張澤華 陳晨 嚴(yán)明強(qiáng)

千日菊作為一種分布廣泛的植物，在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域有諸多應(yīng)用研究，目前很少在護(hù)膚品的功效測(cè)試中研究。本文采用高效液相色譜法測(cè)定了千日菊提取物（Acmella Oleracea Extract，AOE）的部分主要成分，用神經(jīng)肌肉共植體模型測(cè)試AOE 對(duì)肌肉收縮的抑制作用。用神經(jīng)肌肉共植體上重構(gòu)皮膚模型測(cè)試AOE 對(duì)肌肉收縮的抑制作用。進(jìn)而設(shè)計(jì)志愿者人體測(cè)試，測(cè)試AOE 對(duì)于人體皮膚的即時(shí)和長效抗皺效果，結(jié)果表明，AOE 可以減少皮膚皺紋。用免疫熒光法測(cè)試AOE 對(duì)TRPV1 的抑制作用，結(jié)果表明，1%AOE 即對(duì)TRPV1有很好的抑制作用。

關(guān)鍵詞：千日菊；千日菊酰胺；神經(jīng)肌肉共植體；志愿者測(cè)試；抗皺 TRPV1；舒緩

隨著護(hù)膚品行業(yè)的持續(xù)發(fā)展，植物提取物憑借綠色背景，已然受到消費(fèi)者熱愛[1，2] 。

但市場(chǎng)對(duì)植物提取物護(hù)膚功效的擔(dān)憂，主要在于很少有植物提取物產(chǎn)品能明確界定其功效成分，而來源于經(jīng)驗(yàn)的功效討論又缺乏系統(tǒng)的理論支撐及實(shí)際驗(yàn)證。如果植物提取物既有明確的主要功效成分，又有經(jīng)驗(yàn)證的護(hù)膚功效，無疑將具有巨大的應(yīng)用潛力！

千日菊（Acmella oleracea L./ Spilanthes acmellaLinn[3]） 是一種傳統(tǒng)食材，有強(qiáng)烈的辛辣氣味，有提神的作用，還有抗炎、抑菌、退熱、抗氧化、減肥[4] 等作用。但目前還少有公開的文獻(xiàn)報(bào)道千日菊提取物在護(hù)膚品中的綜合護(hù)膚功效。

千日菊中含有氨基酸、三萜、豆甾醇、蜂蠟醇和生物堿，特別是富含N - 烷基酰胺[5]。Shama 等人指出由于烷基酰胺的存在，使得千日菊具有抗炎、抑菌、抗氧化、收斂的作用，并指出烷基酰胺的存在使該植物可用于食品和化妝品[6]。Huang 等的文獻(xiàn)指出，千日菊中的Spilantho（l 千日菊酰胺）具有抗炎、抑菌、鎮(zhèn)痛的作用[7]。

Monroe 等的文章指出，千日菊的花、葉、莖提取物中含有Spilanthol[8]。 Boonen 等的文章指出千日菊提取物中最多的酰胺是Spilanthol[9] （ 千日菊酰胺）。文獻(xiàn)[10，11] 指出，千日菊含多種烷基酰胺，其中最重要的是千日菊酰胺，具有鎮(zhèn)痛功效。因此，本文驗(yàn)證千日菊提取物中的主要功效成分——千日菊酰胺（Spilanthol），并測(cè)試千日菊提取物在神經(jīng)肌肉共植體、神經(jīng)肌肉共植體上重構(gòu)皮膚、人體皮膚測(cè)試中的抗皺功效。

TRPV1 為辣椒素受體，激活后會(huì)導(dǎo)致鈣離子內(nèi)流，進(jìn)而誘發(fā)神經(jīng)反應(yīng)，出現(xiàn)灼燒等感覺，因此抑制TRPV1 表達(dá)可以起到舒緩的作用。

設(shè)計(jì)體外測(cè)試試驗(yàn)，測(cè)試千日菊提取物對(duì)TRPV1 的抑制作用，從而測(cè)試其舒緩功效。

01 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

千日菊提取物[ 溶劑為1，3- 丙二醇、水，原料來自法國嘉法獅（GATTEFOSSE）].千日菊提取物中文INCI： 千日菊[（ACMELLA OLERACEA）提取物]。

高效液相色譜（HPLC） 儀（Waters E2695）。

微型神經(jīng)肌肉共植體24 孔板（Expertise Technologies）。

重構(gòu)皮膚BETskin DE（Expertise Technologies）。

FOITS（人體皮膚快速光學(xué)造影測(cè)量設(shè)備） 系統(tǒng)，辨識(shí)度10μm。

3D 表皮皮膚模型（EpiKutis?）（ 博溪生物），EpiGrowth培養(yǎng)液（博溪生物）、PBS（博士德）、TRPV1 抗體（Abcam）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 千日菊活性成分測(cè)定

高效液相色譜儀分析千日菊酰胺含量。采用RP18 反相分離柱，柱溫40℃；紫外吸收檢測(cè)器，檢測(cè)器檢測(cè)波長240nm；流動(dòng)相采用乙腈/ 水（50/50），測(cè)試時(shí)檢測(cè)樣品用流動(dòng)相1/3 稀釋，進(jìn)樣量10μL。

1.2.2 千日菊提取物在神經(jīng)肌肉共植體的功效測(cè)試

采用運(yùn)動(dòng)神經(jīng)和橫紋肌共植體。用E x p e r t i s eTechnologies公司制備的培養(yǎng)成熟的微型神經(jīng)肌肉共植體24孔板。

神經(jīng)肌肉收縮頻率的觀測(cè)：用連接攝像機(jī)的顯微鏡觀察并對(duì)肌肉收縮頻率計(jì)數(shù)（每次測(cè)量為30s 內(nèi)計(jì)數(shù)）。

觀察肌肉收縮的過程中，每次觀測(cè)至少選擇孔板上3個(gè)同類位點(diǎn)，當(dāng)有2 個(gè)位點(diǎn)測(cè)試顯示同向結(jié)果，則認(rèn)為測(cè)試效果可采信。測(cè)試模型用卡利普多作為正向標(biāo)的，二甲亞砜為負(fù)向標(biāo)的，驗(yàn)證顯示此方法所得結(jié)果為有效結(jié)果。

分別用0.6% 和1.2% 的千日菊提取物，作用于神經(jīng)肌肉共植體培養(yǎng)基，測(cè)試不同時(shí)間條件下的神經(jīng)肌肉的收縮頻率。于測(cè)試前24h 計(jì)量神經(jīng)肌肉收縮頻率，測(cè)試前再次計(jì)量神經(jīng)肌肉收縮頻率，將千日菊提取物注入培養(yǎng)基，于5min/1h/4h 觀測(cè)肌肉收縮頻率。觀測(cè)到完全的肌肉收縮抑制后，對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行清洗，清洗后于1h/4h/24h 觀測(cè)肌肉收縮頻率。

1.2.3 千日菊提取物在神經(jīng)肌肉共植體重構(gòu)皮膚模型的功效測(cè)試

采用Expertise Technologies 公司制備的重構(gòu)皮膚BETskin DE。

重構(gòu)皮膚經(jīng)過熒光劑皮膚滲透性測(cè)試，滲透性低于20%。測(cè)試中測(cè)試樣品在重構(gòu)皮膚表面涂敷，停留1h，然后移走重構(gòu)皮膚，觀測(cè)神經(jīng)肌肉共植體的肌肉收縮頻率（計(jì)量方法同1.2.2）。

分別以0.6% ，3.0% 的千日菊提取物用量進(jìn)行測(cè)試。

同步設(shè)置安慰劑參照對(duì)比組。

1.2.4 千日菊提取物護(hù)膚品的志愿者實(shí)體功效測(cè)試

志愿者經(jīng)過嚴(yán)格篩選，選取20 名志愿者，女性，年齡分布為38～50 歲，健康皮膚，有中到深度魚尾紋。排除孕期、備孕人員，排除超敏性、過敏性皮膚人員，排除糖尿病、哮喘患者。用含有千日菊提取物2% 的膏霜和平行安慰劑膏霜進(jìn)行單盲測(cè)試。受測(cè)者對(duì)2% 千日菊提取物的膏霜以及安慰劑進(jìn)行半臉對(duì)照，即某志愿者左右臉各用哪款產(chǎn)品隨機(jī)確認(rèn)。使用方法：每日兩次（早晚各一次），連續(xù)使用28天，期間用光柵投影分析儀測(cè)試D0、D1、D10、D20、D28的眼角魚尾紋情況。

用光柵投影分析儀所得數(shù)據(jù)分析皮膚粗糙度，數(shù)據(jù)測(cè)量中采用二次平均法取得有效統(tǒng)計(jì)數(shù)值。數(shù)據(jù)正態(tài)分布用Shapiro-Wilk 測(cè)試驗(yàn)證（閾值1%）。正態(tài)分布通過的數(shù)據(jù)經(jīng)t 檢驗(yàn)驗(yàn)證顯著性，正態(tài)分布未通過的采用WILCOXON檢驗(yàn)驗(yàn)證顯著性（活性物部分單尾檢驗(yàn)/參照樣雙尾檢驗(yàn)）。

1.2.5 測(cè)試千日菊提取物對(duì)TRPV1 的抑制作用

基于3D 表皮皮膚模型（EpiKutis?），測(cè)試千日菊提取物在1%、2%、5% 的濃度下，對(duì)TRPV1 蛋白的抑制作用。

以辣椒素CAP 刺激皮膚，設(shè)置空白組（無刺激），陰性對(duì)照組（有刺激），1，3 丙二醇組，陽性對(duì)照組（以反-4-叔丁基環(huán)己醇為陽性對(duì)照），測(cè)試組（1%，2%，5% 千日菊提取物用量），測(cè)試對(duì)TRPV1 蛋白的抑制作用。

按照測(cè)試條件以辣椒素和（或）測(cè)試樣品（或陽性對(duì)照）涂布于皮膚模型表面，置于CO2 培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2） 中孵育24h，然后用PBS 溶液清洗模型表面殘留的受試物。而后用4% 的多聚甲醛進(jìn)行固定處理，固定24h 后，將模型環(huán)切取下，進(jìn)行辣椒素受體（TRPV1）的免疫熒光檢測(cè)。重復(fù)3 次。

02 結(jié)果與討論

2.1 千日菊活性成分含量測(cè)定

所得物為水/ 丙二醇/ 千日菊提取物的混合物，其中千日菊提取物含量大于5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。對(duì)此產(chǎn)品進(jìn)行液相色譜分析，譜圖如圖所示。

液相色譜結(jié)果顯示，千日菊提取物中含有Spilanthol千日菊酰胺。

千日菊酰胺分子式為：

2.2 千日菊提取物在神經(jīng)肌肉共植體的功效結(jié)果

測(cè)量千日菊提取物作用于神經(jīng)肌肉共植體模型，0.6%和1.2% 的千日菊提取物所得測(cè)試結(jié)果如圖所示。

圖2 結(jié)果表明，千日菊提取物0.6% 用量，能在1h 內(nèi)將神經(jīng)肌肉共植體的收縮頻率從100%（未使用時(shí)的神經(jīng)肌肉共植體肌肉收縮頻率為100%） 降低到0，也就是肌肉收縮停止。在神經(jīng)肌肉收縮停止后，迅速洗去施用的產(chǎn)品?？梢杂^察到，神經(jīng)肌肉的收縮開始緩慢恢復(fù)，至洗去后1h，神經(jīng)肌肉的收縮恢復(fù)到接近初始未用產(chǎn)品時(shí)的收縮頻率。

而使用1.2% 的千日菊提取物，在5min 內(nèi)即可將神經(jīng)肌肉共植體的收縮頻率從100% 降低到0。而后迅速洗去施用產(chǎn)品，肌肉收縮仍顯示為靜止?fàn)顟B(tài)。測(cè)試開始4h，肌肉收縮開始緩慢恢復(fù)，至測(cè)試開始后24h，肌肉收縮恢復(fù)至接近初始未用產(chǎn)品時(shí)的頻率。

以上結(jié)果表明，千日菊提取物具有減少肌肉收縮的效果。而效果的持續(xù)性則極大依賴于施用劑量。1.2% 千日菊提取物用量，其單次施用的抑制效果可達(dá)24h。

2.3 千日菊提取物在神經(jīng)肌肉共植體重構(gòu)皮膚作用的功效結(jié)果

分別以0.6% 、3.0% 的千日菊提取物用量進(jìn)行測(cè)試。

同步設(shè)置安慰劑參照對(duì)比組，所得結(jié)果如圖所示。

圖3 結(jié)果顯示，0.6% 用量的千日菊提取物在施用后6h（此時(shí)已經(jīng)移走神經(jīng)肌肉共植體上的皮膚模型），肌肉收縮頻率降到最低值，為初始收縮頻率的28%。此后肌肉收縮開始緩慢恢復(fù)，至2h 恢復(fù)至接近初始收縮頻率。

3.0% 用量的千日菊提取物也在施用后6h 后達(dá)到最低值，此時(shí)肌肉收縮頻率為0，即肌肉收縮停止。此后肌肉收縮開始緩慢恢復(fù)，至24h 恢復(fù)至接近初始收縮頻率的60%。

同步安慰劑則對(duì)肌肉收縮沒有任何影響。

以上結(jié)果表明，在神經(jīng)肌肉共植體重構(gòu)皮膚上施用千日菊提取物，千日菊提取物的作用效果被大幅延緩。但同時(shí)被延緩的，還有肌肉收縮的恢復(fù)速度。

0.6% 含量的千日菊提取物，在6h 后將肌肉收縮頻

率降至最低（初始收縮頻率的28%），再經(jīng)將近24h，恢復(fù)到施用千日菊提取物之前的肌肉收縮頻率。比單純神經(jīng)肌肉共植體的作用速率延后5h。而3% 的千日菊提取物，使得24h 后肌肉收縮頻率只恢復(fù)到了未施用時(shí)的60%。

以上結(jié)果說明，重構(gòu)皮膚的存在，減緩了千日菊提取物的作用速度，同時(shí)也延長了千日菊提取物的效果持續(xù)的時(shí)間。

以上測(cè)試結(jié)果，說明千日菊提取物可以減少神經(jīng)肌肉共植體重構(gòu)皮膚的肌肉收縮，且具有很強(qiáng)的劑量依賴性。

千日菊提取物用量達(dá)到一定程度（如3% 以上） 后，神經(jīng)肌肉共植體上重構(gòu)皮膚所做的肌肉收縮測(cè)試，肌肉收縮在24h 后不會(huì)完全恢復(fù)。

2.4 千日菊提取物護(hù)膚品的志愿者實(shí)體功效測(cè)試

以15 名志愿者的測(cè)試數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

對(duì)魚尾紋位置的皮膚粗糙度進(jìn)行分析，所得結(jié)果如圖所示。

以上結(jié)果表明，在28d 的時(shí)間長度內(nèi)，含千日菊提取物的膏霜對(duì)眼角皺紋造成的總體粗糙程度有明顯改善，皺紋總體減少14.2%。這也印證了千日菊提取物抗皺功效的長期持續(xù)性。且千日菊提取物在第一天即取得統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的皺紋改善效果。

提取某志愿者眼角魚尾紋圖片如圖所示。

從以上結(jié)果可以看出，志愿者眼角部的魚尾紋情況有明顯視覺可見的改善。

2.5 千日菊提取物對(duì)TRPV1 的抑制作用

對(duì)空白對(duì)照組BC， 陰性對(duì)照組（刺激）NC，1，3 丙二醇組（3. 5%），陽性對(duì)照組[ 刺激及15.6μg /mL 反-4- 叔丁基環(huán)己醇（舒緩辣椒素刺激）]PC，1% 千日菊提取物，2%千日菊提取物，5% 千日菊提取物進(jìn)行測(cè)試。

進(jìn)行辣椒素受體（TRPV1） 的免疫熒光檢測(cè)，顯微鏡下拍照，采集圖片并分析。選取目標(biāo)蛋白TRPV1 染色顏色，用GraphPad Prism 軟件分析，分析熒光染色的TRPV1表達(dá)情況（綠色熒光），得到其相對(duì)IOD 平均值。用t-test方法分析結(jié)果相對(duì)NC 組的顯著性。

所得結(jié)果如圖6 所示。

結(jié)果顯示，1%、2%、5% 的千日菊提取物，相對(duì)陰性對(duì)照NC 組，都有很好的抑制TRPV1 的作用，其中1% 千日菊提取物對(duì)TRPV1 的表達(dá)抑制率達(dá)到61%。且相對(duì)NC組，測(cè)試結(jié)果t 檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)結(jié)果顯著。

結(jié)果表明， 排除成分中1，3 丙二醇的影響，千日菊提取物對(duì)TRPV1 的表達(dá)有顯著的抑制作用，且1% 千日菊提取物對(duì)TRPV1 的表達(dá)抑制作用已經(jīng)優(yōu)于PC 組。

03 結(jié)論

（1） 驗(yàn)證千日菊提取物含有酰胺成分——千日菊酰胺（Spilanthol）。

（2） 神經(jīng)肌肉共植體/ 神經(jīng)肌肉共植體重構(gòu)皮膚的肌肉收縮頻率測(cè)試說明：千日菊提取物可以減少肌肉收縮。

在神經(jīng)肌肉共植體重構(gòu)皮膚模型中，肌肉收縮頻率未達(dá)到100% 恢復(fù)，提示長期使用千日菊提取物將產(chǎn)生累積的減少肌肉收縮功效。

（3） 人體測(cè)試的即時(shí)測(cè)試結(jié)果和長期（28d） 結(jié)果表明，2% 千日菊提取物可以顯著減少皮膚的皺紋，降低皮膚粗糙度。且千日菊提取物減少皺紋的功效，具有即時(shí)性和長效性，可用于即時(shí)抗皺和長效抗皺護(hù)膚品。千日菊提取物2% 即可有良好的長效抗皺效果。

（4）1% 千日菊提取物即可對(duì)TRPV1 有顯著抑制作用，因此在皮膚舒緩方面可以有所應(yīng)用。

綜上所述，千日菊提取物是一款良好的即時(shí)和長效抗皺活性物，且有一定舒緩功效。