李和偉 魏國志 許飛飛

為探索評估固體面膜中花青素皮膚滲透適合的皮膚模型。本文以面膜中3 個花青素：飛燕草素-3-O- 半乳糖苷（Delphinidn-3-O-galactoside， DEGA）、飛燕草素3- O- 葡萄糖苷（Delphinidn-3-O-glucoside， DEGL） 和矢車菊素-3- O- 葡萄糖苷（Cyanidin-3-O-glucoside， CYGL） 為指標成分，以巴馬小型豬離休皮膚為皮膚模型材料，應用Franz 擴散池，以HPLC 法分別測定面膜中3 個花青素在不同時間點的皮膚表面殘留量、皮膚中滯留量和經(jīng)皮累積透過量。固體面膜貼敷20 min 后即拿掉面膜，12h 內(nèi)花青素在皮膚表面殘留量和皮膚內(nèi)滯留量仍較多，這能為花青素發(fā)揮抗紫外線和美白雙重功效提供化學基礎。貼敷12h 后，在透皮接受液中可少量檢測到3個花青素成分，這進一步確保了花青素成分可以達到皮膚較深的基底層。所以可得出，以巴馬小型豬離體皮膚作為透皮材料，同時檢測皮膚表面殘留量、皮膚內(nèi)滯留量和皮下經(jīng)皮透過量的評估方法是適合于評估花青素面膜雙重功效的研究模型。

關鍵詞：花青素；固體面膜；皮膚表面殘留量；皮膚內(nèi)滯留量；經(jīng)皮滲透

花青素是一類廣泛存在于植物中的天然水溶性色素，是花色苷水解而得有顏色的苷元，屬于黃酮類化合物[1]。

花青素具有多種生物活性，如抗氧化、延緩衰老、調(diào)節(jié)脂類和糖類代謝等[1]。此外，研究發(fā)現(xiàn)花青素中一些成分具有較強的皮膚美白作用。文獻報道[2]，矢車菊素-3-O- 葡萄糖苷在人體中的主要代謝產(chǎn)物（原兒茶酸） 通過抑制酪氨酸酶，可以有效減少皮膚黑色素的生成，從而實現(xiàn)美白皮膚的效果。矢車菊素-3-O- 葡萄糖苷、飛燕草素及其糖苷、牽牛花色素和二甲花翠素及其糖苷均能有效抵御紫外線輻射，防止皮膚細胞因紫外線輻射而發(fā)生氧化應激反應和凋亡[3，4]?；ㄇ嗨氐姆雷贤饩€和美白皮膚活性逐漸受到化妝品領域的青睞，一些面膜產(chǎn)品也開始加入植物花青素。

小型豬皮膚的各種生理屬性（主要包括皮膚厚度、脂質(zhì)含量、毛囊密度和酶活性） 和通透性被公認與人類皮膚最接近，歐盟委員會和世界衛(wèi)生組織（WHO） 等多個國際組織一致認定該模型為最理想的替代人類皮膚進行經(jīng)皮給藥研究的離體皮膚模型[5]。本研究采用巴馬小型豬皮膚模型評價面膜中花青素的經(jīng)皮滲透性。

本研究采用分層冷凍干燥技術制備固體花青素面膜，所使用植物花青素為歐洲越桔花青素提取物。在這個研究中，我們以3 個含量較高的代表性花青素DEGA、DEGL和CYGL 為指標成分，采用巴馬小型豬皮膚模型，建立一種評估面膜中花青素經(jīng)皮滲透的新方法，即同時測定不同時間點的單位皮膚表面殘留量、皮膚中滯留量和皮下透過量。具體研究過程如下：建立同時測定DEGA、DEGL和CYGL 分析方法并進行方法學驗證；以DEGA、DEGL 和CYGL 為指標，分別評估面膜貼敷20min 和12h 后面膜中3 個花青素成分在不同時間點單位皮膚表面殘留量，以及皮膚內(nèi)部滯留量和經(jīng)皮累積透過量。

01 儀器與材料

1.1 儀器

BSA2202（ 精度0.01g） 型，CPA225D 型（精度0.01mg）天平（賽多利斯公司）、LC-16 型高效液相色譜儀（日本島津公司）、SPD-16 型紫外檢測器（日本島津公司）。TT-B（D） 型Franz 透皮試驗儀（天津市正通科技有限公司）；800D-1 型離心機（常州天瑞儀器有限公司）；F6/10 型電動均漿機（上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司）。

1.2 材料

花青素面膜（批號WB-HQS-220804），常州偉博海泰化妝品有限公司研制；矢車菊素-3- O- 葡萄糖苷對照品（純度：99.5%，壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司）; 飛燕草素-3-O- 半乳糖苷（純度≥ 99%，上海詩丹德標準技術服務有限公司）; 飛燕草素3- O- 葡萄糖苷（純度≥ 99%，美國ChromaDex 公司）；Luna C18 色譜柱（Phenomenex公司）；FiveEasy Plus 型 pH 計（梅特勒- 托利多儀器有限公司）；BIO-DL 型移液槍（賽多利斯公司）；濾膜（0.22μm，天津津騰公司）；色譜純乙腈（Fisher 公司）；實驗用水為超純水（杭州娃哈哈集團有限公司）；95% 酒精，生理鹽水，磷酸二氫鉀，磷酸為分析純（北京化工集團股份有限公司）。

1.3 動物

巴馬小型豬[ 合格證號：SCXK（蘇）2022-0013，泰州泰和生物科技有限公司，雄性，日齡30，體重2.5 ～ 3.5 kg]。

02 方法與結(jié)果

2.1 HPLC 測定3 個花青素的含量

2.1.1 色譜條件

色譜柱為C18（4.6 mm150 mm，3.0 μm）；流動相A為87% 乙腈：3% 水：10% 甲酸， 流動相B 為50% 乙腈：40% 水：10% 甲酸，梯度洗脫程序：0～20min， 2%～14% A;20～25min， 14% A; 25～35min， 14%～30%A；流速 0.8mL/min；柱溫 30℃，檢測波長 520nm；進樣量 20μL。

2.1.2 對照品溶液制備

精密稱取DEGA、DEGL 和CYGL 對照品各約10 mg，加入2% 甲酸- 甲醇溶液溶解并定容于10mL 棕色量瓶中，搖勻，即得濃度約為1.0mg/mL 的混合對照品儲備溶液，備用。

2.1.3 線性關系考察

用移液槍分別量取不同體積的對照品溶液，再加入2% 甲酸- 甲醇溶液進行稀釋，搖勻，配制成質(zhì)量濃度分別為100、50、5、2.5、1.0、0.10μg/mL 的系列對照品溶液。分別吸取上述各濃度對照品溶液各20 μL 依次注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定，以對照品濃度為橫坐標（X ），峰面積為縱坐標（Y ），繪制標準曲線，得DEGA 回歸方程為Y ＝ 5.62E +04X -2.02E +04，r ＝ 0.9997; DEGL 回歸方程為Y ＝ 5.14E +04X -2.37E +04，r ＝ 0.9996; CYGL 回歸方程為Y ＝ 4.4E +04X -1.35E +04，r ＝ 0.9998。結(jié)果表明，DEGA、DEGL 和CYGL 的線性濃度分別為0.10 ～ 99.7μg/mL、0.11 ～ 106.3 μg/mL 和0.10 ～ 102.7μg/mL。

2.1.4 精密度試驗

取混合對照品（約5μg/mL） 溶液 20 μL，分別于同1d 之內(nèi)連續(xù)進樣測定6 次，并在6d 之內(nèi)連續(xù)進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果顯示3 個對照品溶液日內(nèi)精密度RSD分別為1.21%、1.02%、1.71%，日間精密度RSD 分別為2.66%、1.95%、2.24%。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗

精密量3 份取供試品溶液（豬皮表面殘留樣品，豬皮內(nèi)滯留樣品和接收液樣品） 各20μL，避光放置在室溫條件下，分別于0、1h、2h、4h、8h、24h 測定峰面積，結(jié)果顯示峰面積RSD 分別為1.90%、2.63% 和1.68%，表明供試品溶液在室溫條件下24h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.6 回收率試驗

取空白巴馬小型豬新鮮豬皮3.14cm2，剝離角質(zhì)層，量取混合對照品溶液（5μg/mL） 涂抹于豬皮表面，加入2% 甲酸- 甲醇超聲，提取2 次，每次10.0mL，合并提取液，5000 轉(zhuǎn)離心10min， 上清液0.22μm 濾膜過濾；將剪碎的豬皮膚中加入混合對照品溶液（5μg/mL），再加入2% 甲酸- 甲醇超聲，提取2 次，每次10.0mL 水，合并提取液，5000 轉(zhuǎn)離心10min， 上清液0.22μm 濾膜過濾；在已知濃度（2.5μg/mL） 的pH3.0 磷酸鹽緩沖液中按1：1 比例分別加入對照品溶液。每個樣品平行制備3 份供試品，按“2.1.1” 項下色譜條件測定，計算回收率。3 個樣品中3 個對照品回收率范圍為分別為98.7% ～ 101.9%、98.6% ～ 101.3%、99.9% ～ 101.6%，RSD 值均小于3.0%。

2.1.7 專屬性試驗

取供試品溶液，混合對照品溶液、陰性樣品（空白接收液和豬皮提取液），按“2.1.1” 項下色譜條件檢測，記錄色譜圖（ 圖1）。對照品峰形良好，供試品與對照品在相應位置上存在相同峰，且陰性樣品溶液對測定結(jié)果不產(chǎn)生干擾。

2.2 離體豬皮透皮試驗

2.2.1 離體豬皮制備

巴馬小型豬處死后立即剪取腹部皮膚，剝離皮下脂肪和結(jié)締組織，用95%酒精棉球反復擦拭皮膚表面，再用生理鹽水沖冼干凈，濾紙吸干水分，備用。

2.2.2 試驗步驟

參考文獻方法[6，7]，應用Franz 透皮試驗儀進行透皮試驗，水浴溫度為370.5° C，攪拌速度為100r/min，擴散池暴露的皮膚面積為3.14cm2， 接收池體積為12mL，接收溶液為pH3.0 磷酸鹽緩沖液。將面膜剪成3.14cm2 小塊，貼敷于皮膚，固定在接收池上，儀器避免直接暴露在陽光下，開始試驗。皮膚表面殘留樣品：分別于面膜貼敷后0.25h、0.5h、1h、2h、4h、8h、12h 后 （ 貼敷面膜12h 和貼敷20min 后去除面膜試驗），取下面膜，用棉球擦拭干凈皮膚表面殘留物，再用3 只棉球分別蘸2% 甲酸- 甲醇溶液擦拭皮膚表面3 次，然后將這些棉球放在2% 甲酸- 甲醇溶液中超聲提取，冷卻置室溫，定容置10mL。為了減少實驗誤差對結(jié)果的影響，每個時間點平行6 份。皮膚內(nèi)滯留樣品：分別取經(jīng)0.25h、0.5h、1h、2h、4h、8h、12h 透皮吸收后的豬皮膚，用濾紙吸干吸收液，去除皮膚表面殘留的面膜（方法同），將皮膚剪碎，在勻漿機內(nèi)加入10mL 2% 甲酸- 甲醇溶液進行勻漿處理，離心，取上清2mL，每個時間點平行3 份。皮下接收液樣品：試驗開始后，分別于0.25h、0.5h、1h、2h、4h、8h、12h 取接收液0.5mL，取樣后向接收池內(nèi)補充同體積接收液。所有樣品溶液經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，待測。

2.3 數(shù)據(jù)分析

單位面積皮膚上面膜中花青素皮膚表面殘留量和皮膚內(nèi)滯留量，按如下公式（1） 計算：

2.4 豬皮膚模型中3 個花青素殘留量、滯留量和滲透量（面膜貼敷12h）

圖1 顯示了花青素面膜在豬皮膚模型中貼敷12h 時，DEGA、DEGL和CYGL 在豬皮膚表面殘留量、豬皮膚內(nèi)滯留量和接收液中經(jīng)皮透過量測定結(jié)果。結(jié)果顯示，3 個花青素成分從面膜中釋藥到皮膚表面速度較快，4h 時3 個成分在單位皮膚表面殘留量Qr1 基本達平（圖2A）； 3 個花青素成分從面膜中透過角質(zhì)層進入皮膚內(nèi)速度較慢，單位面積皮膚內(nèi)滯留Qr1 需要8h 才能達峰（圖2B）；相比較而言，3 個花青素成分經(jīng)皮透過進入接受液的速度更慢，12h 的Qt1 也未達峰。研究結(jié)果表明，面膜中3 個花青素成分在4 h 基本從面膜中釋放完全；8h 皮膚中3 個成分駐留量遠高于經(jīng)皮滲透量，分別達到5.0、4.6倍和4.8 倍。

2.5 豬皮膚模型中3 個花青素殘留量、滯留量和滲透量（面膜貼敷20 min 去除）

面膜實際使用的貼敷時間一般為20min 左右， 因此我們進一步研究了面膜貼敷20min，然后去除面膜，面膜中花青素成分在豬皮膚表面殘留量、豬皮膚內(nèi)滯留量和接收液中透過量測定結(jié)果。如圖3A 所示，去除面膜之后約2h 后，豬皮膚表面的3 個花青素成分Qr1 基本停止下降，這表明3 個花青素成分在面膜去除之后2h 基本不再能透過皮膚表面角質(zhì)層了，并且2 ～ 12h 內(nèi)3 個花青素成分在皮膚表面殘留量基本保持不變。如圖3B 所示，在去除面膜的前2h，皮膚中滯留的花青素逐漸上升；相反，在2～12h，皮膚中滯留的花青素緩慢下降，表明花青素成分逐漸進入皮下接收液，12h 花青素成分在皮膚中仍有較高的滯留量。如圖3C 所示，3 個花青素成分經(jīng)皮透過Qt1隨時間逐漸增加， 但12h 三個花青素的累積透過量也分別僅為皮膚中滯留量的20%、23% 和27%。

03 討論

在這個研究中，我們首先建立花青素面膜中3 個花青素DEGA、DEGL 和CYGL 同時測定的分析方法，并進行了方法學驗證。然后，我們采用巴馬小型豬皮膚為經(jīng)皮透過模型，測定花青素面膜在分別貼敷12h 和20min 時，3個花青素成分于不同時間點在皮膚表面殘留量、皮膚中滯留量和皮下的透過量時間曲線，為指導花青素面膜的開發(fā)提供評估方法。

3.1 評估方法中花青素指標成分選擇

文獻報道的歐洲越桔中含有的花青素成分有15個[8，9]，其中DEGA、DEGL 和CYGL 不僅是歐洲越桔中含量最高的3 個成分[8]，而且文獻報道這3 個成分具有皮膚美白和抗紫外線的活性[2-4]。因此，我們選擇這3 個花青素單體作為指標成分來評估我們研制的花青素面膜。

3.2 花青素的穩(wěn)定性

花青素類成分在pH 大于3 的溶液中穩(wěn)定性較差，并且最大吸收波長也會發(fā)生變化[10]?？紤]到pH 值對花青素的穩(wěn)定性影響較大，我們在透皮試驗時接收液的pH 設置為3.0 的磷酸鹽緩沖液。在避光條件下，花色素在溶液中24h 內(nèi)是可以穩(wěn)定，因此我們在實驗中盡量將透皮接受儀置于避免日光直曬的環(huán)境下。實驗研究中也發(fā)現(xiàn)，豬皮表面殘留的細菌可能會導致花青素成分降解，因此，我們在處理豬皮時采用95% 酒精棉球反復擦拭，再用生理鹽水反復沖洗的處理方式，這樣可以避免花青素接觸豬皮時被細菌降解。

3.3 面膜貼敷時間對花青素在皮膚表面殘留量、皮膚中滯留量和皮下透過量的影響

面膜貼敷12h 是為了獲得面膜中花青素成分在皮膚表面、皮膚中和皮下透過的更完整數(shù)據(jù)。研究面膜貼敷20min 是為了觀測實際使用時間下花青素成分在皮膚3個部位的釋放或透過情況。面膜貼敷20min 時，DEGA、DEGL 和CYGL 能從面膜中釋放一定數(shù)量（圖2A）。因此，面膜在實際使用中貼敷20min 是可以在皮膚表面獲得一定水平的花青素成分的。貼敷20min 后即拿掉面膜，皮膚表面花青素只能持續(xù)約2h 滲透進入皮扶（圖3A），這可能是由于2h 之后面膜中殘留在皮膚上的水分和其他基質(zhì)成分已經(jīng)揮干，因而不利于花青素成分繼續(xù)滲透進入皮膚。12h 時皮膚表面仍然有較大量花青素殘留，這說明花青素面膜對于皮膚抗氧化和防紫外線是可以起到保護作用的。

相比貼敷12h， 貼敷20min 后即拿掉面膜，皮膚內(nèi)花青素的滯留量下降約為50%（以8h 為點計算）。盡管花青素皮膚內(nèi)滯留量下降，但皮膚內(nèi)仍存有大量花青素，這為面膜中花青素成分到達基底層，作用于黑色素細胞，從而真正起到美白皮膚作用提供了化學基礎。通過測試皮下接收液中花青素的透過量，也間接確認花青素成分應該可以透過皮膚進入體循環(huán)，這為花青素成分能透過皮膚角質(zhì)層到達基底層發(fā)揮美白作用提供進一步數(shù)據(jù)支持。

3.4 本研究提供了一種評估花青素面膜的新模型

為了同時實現(xiàn)防紫外線和美白效果，需要在皮膚表面保留一部分花青素，同時讓另一部分花青素停留在皮膚內(nèi)部，并持續(xù)足夠長的時間。目前，多數(shù)文獻研究只是測定藥物在皮下接收液中透過量[11-13]，較少研究同時測定皮膚中滯留量和皮下透過量[14]。本研究以巴馬小型豬皮膚為經(jīng)皮透過模型，同時測定皮膚表面殘留量、皮膚中滯留量和皮下透過量，擬建立一種新的評估花青素面膜雙功效的皮膚評估模型。

綜上所述，本研究建立了一種全新的可用于評估花青素面膜抗紫外線和美白雙功效的皮膚評估模型。