周艷 趙帥 白越

（1. 新鄉(xiāng)市婦幼保健院兒童康復(fù)科，河南 新鄉(xiāng) 453000； 2. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 新鄉(xiāng) 453000；3. 鄭州市兒童醫(yī)院康復(fù)中心七病區(qū)，河南 鄭州 450000）

新生兒缺氧缺血性腦?。℉ypoxic ischemic encephalopathy，HIE）是圍產(chǎn)期內(nèi)多種因素引起大腦供血、供氧不足導(dǎo)致的腦損傷，是圍生期常見的疾病之一，若未及時有效的治療干預(yù)，輕者會導(dǎo)致患兒出現(xiàn)學(xué)習(xí)障礙、輕癱、運動落后以及注意力缺陷等問題，重者可造成癲癇、腦性癱瘓、智力障礙等永久性神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙，嚴(yán)重時可危及患兒生命[1,2]。

針灸是中華民族的瑰寶，結(jié)合中醫(yī)理論知識和對穴位的認知，將針灸針采用一定的手法刺入穴位，再輔以捻轉(zhuǎn)與提插等針刺手法進行刺激，以促使氣血調(diào)和，經(jīng)絡(luò)暢通，以治療相關(guān)疾病[3,4]。針灸具有安全有效和不良反應(yīng)少等優(yōu)點，在腦梗死等心腦血管疾病中具有較好的治療效果[5,6]。針灸對新生兒HIE 治療過程中效果如何，目前你研究報道較少。本研究收集我院收治的46 例HIE 患兒，探討針灸療法輔助治療HIE 患兒的療效，又通過制備HIE 動物模型，探討針灸療法作用的分子機制，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

回顧性納入我院2018 年6 月至2020 年6 月新生兒科收治的重度或中度HIE 患兒，根據(jù)采用治療方案不同，分為常規(guī)治療組和聯(lián)合治療組，每組23 例。常規(guī)治療組患兒男18 例，女15 例；平均胎齡38.96±0.54 周；窒息程度：中度 19 例，重度4 例。聯(lián)合治療組患兒男16 例，女17 例；平均胎齡39.04±0.47 周；窒息程度：中度17 例，重度6 例。兩組患兒基本臨床資料均衡可比(P＞0.05)。本研究通過我院倫理委員會審批。

納入標(biāo)準(zhǔn)：符合HIE 的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，且經(jīng)頭顱CR 或MRI 確診；患兒均為重度或中度HIE；排除標(biāo)準(zhǔn)：存在先天性和遺傳性疾?。辉绠a(chǎn)兒、畸形兒和肺炎患兒。

1.2 實驗材料

7 d 新生小鼠來源于上海斯萊克實驗動物有限公司(許可證號：SCXK 京-2013-005)。半胱天冬酶-3（Caspase-3）、B 細胞淋巴瘤因子2（B cell leukemia iymphoma-2，Bcl-2）和Tubulin 小鼠的單克隆抗體來源于美國的Santa Cruz 公司；HRP標(biāo)記羊抗小鼠的二抗來源于杭州華安公司；TUNEL 染色試劑盒來源于南京諾唯贊生物科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.3 方法

1.3.1 臨床治療方法

兩組患者均接受HIE 綜合治療，包括控制顱內(nèi)壓、治療驚厥、高壓氧、維持正常通氣、維持良好的組織灌注、控制血糖濃度等。

常規(guī)治療組：給予腦活素2 mL，加入10%葡萄糖50 mL 靜脈點滴，Qd；丹參注射液1 mL，10%葡萄糖50 mL 靜脈點滴，Qd。

聯(lián)合治療組：在常規(guī)治療組基礎(chǔ)上采用針灸輔助治療。針灸治療方案如下：按照患兒的神經(jīng)損傷程度和損傷部位不同，針灸不同的穴位。智力發(fā)育遲緩的患兒主要針灸百會穴和四神聰穴；頸無力患兒主要針灸頸夾脊穴、大椎穴和天柱穴；腰部萎軟患兒針灸腎俞穴、腰夾脊穴和腰陽關(guān)穴；上肢癱瘓患兒主要針灸肩髎穴、肩髃穴、曲池穴、手三里穴、合谷穴和外關(guān)穴；下肢癱瘓的患兒主要針灸髀關(guān)穴、環(huán)跳穴、伏兔穴、陽陵泉穴、解溪穴和懸鐘穴；前臂內(nèi)旋和后伸患兒主要針灸肩前穴、肩貞穴和肘尖穴；拇指內(nèi)收的患兒主要針灸魚際穴；手腕下垂的患兒主要針灸外關(guān)穴、陽溪穴和陽池穴；足內(nèi)翻的患兒主要針灸昆侖穴和懸鐘穴；足外翻翻的患兒主要針灸太溪穴和三陰交穴；手指握拳的患兒主要針灸后溪穴、合谷穴和八邪穴；癲癇患兒主要針灸腰奇穴、鳩尾穴、申脈穴、內(nèi)關(guān)穴和照海穴；視覺障礙患兒主要針灸攢竹穴、球后穴、承泣穴和睛明穴；聽覺障礙患兒主要針灸角孫穴、聽會穴、聽宮穴和翳風(fēng)穴；語言障礙患兒主要針灸啞門穴、通里穴和廉泉穴。常規(guī)消毒，選取直徑為0.3 mm，長度為25 mm 毫針，背俞穴宜斜刺、淺刺，進針0.2～0.3 寸；其余部位刺入深度0.5～1 寸，不留針。Qd，10 d 為1個療程，治療3 個療程。

1.3.2 動物模型構(gòu)建

隨機將30 只ICR 小鼠分為針灸組、模型組和假手術(shù)組，每組10 只。假手術(shù)組僅在頸部正中做手術(shù)切口，分離但不閉合頸總動脈，不缺氧處理，起對照作用，未制作成缺氧缺血腦病動物模型。模型組和針刺組小鼠分離并閉合頸總動脈，然后給予缺氧處理，制作成缺氧缺血腦病動物模型。假手術(shù)組和模型組不做任何治療，而針刺組新生小鼠根據(jù)《實驗針灸學(xué)》中的針灸方法，采用無菌的針灸針在小鼠的第七頸椎和第一胸椎的棘突間的背部中央位置進行斜刺，留針20 min，Qd。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 臨床療效

療效評定參考《現(xiàn)代兒科學(xué)》中HIE 的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)評估療效。治療3 個療程后，患兒的呼吸基本恢復(fù)平穩(wěn)、意識基本恢復(fù)清晰、驚厥的次數(shù)明顯減少判定為顯效；治療3 個療程后，患兒驚厥和意識有一定改善，有較弱的反射，肌力有所改善判定為有效；治療3 個療程后，患兒的臨床癥狀改善程度未達到以上標(biāo)準(zhǔn)，或病情有惡化趨勢則判定為無效。顯效和有效率之和視為總有效率。

1.4.2 神經(jīng)營養(yǎng)因子水平

治療前和治療3 個療程后，采集兩組患兒的靜脈血，3000 r·min-1的速率離心大約10 min 后，分離血清，采酶聯(lián)免疫吸附法檢測患兒的神經(jīng)營養(yǎng)因子神經(jīng)元特異性烯醇化酶（Neuron specific enolase，NSE）和腦紅蛋白水平。

1.4.3 神經(jīng)行為檢測量表（Neonatal behavioral neurological assessment，NBNA）和格賽爾發(fā)展量表（Gesell）評分

治療前和治療3 個療程后，采用NBNA 量表測定患兒原始反射、行為能力、被動肌張力和主動肌張力等指標(biāo)變化。

總分40 分，分數(shù)越高，提示患兒的神經(jīng)功能發(fā)育得越好。采用Gesell 量表測定患兒的發(fā)育情況。滿分100 分。評分越低，表明患兒的發(fā)育缺陷越嚴(yán)重。

1.4.4 新生小鼠腦組織凋亡相關(guān)蛋白的表達

采用蛋白免疫印跡法檢測新生小鼠腦組織凋亡相關(guān)蛋白的表達。三組大鼠麻醉后進行處死，留取腦部組織100 mg，加入組織裂解液，冰上充分裂解后，15 000 r·min-1的速率進行離心約15 min后，取上清，測定總蛋白濃度。

另取25 μg 進行SDS-PAGE，并轉(zhuǎn)到PVDF膜上，采用濃度為5%的脫脂奶粉進行封閉，共2 h，再用一抗按照一定比例稀釋4 ℃孵育，然后用HRP 標(biāo)記的羊抗小鼠二抗在室溫下進行孵育，共2 h，采用PBST 進行3 次洗滌后，采用ECL 發(fā)光液處理，凝膠成像系統(tǒng)成像。

1.4.5 新生小鼠腦細胞凋亡水平

采用TUNEL 染色檢測新生小鼠腦細胞凋亡水平。

三組新生小鼠麻醉處死后，腦組織用石蠟包埋，切成5 μL，在二甲苯中進行5 min 的脫蠟，然后重新更換二甲苯，再次進行5～10 min 的脫蠟。放入無水乙醇中5 min，放入濃度為90%的乙醇中2 min。放入濃度為70%的乙醇中2 min，放入蒸餾水中2 min。加入不含有DNase 的蛋白酶K(20 mg·mL-1)，HBSS 進行3 次洗滌。添加適量的檢測液TUNEL，充分混勻后滴到載玻片上，在37°C 溫度下避光進行孵育60 min。HBSS 3 次洗滌，抗熒光的淬滅封片液進行封片后，采用熒光顯微鏡進行觀察、讀片。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0 進行分析。計數(shù)資料用n（%）表示，行χ2檢驗；計量數(shù)據(jù)采用（）表示，兩組數(shù)據(jù)比較采用獨立樣本t檢驗，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析。P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患兒療效比較

常規(guī)治療組患兒臨床治療總有效率（73.91%）明顯低于聯(lián)合治療組（95.65%）（P＜0.05）。

2.2 兩組患兒神經(jīng)營養(yǎng)因子比較

治療前，兩組患兒神經(jīng)營養(yǎng)因子NSE 和腦紅蛋白水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。治療后，兩組患兒神經(jīng)營養(yǎng)因子NSE 和腦紅蛋白水平低于治療前（P＜0.05），且聯(lián)合治療組患兒NSE和腦紅蛋白水平低于常規(guī)治療組（P＜0.05）。

表1 兩組患兒臨床療效比較（n（%），n=23）

表2 兩組患兒神經(jīng)營養(yǎng)因子比較（，n=23）

表2 兩組患兒神經(jīng)營養(yǎng)因子比較（，n=23）

注：與治療前比較，#P＜0.05；與常規(guī)治療組比較，*P＜0.05。

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2.3 兩組NBNA、Gesell 評分比較

治療前，兩組患兒NBNA 和Gesell 評分比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。治療后，兩組組患兒治療后NBNA 和Gesell 評分高于治療前（P＜0.05），且聯(lián)合治療組患兒NBNA 和Gesell 評分高于常規(guī)治療組（P＜0.05）。

2.4 新生小鼠腦組織凋亡蛋白表達水平

模型組新生小鼠腦組織Caspase-3 表達水平高于假手術(shù)組，而Bcl-2 表達水平低于假手術(shù)組（P＜0.05）。針灸組新生小鼠腦組織Caspase-3 表達水平低于模型組，而Bcl-2 表達水平高于模型組（P＜0.05）。

2.5 新生小鼠腦細胞凋亡水平

TUNEL 染色結(jié)果顯示，模型組新生小鼠腦組織凋亡水平高于假手術(shù)組（P＜0.05）。針灸組新生小鼠腦組織細胞凋亡水平低于模型組（P＜0.05）。

表3 兩組患兒NBNA、Gesell 評分比較（，n=23）

表3 兩組患兒NBNA、Gesell 評分比較（，n=23）

注：與治療前比較，#P＜0.05；與常規(guī)治療組比較，*P＜0.05。

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表4 三組小鼠Caspase-3 和BCL-2 蛋白表達比較（，n=10）

表4 三組小鼠Caspase-3 和BCL-2 蛋白表達比較（，n=10）

注：與假手術(shù)組比較，&P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

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圖1 TUNEL 染色分析假手術(shù)組、模型組和針灸組小鼠細胞凋亡水平

3 討論

HIE 發(fā)病機制較為復(fù)雜，多數(shù)研究顯示缺氧缺血會導(dǎo)致新生兒腦組織出現(xiàn)水腫，腦細胞無氧代謝能力增加，腦組織酸性代謝物大量產(chǎn)生，造成腦細胞損傷，細胞出現(xiàn)凋亡等現(xiàn)象，最終造成腦細胞的損傷。有效改善腦組織缺氧缺血狀態(tài)，降低腦組織細胞的凋亡水平，對于緩解和治療缺氧缺血性腦損傷，提高患兒并發(fā)癥和殘疾具有重要的意義。目前針對HIE 的輔助療法較多，包括亞低溫治療、高壓氧艙、水療撫摸和音樂療法等，對HIE 有一定療效[8-10]。

HIE 在中醫(yī)理論中屬于五軟、五遲和五硬范疇。針灸可采用針刺和艾灸方式作用于穴位，可起到陰陽調(diào)和、祛邪、扶正、疏經(jīng)、通絡(luò)等作用[11]。本研究發(fā)現(xiàn)在常規(guī)治療基礎(chǔ)上采用針灸治療后結(jié)果顯示，臨床治療有效率從73.91%提高至95.65%，表明針灸輔助西醫(yī)常規(guī)治療可提高HIE療效。NSE、腦紅蛋白可反映機體的神經(jīng)損傷程度，腦部神經(jīng)發(fā)生損傷時，NSE 和 腦紅蛋白水平顯著升高[12-13]。本研究顯示經(jīng)針灸輔助治療后可顯著下調(diào)神經(jīng)營養(yǎng)因子NSE 和腦紅蛋白水平，說明針灸對神經(jīng)功能具有保護作用。后續(xù)研究也證實針灸可顯著改善腦損傷程度，促進中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能發(fā)育，提示針灸對HIE 患兒的神經(jīng)細胞具有修復(fù)作用。

本研究在動物水平上進一步分析了針灸對新生小鼠HIE 腦部神經(jīng)的影響，結(jié)果顯示，針灸可降低新生小鼠HIE 腦部Caspase-3 蛋白表達，升高Bcl-2 蛋白表達，說明針灸可抑制新生小鼠HIE腦部細胞凋亡，TUNEL 染色液進一步證實，針灸可抑制新生小鼠HIE 腦部細胞凋亡，提示針灸對HIE 的治療作用時通過調(diào)控腦細胞的凋亡實現(xiàn)的。

綜上所述，針灸療法輔助治療HIE 患兒具有較好的臨床效果，基礎(chǔ)研究證實針灸通過激活神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌和抑制神經(jīng)細胞的凋亡，達到有效治療HIE 的目的。