食管鱗癌組織中上調(diào)表達(dá)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和患者預(yù)后差有關(guān)，且體外細(xì)胞實驗顯示，Nrf2 的過度激活可誘導(dǎo)SLC7A11 表達(dá)，降低放射治療誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化水平，促進(jìn)食管鱗癌放射抗性[10]。本研究結(jié)果顯示，使用1.0 mmol/L 褪黑素處理KYSE150 細(xì)胞24 h 后，SLC7A11 表達(dá)水平降低；在乳腺癌中，二甲雙胍可通過抑制SLC7A11 表達(dá)誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞鐵死亡[18]。為進(jìn)一步探究褪黑素調(diào)控SLC7A11 對KYSE150 細(xì)胞的影響，將KYSE150 細(xì)胞轉(zhuǎn)染過表達(dá)SLC7A11 質(zhì)粒后，使用褪黑素處理，結(jié)果顯示，與褪黑素＋pcDNA組比較，褪黑素＋SLC7A11 組細(xì)胞死亡數(shù)目減少，細(xì)胞線粒體變大，線粒體膜密度減少，細(xì)胞內(nèi)GSH水平顯著升高，F(xiàn)e2+水平與ROS 水平降低，提示過表達(dá)SLC7A11 可逆轉(zhuǎn)褪黑素誘導(dǎo)的鐵死亡，表明褪黑素可通過抑制SLC7A11 表達(dá)誘導(dǎo)食管鱗癌細(xì)胞鐵死亡。另外，本研究荷瘤小鼠實驗顯示，使用褪黑素給予小鼠腹腔給藥治療后，腫瘤組織SLC7A11 蛋白表達(dá)水平升高，而裸鼠右側(cè)腋下注射SLC7A11 過表達(dá)質(zhì)粒（SLC7A11）的KYSE150 細(xì)胞后載給予褪黑素，小鼠腫瘤質(zhì)量與體積顯著升高，證實褪黑素可通過抑制SLC7A11 表達(dá)抑制腫瘤升高。

綜上所述，褪黑素通過抑制SLC7A11 表達(dá)，升高細(xì)胞內(nèi)Fe2+水平與ROS 水平，降低GSH 水平，誘導(dǎo)食管鱗癌細(xì)胞鐵死亡。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突