張朵朵， 牛鵬飛， 葛鑫禹， 古明輝， 劉永峰

（陜西師范大學 食品工程與營養(yǎng)科學學院，陜西 西安 710119）

超臨界流體萃取 (supercritical fluid extraction,SFE)是以超臨界流體(supercritical fluid, SCF)作為萃取劑，在超臨界條件下萃取固體或液體中高沸點或熱敏性成分的一項新型提取技術[1]；其中SCF 是處于超臨界溫度及壓力狀態(tài)下介于氣體與液體之間的流體（常用CO2氣體），此時的流體具有氣液兩重性、高滲透能力、低黏度、低密度及優(yōu)良的溶解能力。同時，SFE 技術具有操作溫度低、工藝簡單、高效且無污染的優(yōu)點，能最大程度保留食品的營養(yǎng)成分[2-3]。 目前，超臨界CO2萃取技術已經(jīng)廣泛應用于啤酒生產(chǎn)、蜂產(chǎn)品生產(chǎn)以及色素分離等方面，在油脂提取的生產(chǎn)中主要用于植物油脂的提取，在大豆油、核桃油提取方面已經(jīng)相對成熟；在動物油脂提取中主要應用于萃取不飽和脂肪酸質(zhì)量分數(shù)較高的油脂，例如深海魚油等[4-5]。 總之，超臨界CO2萃取技術目前主要應用于植物油脂及深海魚油的提取，鮮少在其他動物油脂中應用。

動物油脂以甘油三酯的形式存在，相較植物油脂有不可替代的香味，能提供極高的熱量且含有多種脂肪酸，進入人體后在小腸被分解為甘油和脂肪酸進行消化吸收[6]，脂肪酸的質(zhì)量分數(shù)和組成是影響油脂在人體內(nèi)消化吸收的關鍵。 動物油脂中的脂肪酸分為3 大類：飽和脂肪酸（satisfied fatty acids,SFA）、 單不飽和脂肪酸 （mono-unsaturated fatty acids, MUFA）和多不飽和脂肪酸（poly-unsaturated fatty acids, PUFA），SFA 質(zhì)量分數(shù)最高可達62.50%，其次是MUFA （質(zhì)量分數(shù)31.25%），PUFA 質(zhì)量分數(shù)僅為6.25%[7]。脂肪酸作為衡量動物油脂品質(zhì)的一個重要指標，提取方法對其組成和質(zhì)量分數(shù)有很大影響[8]，提取溫度過高會增加反式脂肪酸質(zhì)量分數(shù)、降低不飽和脂肪酸質(zhì)量分數(shù)，而超臨界CO2萃取技術不僅能克服溫度過高的問題，也能避免溶劑提取法中有機溶劑殘留的問題[9]。 王靜等對蠶蛹油脂的超臨界CO2萃取工藝進行了優(yōu)化，在最佳條件下油脂萃取率可達30.53%， 且所得油樣中游離脂肪酸較少，不飽和脂肪酸質(zhì)量分數(shù)高[10]。劉俊渤等研究了超臨界CO2萃取條件對鹿油萃取率的影響，在最佳萃取條件下，油脂的理化指標和脂肪酸組成的測定結果表明，超臨界CO2萃取的鹿油酸價低，含有多種脂肪酸，其中不飽和脂肪酸總質(zhì)量分數(shù)為41.94%[11]。劉程惠等將超臨界CO2萃取技術應用于大馬哈魚籽中DHA 和EPA 的提取， 結果表明，DHA 和EPA的提取率可達50%以上[12]。可見，超臨界CO2萃取技術有利于保持動物油脂的不飽和脂肪酸質(zhì)量分數(shù)以及營養(yǎng)品質(zhì)。

超臨界CO2萃取在動物油脂提取方面效果明顯，且對油脂品質(zhì)有不同程度的提高。 鑒于此，作者以羊肉為實驗材料，采用超臨界CO2萃取法提取羊肉油脂， 對比萃取前后羊肉中脂肪質(zhì)量分數(shù)的變化， 主要以脂肪酸的質(zhì)量分數(shù)及組成作為評價指標，探究了超臨界CO2萃取法獲得的羊肉樣品和羊肉油脂的品質(zhì)，旨在拓展超臨界CO2萃取技術在動物油脂提取方面的應用，為實際生產(chǎn)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

橫山羊肉：購自西安市朱雀農(nóng)貿(mào)市場；氯仿、石油醚、三氟化硼、甲醇、正己烷、甲醇、氫氧化鈉、氯化鈉等分析純試劑：西安晶博有限公司產(chǎn)品。

1.2 儀器與設備

SFE-2 超臨界CO2萃取裝置：美國應用分離公司產(chǎn)品；2010 ultra 氣質(zhì)聯(lián)用儀-單四極桿： 日本島津公司產(chǎn)品；SZC-D 脂肪測定儀： 上海纖檢儀器有限公司產(chǎn)品；RE-52AA 旋轉蒸發(fā)器： 上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市岸頭儀都儀器廠產(chǎn)品。

1.3 樣品處理

取冷凍羊肉置于冰箱冷藏室 （3±1） ℃中解凍12 h， 取出后置于室溫下完全解凍， 將解凍好的100 g 羊肉用搗碎機搗碎至肉糜狀， 取30 g 搗碎肉樣，平均分為3 組，用于超臨界CO2萃取，其余肉樣用于脂肪質(zhì)量分數(shù)和脂肪酸質(zhì)量分數(shù)測定。

1.4 超臨界CO2 萃取處理方法

樣品分為3 類：未處理肉即未經(jīng)超臨界CO2萃取的羊肉樣品；超臨界萃取肉即經(jīng)過超臨界CO2萃取后的羊肉樣品；超臨界萃取油即未處理肉經(jīng)萃取后收集的羊肉油脂。 采用超臨界CO2萃取裝置對羊肉脂肪進行萃取， 取10 g 未處理肉放入萃取釜中，密封系統(tǒng)，采用動態(tài)萃取方法，萃取溫度為40 ℃，壓力為25 MPa，萃取時間為120 min，在出口處用錐形瓶接取油脂，即為超臨界萃取油；超臨界萃取結束后，將萃取釜中的肉取出即為超臨界萃取肉。 將超臨界萃取肉和超臨界萃取油分別稱量，并密封于4 ℃保存。 按公式（1）計算羊肉油脂萃取率。

式中：p 為羊肉油脂萃取率，%；m1為超臨界萃取油質(zhì)量，g；m2為未處理肉質(zhì)量，g。

1.5 脂肪測定方法

1）浸泡、提取 稱取3 g 樣品置于濾紙筒，用脫脂棉壓住樣品， 將濾紙筒放入烘好的抽提筒內(nèi)，加入30 mL 石油醚， 然后將抽提筒移至加熱板上，打開冷凝管，調(diào)節(jié)脂肪提取儀溫度為55 ℃，使樣品完全置于抽提筒內(nèi)浸泡2 h，然后將抽提筒升高5 cm，抽提1 h。

2）回收溶劑 抽提結束后將濾紙筒完全提升，同時調(diào)節(jié)旋塞將冷凝管完全關閉， 進行溶劑回收，回收30 min。

3）烘干、稱量 將抽提筒從加熱板上取出，置于（105±1） ℃烘箱中烘至恒重，冷卻后稱取脂肪和抽提筒質(zhì)量，按公式（2）計算脂肪質(zhì)量分數(shù)。

式中：ω 為樣品中脂肪質(zhì)量分數(shù)，g/hg；m0為烘干抽提筒的質(zhì)量，g；m1為樣品質(zhì)量，g；m2為恒重后脂肪和抽提筒的質(zhì)量，g。

1.6 脂肪酸的測定

1.6.1 粗脂肪的提取 稱取未處理肉、超臨界萃取肉各3 g，超臨界萃取油0.3 g，分別放入150 mL 錐形瓶，加入60 mL 氯仿-甲醇溶液，充分攪拌，用保鮮膜封口后置于搖床振蕩5 h， 振蕩結束后放入40 ℃水浴30 min，再加入15 mL 飽和NaCl 溶液，待分層后取上層有機溶劑置于圓底燒瓶中旋轉蒸干，每個樣品重復3 次。

1.6.2 脂肪的皂化、 甲酯化 向燒瓶中加入6 mL 0.5 mol/L 氫氧化鈉-甲醇溶液， 上端連接冷凝管，67 ℃下皂化30 min，當溶液中有油滴漂浮時，加入沸石，從冷凝管上端口加入含有體積分數(shù)15%三氟化硼的甲醇溶液5 mL，15 min 后加入3 mL 甲醇，再15 min 后加入2 mL 正己烷，取下燒瓶，加入20 mL 飽和NaCl 溶液，劇烈振蕩15 s，繼續(xù)加飽和NaCl 溶液至瓶頸，待分層后吸取上層溶液放入1.5 mL離心管中，封存于-20 ℃。

1.6.3 脂肪酸氣相色譜分析 升溫程序：初始溫度120 ℃， 保持1 min，8 ℃/min 升到310 ℃， 保持5 min，汽化室溫度為260 ℃；進樣方式：不分流；載氣：氫氣[13]。脂肪酸甲酯的相對含量采用面積歸一法計算，通過測定相應峰面積占所有峰面積的百分數(shù)來計算樣品中某個脂肪酸占總脂肪酸的百分比，計算公式如下：

式中: Yi為試樣中某個脂肪酸的相對含量，%；Si為測定液中脂肪酸甲酯i 的峰面積；FFAi為脂肪酸甲酯i 轉化成脂肪酸的系數(shù)；∑Si為測定液中各脂肪酸甲酯的峰面積之和。

1.7 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用Excel 2010 軟件對數(shù)據(jù)進行處理及分析。 采用SPSS 19.0 軟件中Duncan’s 多重檢驗進行差異顯著性分析。 利用OriginPro 2015 軟件進行相關性分析， 用微生信繪圖網(wǎng)站（http://www.bioinformatics.com.cn/plot_basic_corrplot_corrlation_plot_082）繪制相關系數(shù)矩陣圖。

2 結果與分析

2.1 粗脂肪的測定結果

未處理肉及超臨界萃取肉中脂肪質(zhì)量分數(shù)及羊肉油脂萃取率測定結果見表1。 與未處理肉中脂肪質(zhì)量分數(shù)相比，超臨界萃取肉中脂肪質(zhì)量分數(shù)減少了19.25%。 此外，根據(jù)未處理肉質(zhì)量和超臨界萃取油質(zhì)量可知，超臨界萃取技術對羊肉油脂萃取率可達22.04%。

表1 未處理肉、超臨界萃取肉中脂肪質(zhì)量分數(shù)及羊肉油脂萃取率測定結果Table 1 Results of fat mass fraction and extraction rate of mutton fat in untreated meat and SFE-meat

2.2 SFA、MUFA、PUFA 相對含量的測定結果

未處理肉、 超臨界萃取肉和超臨界萃取油中SFA、MUFA、PUFA 相對含量的測定結果見圖1。 未處理肉中SFA 相對含量為48.99%，MUFA 相對含量為50.50%，PUFA 相對含量僅為0.52%。超臨界萃取肉中SFA 相對含量較未處理肉顯著降低 （P＜0.05）了11.37%，超臨界萃取油中SFA 相對含量與未處理肉無顯著差異 （P＞0.05）。 超臨界萃取肉的MUFA 相對含量顯著高于未處理肉（P＜0.05），提高了9.20%，而超臨界萃取油中MUFA 相對含量與未處理肉無顯著差異（P＞0.05）。未處理肉、超臨界萃取肉和超臨界萃取油之間PUFA 相對含量無顯著差異（P＞0.05）。 說明超臨界萃取處理可顯著降低超臨界萃取肉中SFA 的相對含量，也可顯著提高MUFA 相對含量，對PUFA 相對含量無明顯影響。

圖1 未處理肉、 超臨界萃取肉和超臨界萃取油中脂肪酸的相對含量Fig. 1 Mass fraction of fatty acids in untreated meat,SFE-meat and SFE-fat

未處理肉、超臨界萃取肉和超臨界萃取油中各脂肪酸相對含量比值見圖2。 未處理肉中P/S 為0.01，M/S 為1.03； 且3 個樣品P/S 值無顯著差異（P＞0.05）， 比值均遠小于膳食指南建議的比值1[13]。超臨界萃取肉的M/S 值顯著高于未處理肉 （P＜0.05），且其M/S 值最接近膳食指南的4∶3[14]；超臨界萃取油的M/S 值與未處理肉無顯著差異（P＞0.05）。

圖2 未處理肉、 超臨界萃取肉和超臨界萃取油中的脂肪酸比值Fig. 2 Proportion of fatty acids in untreated meat, SFEmeat and SFE-fat

2.3 脂肪酸相對含量的測定結果

在相同的GC-MS 條件下，未處理肉、超臨界萃取肉及超臨界萃取油中脂肪酸種類相同，分別是羊蠟酸（C10∶0）、月桂酸（C12∶0）、十三烷酸（C13∶0）、肉 豆蔻油酸（C14∶0）、十五烷酸（C15∶0）、棕櫚酸（C16∶0）、珠 光脂酸（C17∶0）、硬脂酸（C18∶0）、棕櫚油酸（C16∶1cis-9）、十七烯酸（C17∶1cis-10）、油酸（C18∶1cis-9）、亞油酸（C18∶2cis-9,12）和共軛亞油酸（C18∶2cis-9,trans-11），其中SFA 為8 種，MUFA 為3種，PUFA 為2 種。 并且，在未處理肉、超臨界萃取肉、超臨界萃取油中檢測出的脂肪酸種類與高天麗[15]、古明輝[16]等在羊肉中的檢測結果基本一致。

未處理肉、超臨界萃取肉及油中SFA 測定結果見表2。8 種SFA 中棕櫚酸相對含量最高，超臨界萃取肉和油的棕櫚酸相對含量顯著高于未處理肉（P＜0.05）， 超臨界萃取肉中棕櫚酸相對含量最高，為54.18%。 除棕櫚酸外，硬脂酸相對含量最高，且兩個處理組硬脂酸相對含量顯著高于未處理肉（P＜0.05），超臨界萃取油中硬脂酸相對含量最高， 為23.94%。SFA 中十三烷酸相對含量最低，且3 組之間無顯著差異（P＞0.05）。與未處理肉相比，超臨界萃取能夠顯著增加肉和油中棕櫚酸和硬脂酸的相對含量。

表2 未處理肉、 超臨界萃取肉和超臨界萃取油中飽和脂肪酸的相對含量Table 2 Relative content of saturated fatty acids in untreated meat, SFE-meat and SFE-fat

未處理肉、 超臨界萃取肉及超臨界萃取油中MUFA 測定結果見表3。 在未處理肉中油酸相對含量最高，為19.53%，而經(jīng)過超臨界處理后油酸相對含量顯著降低（P＜0.05），在超臨界萃取肉和超臨界萃取油中相對含量僅為1%以下。 與未處理肉相比，超臨界萃取肉和超臨界萃取油中棕櫚油酸相對含量顯著提高（P＜0.05），與未處理肉相比分別提高了61.00%和70.10%。 與未處理肉相比，超臨界萃取肉和油中十七烯酸的相對含量顯著降低（P＜0.05）。 以上結果說明超臨界處理對各種MUFA 的相對含量都有顯著影響，并且超臨界萃取肉和超臨界萃取油中均未檢測到反式油酸（C18:1trans-9），這說明超臨界萃取不會增加反式脂肪酸。

表3 未處理肉、 超臨界萃取肉和超臨界萃取油中單不飽和脂肪酸的相對含量Table 3 Relative content of monounsaturated fatty acids in untreated meat, SFE-meat and SFE-fat

未處理肉、 超臨界萃取肉及超臨界萃取油中PUFA 的測定結果見表4。 在超臨界萃取肉和超臨界萃取油中均未能檢測出亞油酸，但與未處理肉相比，亞油酸相對含量無顯著差異（P＞0.05）。 3 組間共軛亞油酸相對含量無顯著差異（P＞0.05），說明超臨界處理對共軛亞油酸相對含量無顯著影響。 此外，在脂肪酸相對含量測定中，粗脂肪提取本身就是一種提取脂肪的方法，因此在測定超臨界萃取肉中脂肪酸時已經(jīng)是第二次提取脂肪。 CO2在超臨界狀態(tài)下進入羊肉組織中將脂肪提取出來，此時羊肉內(nèi)部結構可能會變得不緊致，排列松散，測定脂肪酸時再對羊肉中的脂肪進行提取，由于羊肉內(nèi)部結構的變化可能會使羊肉脂肪提取更完全，這可能是造成超臨界萃取肉和未處理肉中SFA、MUFA 相對含量差異較大的原因。

表4 未處理肉、 超臨界萃取肉和超臨界萃取油中多不飽和脂肪酸的相對含量Table 4 Relative content of polyunsaturated fatty acid in untreated meat, SFE-meat and SFE-fat

2.4 脂肪酸相關性分析

13 種脂肪酸之間的相關性分析如圖3 所示。圖中圓的不同顏色代表各脂肪酸間相關系數(shù)從-1 到1，圓的大小代表相關系數(shù)的絕對值大小，圓越大相關系數(shù)的絕對值越大，即越接近1，代表各脂肪酸間相關性越大，每個圓上的數(shù)字表示兩種脂肪酸間的相關系數(shù)，正值代表正相關，負值代表負相關。 肉豆蔻油酸（C14:0）、棕櫚酸（C16:0）、硬脂酸（C18:0）和棕櫚油酸（C16:1cis-9）中任意兩種呈正相關；十七烯酸（C17:1cis-10）、油酸（C18:1cis-9）和共軛亞油酸（C18:2cis-9,trans-11）中任意兩種呈正相關；肉豆蔻油酸（C14:0）、棕櫚酸（C16:0）、硬脂酸（C18:0）和棕櫚油酸（C16:1cis-9）中的任意一種與十七烯酸（C17:1cis-10）、油酸（C18:1cis-9）和 共 軛亞油酸（C18:2cis-9,trans-11） 中的任意一種呈負相關； 十五烷酸（C15:0）和亞油酸（C18:2cis-9,12）呈正相關，而這兩種脂肪酸與上述所說的7 種脂肪酸均無明顯相關性，這說明在超臨界CO2萃取過程中這兩種脂肪酸相對含量穩(wěn)定，即超臨界處理對十五烷酸（C15:0）和亞油酸（C18:2cis-9,12）不會產(chǎn)生影響，這與顯著性分析的結果相一致。

圖3 未處理肉、超臨界萃取肉和超臨界萃取油中13 種脂肪酸相對含量的相關性分析Fig. 3 Correlation analysis of the relative content of 13 fatty acids in untreated meat, SFE -meat, and SFE-fat

2.5 討論

傳統(tǒng)提取動物油脂的方法有蒸煮法、溶劑法和索氏提取法等。 目前關于超臨界萃取技術應用于羊肉脂肪提取的研究鮮有報道，該研究所獲的提取率對于肉類以及動物組織脂肪的提取具有一定的參考價值。 陳穎娣等分別用索氏提取法、 超臨界CO2萃取法和微波提取法對蠶蛹油進行提取，并對比了3 種方法下的蠶蛹油提取率及油脂品質(zhì)， 結果發(fā)現(xiàn)超臨界CO2萃取法的萃取率最高， 可達31.43%，且萃取的油脂不會有溶劑殘留[17]。 林春梅等探究了超臨界CO2萃取蠶蛹油的最佳工藝條件，結果發(fā)現(xiàn)在最佳萃取條件下蠶蛹油的萃取率為19.20%[18]。 該研究中羊肉油脂萃取率與陳穎娣、林春梅等的蠶蛹油萃取率有差異，這可能是由于樣品本身的差異造成的，但總體上萃取率相差不大，這進一步說明了超臨界CO2萃取在羊肉油脂提取中具有可行性。

通過進一步的脂肪酸分析發(fā)現(xiàn)，超臨界萃取肉中SFA 較未處理肉變化明顯，棕櫚酸、硬脂酸的相對含量顯著提高， 但整體SFA 相對含量顯著下降。有研究表明，棕櫚酸和硬脂酸為羊肉中相對含量較高的SFA[19-20]，SFA 在人體中具有潛在的生理功能，但一般認為攝入過多的SFA 會使血液中膽固醇含量升高，而硬脂酸是SFA 中一個特殊的存在，硬脂酸在體內(nèi)可以轉換為油酸，不會影響血液中膽固醇的含量[20-21]。 研究發(fā)現(xiàn)膳食中棕櫚酸能降低血清中膽固醇的含量[22]。 因此，與未處理肉相比，超臨界萃取肉中SFA 的質(zhì)量分數(shù)和組成更符合營養(yǎng)健康需求。

超臨界萃取肉中MUFA 相對含量較未處理肉顯著提高，雖然超臨界萃取油中MUFA 相對含量無顯著變化，但其中棕櫚油酸相對含量顯著提高。 近年來已經(jīng)有研究證實MUFA 具有與PUFA 相同的降低血液中膽固醇的效果[23]，并且流行病調(diào)查顯示，日常膳食攝入MUFA 相對含量較高的人群患冠心病概率較低[14]，且其中棕櫚油酸已經(jīng)被證實具有改善肥胖癥、糖尿病和抗炎等多種生理功能[24]。高溫是產(chǎn)生反式脂肪酸的重要原因[25]，超臨界CO2萃取的溫度遠低于產(chǎn)生反式脂肪酸的溫度，相較于其他提取油脂的方法，萃取溫度低是超臨界CO2萃取的一大優(yōu)勢， 可以減少萃取過程中反式脂肪酸的生成。已有研究發(fā)現(xiàn)反式脂肪酸與心血管疾病的關聯(lián)性要遠大于SFA[26-28]，反式脂肪酸不僅會導致心血管疾病，還會誘發(fā)阿爾茲海默癥，影響肝組織結構，增加患糖尿病的風險[29-30]。 因此，與未處理肉相比，超臨界萃取肉和超臨界萃取油的品質(zhì)都得到了提高，且可降低有害物質(zhì)的產(chǎn)生。

超臨界萃取肉和油中均未檢測出亞油酸，這可能是由于亞油酸中的不飽和雙鍵不穩(wěn)定，在超臨界狀態(tài)下亞油酸轉變成共軛亞油酸。 共軛亞油酸是另一類重要的脂肪酸，同時含有共軛雙鍵和反式雙鍵[31]，使其具有抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化、預防糖尿病等作用[32]。 超臨界CO2萃取技術并沒有顯著降低超臨界萃取肉和油中PUFA 相對含量，這表明超臨界CO2萃取技術不會破壞羊肉中的PUFA。

3 結 語

通過超臨界CO2萃取技術對羊肉進行處理并對其脂肪質(zhì)量分數(shù)及脂肪酸組成進行研究。 結果表明羊肉油脂的萃取率可達22.04%，未處理肉中SFA和MUFA 的相對含量接近，遠大于PUFA。超臨界萃取肉和超臨界萃取油與未處理肉中脂肪酸差異較大，超臨界處理可改變羊肉中部分脂肪酸組分的相對含量， 使超臨界萃取肉中SFA 相對含量顯著降低，MUFA 相對含量顯著升高，對PUFA 相對含量無明顯影響。 而超臨界萃取對油中SFA、MUFA 和PUFA 三者的相對含量無顯著影響， 但其中棕櫚油酸的相對含量顯著增加；且超臨界處理不會增加反式脂肪酸。 因此，超臨界CO2萃取技術可以應用于羊肉油脂的提取，并且對羊肉和羊肉油脂的脂肪酸相對含量及組成有改善作用。 該研究對于超臨界CO2萃取技術在動物油脂中的應用具有一定的指導意義。