王彬宇,張 敏,遲偉群 綜述,劉 禹 審校

哈爾濱醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院檢驗科,黑龍江哈爾濱 150000

類風濕關節(jié)炎(RA)是一種慢性自身免疫性疾病,特征是持續(xù)性的滑膜炎、全身炎癥反應和自身抗體的產生。炎癥反應和免疫紊亂是RA發(fā)病的重要原因,但RA確切的發(fā)病機制和病因尚未完全闡明[1]。早期診斷和治療RA可提高臨床療效,預防關節(jié)的不可逆損傷。然而當前對于RA的診斷往往在疾病后期,且存在靈敏度和特異度不足的問題。目前,RA的常用實驗室檢測指標包括紅細胞沉降率(ESR)、C反應蛋白(CRP)、類風濕因子(RF)和抗環(huán)瓜氨酸肽抗體(ACPA)等,而它們對于RA的診斷效果并不理想。RF的靈敏度僅為49%～56%[2];ACPA的特異度可達95%,但靈敏度只有67%[3];ESR、CRP則缺乏特異性。因此,探尋新的RA生物標志物對于該病的早期診斷和治療至關重要。

目前,僅1.5%～2.0%的人類基因組編碼蛋白質,而75%～90%的DNA轉錄產生非編碼RNA[4]。非編碼RNA不通過編碼蛋白質影響機體狀態(tài),但其本身可參與RNA的轉錄修飾、細胞通路的信號調節(jié)等。作為RA病理機制中不可或缺的一部分,非編碼RNA與RA的起病、發(fā)展、治療、預后等密切相關,成為當下研究的熱點。本文通過分析近年來外周血單個核細胞(PBMC)非編碼RNA作為RA生物標志物的實驗研究進展,進而探討診斷RA的更多潛在標志物。

1 非編碼RNA與RA

非編碼RNA由tRNA、rRNA以及兩組調節(jié)性RNA[小非編碼RNA和長非編碼RNA(lncRNA)]組成。小非編碼RNA是一組長度小于200 nt的轉錄物,主要是微小RNA(miRNA)、小干擾RNA、與piwi蛋白相作用RNA(piRNA),還包括小核仁RNA和其他短RNA[5]。miRNA可以通過RNA干擾途徑誘導mRNA降解、翻譯或抑制,其表達失調可能與固有免疫、炎癥反應和細胞增殖等異常改變有關[6]。長度超過200 nt且缺乏蛋白質編碼潛力的RNA轉錄物被稱為lncRNA,它們具有多樣化的功能,如調節(jié)DNA合成,轉錄、翻譯RNA和保護基因組免受病毒DNA的傷害[7]。一些非編碼RNA是RA的特異性標志物,主要包括miRNA、lncRNA和環(huán)狀RNA(circRNA)。miRNA作為非編碼RNA是研究中的熱門領域,已經完全展現出其與RA病理特性的相關性,特別是miR-155、miR-221、miR-222等[8-9];有研究也證實了腫瘤壞死因子-α和異質核糖核蛋白L抗體相關免疫調節(jié)長非編碼RNA(THRIL)和lncRNA H19等與RA疾病進展相關[10-11];而circRNA相關研究中,被研究得最廣泛的是ciRS-7[12]。

2 PBMC在RA中的作用

PBMC主要包括淋巴細胞和單核細胞。淋巴細胞包含T淋巴細胞、B淋巴細胞、自然殺傷細胞等。單核細胞進入外周組織后會轉變?yōu)榫奘杉毎?巨噬細胞非特異性地吞噬并消化外來病原體、自身衰老細胞及腫瘤細胞。對于自身無法處理的病原體,巨噬細胞將其作為抗原呈遞給T淋巴細胞,T淋巴細胞再選擇性地分化為調節(jié)性T淋巴細胞或殺傷性T細胞,刺激B淋巴細胞分化、分泌抗體或直接殺傷病原體。PBMC相互協作構成機體免疫系統(tǒng)中重要組成部分。RA作為一種自身免疫性疾病,其病理機制與體液免疫、細胞免疫密切相關。KANE等[13]發(fā)現,PBMC上非整合層黏蛋白受體下調脂多糖誘導腫瘤壞死因子(TNF)-α的產生,該層黏蛋白被認為在RA的發(fā)病過程中起了關鍵作用;GOLINSKI等[14]進行的RA組與健康組的對照研究發(fā)現,RA組中T、B淋巴細胞上的Ras蛋白特異鳥苷酸核苷酸釋放因子(RasGRP)1被抑制,導致自身反應性CD4+T淋巴細胞的產生從而提高B淋巴細胞活性,而RasGRP3表達上升提高了B淋巴細胞對T淋巴細胞的敏感性。這兩種機制共同作用或許導致了RA的發(fā)生。此外,調節(jié)性T淋巴細胞與RA的病理機制也有相關性[15]。PBMC在RA的發(fā)生、發(fā)展和治療中都有重要作用,因而在RA生物標志物的分析中具有廣闊前景;同時,非編碼RNA廣泛參與轉錄調控,具有結構穩(wěn)定、對機體狀況反應迅速等優(yōu)勢,因此,研究PBMC非編碼RNA有望為臨床提供更具說服力與應用價值的生物標志物。

3 PBMC非編碼RNA作為RA生物標志物

近年來,以非編碼RNA作為生物標志物的研究有很多,但多數是針對血清或組織非編碼RNA的研究,而PBMC非編碼RNA的研究對于自身免疫性疾病——RA有特殊意義。例如:miR-155、miR-146a等可調節(jié)輔助性T淋巴細胞的分化與功能,影響炎性因子釋放[16];miR-155介導B淋巴細胞的成熟和抗體分泌;miR-548a-3p、miR-6089等作用于Toll樣受體影響PBMC的功能[17]。它們都參與了RA的病理過程。近年來有研究發(fā)現,miRNA在RA患者PBMC中的表達水平可以反映滑膜組織炎癥及損傷情況,對于某些沒有條件或不接受有創(chuàng)手術提取滑膜組織的患者,研究者可以提取PBMC進行替代[18]。

3.1PBMC中的miRNA與RA 在健康人群中,miR-221、miR-222可以調節(jié)血管生理功能,如血管生成、血管創(chuàng)面愈合、血管老化、動脈粥樣硬化、血管重構等。它們均來自一種重要的致癌基因,在動脈粥樣硬化、RA等炎性疾病中發(fā)揮著重要作用[19],但其在RA中的具體機制仍未探知。ABO EIATLA等[8]分析30例RA患者和20例無自身免疫疾病史的健康者PBMC中miR-221和miR-222的表達水平發(fā)現,RA患者2項指標的表達水平均升高且互為正相關并隨疾病活動度升高而升高,診斷RA的靈敏度分別為70%、80%,特異度分別為75%和70%。因此,下一步對它們進行聯合檢測將有助于RA的實驗室診斷。

miR-155被認為能調控固有和適應性免疫細胞的分化和激活,調節(jié)生發(fā)中心T淋巴細胞穩(wěn)態(tài),并可通過負調控轉錄因子PU.1從而促進B淋巴細胞增殖和抗體產生[20]。近期一項對67例RA患者、55例健康者、54例脊柱關節(jié)炎及相關結締組織病患者的對照研究結果顯示,RA患者PBMC中miR-155水平顯著升高,且通過抑制CCAAT增強子結合蛋白抑制M2型巨噬細胞分化,導致單核細胞中TNF表達上升,促進RA疾病進展[9]。

作為miRNA中龐大的分支,有研究已證實miR-29家族在骨關節(jié)炎、骨質疏松癥、心腎疾病以及免疫疾病群體中的差異表達及其作用機制[21]。近期REN等[22]發(fā)現,miR-29b在RA患者單核細胞中表達上升,差異倍數(FC)為2,通過抑制HMG盒蛋白1表達而抑制單核細胞凋亡,致使TNF-α分泌增加,進一步刺激miR-29b轉錄。這一正反饋網絡為研究RA的疾病發(fā)展機制又提供了一條思路。

miR-128-3p在各種組織、原代小鼠細胞、病理小鼠和人類血液標本中表達,影響血管平滑肌細胞的增殖、遷移、分化和收縮能力,受應激后表觀遺傳修飾的調控,證實其在疾病背景下的調節(jié)可用于治療目的[23]。XIA等[24]檢測發(fā)現,RA患者PBMC中miR-128-3p的表達水平上升(FC為4),經由TNF誘導蛋白3,激活T淋巴細胞和核因子(NF)-κB通路,增強炎癥反應。miR-128-3p可成為研究RA炎癥控制和治療的又一靶點。

靶向于視黃酸受體α的miR-146b在RA患者單核細胞中呈高表達(FC為2),且與視黃酸受體α基因表達水平呈負相關(r=-0.45),同時其轉錄過程中的水平在RA患者滑膜組織(FC為7.9)及滑膜液(FC為205)中顯著上升[25]。對miR-146b的深入研究可能預測RA對患者關節(jié)滑膜的損傷情況。

此前,miR-34a被證實通過與lncRNA及各種通路的相互作用,影響腫瘤增殖[26]、肝腎纖維化[27-28]等。KUROWSKA-STOLARSKA等[29]分析miR-34a在RA患者和健康人群PBMC中的表達水平發(fā)現,其在CD1c+樹突細胞中表達水平上升(FC為5),通過作用于酪氨酸蛋白激酶受體提高樹突細胞的活性,促進關節(jié)炎癥的發(fā)展。

PBMC中miRNA的表達水平變化有助于RA的早期診療及病情判斷。miR-221、miR-222、miR-155和miR-146b在RA的診斷中已展現出強大的潛力,而對miR-29b、miR-128-3p、miR-34a等的研究也不容忽視,PBMC中miRNA的表達水平與RA的發(fā)病機制有著緊密聯系,進行更深一步的探究有助于開發(fā)新的RA生物標志物。

3.2PBMC中的lncRNA與RA MOHARAMOGHLI等[30]發(fā)現,相較于健康人群,RA患者T淋巴細胞中生長抑制特異性基因(GAS)5水平上升了3.31倍,加工核糖核酸內切酶的線粒體RNA組分(RMRP)水平上升了2.43倍,THRIL水平上升了2.14倍。GAS5作為糖皮質激素受體的阻遏物,與受體的DNA結合域結合,并阻止其與DNA的相互作用[31],而糖皮質激素是治療炎性疾病最有效的藥物,GAS5的過表達可能導致包括RA在內的一些疾病對糖皮質激素的治療抵抗。這提示在免疫細胞中觀察到的GAS5水平增加有抑制糖皮質激素的作用,從而促進包括RA在內的自身免疫性疾病的發(fā)展。RMRP作為輔助性T淋巴細胞(Th)17中維甲酸相關孤核受體γt轉錄因子組裝和活性調節(jié)不可或缺的調控因素可有效促進Th17引起的炎癥反應,且RMRP水平與RA的病情嚴重程度呈正相關。THRIL與異質核核糖核蛋白L形成RNA-蛋白復合物,可調節(jié)先天免疫系統(tǒng)中TNF-α的表達,而TNF-α的表達與RA的病情進展密切相關。隨后的受試者工作特征(ROC)曲線分析也顯示GAS5[曲線下面積(AUC)=0.75]、RMRP(AUC=0.70)和THRIL(AUC=0.70)具有診斷RA的潛力。

lncRNA γ干擾素編碼基因反義RNA1(IFNG-AS1)作為γ-干擾素轉錄的關鍵因子,有研究發(fā)現,其在RA患者PBMC中呈高表達(FC為3),且與ESR(r=0.382 1)、CRP(r=0.475 1)、RF(r=0.511 8)、T淋巴細胞表達的T盒子轉錄因子(T-bet,r=0.692 3)水平呈正相關,敲除T-bet后IFNG-AS1水平呈明顯下降趨勢。這證明IFNG-AS1的轉錄依賴于Th1中T-bet的激活,進一步構建的ROC曲線分析證明了其診斷的有效性(AUC=0.815,靈敏度為53.33%,特異度為96.77%)[32]。

MESSEMAKER等[33]發(fā)現,C5T1 lncRNA在RA的PBMC中高表達,且在特異性免疫刺激下其表達水平進一步升高;同時,敲除C5T1 lncRNA會導致補體C5 mRNA水平下降,進而促進RA疾病進展。這展現了C5T1 lncRNA未來有作為RA診斷標志物的潛力。

ZHANG等[34]檢測65例RA患者和54例健康對照者PBMC中l(wèi)nc0640和lnc5150發(fā)現,RA患者PBMC中l(wèi)nc0640表達水平上升,而lnc5150表達水平下降,且這二者都與CRP水平相關,同時lnc5150表達水平與ESR相關,lnc0640和lnc5150可能通過絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)通路參與RA的病理過程。lnc0640和lnc5150表達水平與RA患者幾種臨床指征顯著相關,提示這些lncRNA可能被用作新的RA診斷標志物。

作為一種長鏈非編碼RNA,lncRNA的檢測相較于miRNA和circRNA更簡便、易行,在標本儲存、運輸過程中也更少降解,若能將其推廣到臨床應用,將會對RA早期診斷和治療有極大幫助,但其在實驗中也有低保守性、結構功能冗雜等缺陷,尚待未來進一步完善。

3.3PBMC中的circRNA與RA ciRS-7是一種內源性circRNA,具有封閉的環(huán)狀結構,可以作為miRNA海綿,在調控RNA轉錄、下游基因表達和蛋白質生成中起著至關重要的作用。此外,ciRS-7作為一種致癌基因,在各種類型的癌癥中通過競爭性抑制miR-7促進腫瘤進展[35]。TANG等[12]發(fā)現,在RA患者PBMC中ciRS-7表達水平上升(FC為5),增強的ciRS-7表達抑制了miR-7的功能,緩解了miR-7對哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的抑制作用,而人磷脂酰肌醇三羥基激酶/mTOR信號通路激活能導致RA患者滑膜成纖維細胞異常增殖,促進RA的病情進展;同時研究者評估了ciRS-7作為RA診斷標志物的有效性(AUC=0.766,靈敏度為77.8%,特異度為78.6%)。

circPTPN22被認為是一種新型的RA診斷生物標志物,并可能通過“海綿”作用參與RA的起病。JIANG等[36]驗證circPTPN22在42例RA患者、44例健康者和45例系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者中的表達發(fā)現,與健康者相比,circPTPN22在RA和SLE患者中表達水平均升高。ROC曲線分析提示,circPTPN22對區(qū)分RA患者、健康者及SLE患者具有鑒別診斷價值。此外,circPTPN22在RA PBMC中的水平與ACPA、RF、CRP等多種因素相關。隨后篩選了4個假定的miRNA(hsa-miR-3074-5p、hsa-miR-373-3p、hsa-miR-766-3p和hsa-miR-34c-5p),使用circPTPN22對其進行海綿吸附,結果顯示,與對照組相比,其在RA患者PBMC中的表達水平上調。

近年來微陣列表達譜在circRNA中的應用十分廣泛。LU等[37]通過微陣列篩選出149個表達水平上調和250個表達水平下降的circRNA,進一步行PCR篩選出差異表達上升最顯著的circRNA_101328(FC為-4),其診斷RA的靈敏度和特異度分別為95.2%、95.0%,基因本體數據庫分析發(fā)現,其機制可能與MAPK信號通路有關。

CHEN等[38]通過微陣列篩選出162個差異表達circRNA,挑選出其中一個來自X染色體的hsa_circ_0140271進行RA組(47例)與健康組(47例)的對照研究發(fā)現,其在女性RA患者PBMC中出現高表達(FC為2),而男性RA患者與健康者無異,構建ROC曲線發(fā)現,其對于RA與其他疾病的鑒別診斷更有意義(RA-健康組AUC=0.704,RA-強直性脊柱炎組AUC=0.922,RA-骨性關節(jié)炎組AUC=0.868),且其表達水平與炎性細胞因子水平相關。進一步分析顯示,hsa_circ_0140271可能通過調節(jié)脂肪酸代謝影響RA疾病進展。WEN等[39]通過實驗檢出hsa_circ_0001200、hsa_circ_0001566、hsa_circ_0003972和hsa_circ_0008360在RA組中高表達(FC分別為4、3、4、-8),且均與RA疾病活動度指標具有相關性,進一步生物信息學分析提示它們可能參與凋亡、自噬、免疫、炎癥反應、氧化應激等,而這些機制都與RA發(fā)生、發(fā)展有密切聯系。

關于circRNA在調節(jié)自身免疫和炎癥中的下游信號通路目前還知之甚少,未來需要進一步探討。相較于研究較為熱門及成熟的miRNA,通過靶向circRNA研究RA的診斷和治療具有更廣闊的前景。

4 小 結

非編碼RNA已成為許多科學領域的研究熱點,其在調節(jié)炎癥和自身免疫中的作用受到廣泛關注。而PBMC在自身免疫疾病中的作用也不容忽視:Th17/Treg細胞比例失衡導致機體炎性環(huán)境的產生,促炎的T淋巴細胞分泌更多炎性細胞因子,失控的B淋巴細胞產生大量自身抗體。同時PBMC因其內含的豐富而多樣的生物標志物及較為便捷的提取方法已被作為標志物及機制探究實驗中的重要研究對象。

目前,血清RF或ACPA陽性并不足以診斷RA。許多健康者RF和ACPA呈陽性,而它們在部分RA患者血清中呈陰性。此外,許多臨床表現為關節(jié)炎的患者,其實驗室診斷指標卻不符合RA的診斷標準。1987年美國風濕病學會提出的RA分類標準給出了7條建議,符合4條及以上者可診斷為RA,其靈敏度為39.1%,特異度為92.4%;2010年美國風濕病學會聯合歐洲抗風濕病聯盟提出的RA分類標準,將原標準改為了4條評分項目,累計評分≥6分可診斷為RA,其靈敏度為72.3%,特異度為83.2%[40]。在1987年的7條建議中,實驗室指標只有1項,而在2009年的標準中,增加了ACPA、CRP和ESR這幾個項目,實驗室指標在RA分類標準中的占比大大提高,雖然特異度小幅度下降,但靈敏度明顯提升。研究數據表明RA患者和健康者PBMC中的非編碼RNA水平存在差異,它們表達水平的變化不僅可用于RA早期診斷,還對RA的鑒別診斷、疾病活動度及嚴重程度的評估也具有重要價值。希望對RA新型標志物的研究能夠進一步改進疾病的分類標準。

未來的挑戰(zhàn)將是識別非編碼RNA調節(jié)免疫反應的機制,提供更多可能的診斷指標。探究非編碼RNA生物化學、結構及其相互作用,分析執(zhí)行非編碼RNA生物學功能的特定功能序列和結構域有助于揭示更多非編碼RNA相關機制。研究患者與健康者個體免疫細胞亞型或損傷組織中差異表達的非編碼RNA,有助于診斷RA。疾病相關的功能性非編碼RNA有作為疾病生物標志物和治療靶點的潛力,隨著研究的深入,它們有望作為RA診斷、療效觀察及預后的有效工具。