唐雅楠 葉賢濤 顧學(xué)范 余永國 肖 冰 孫 昱

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院 上海市兒科醫(yī)學(xué)研究所內(nèi)分泌遺傳代謝科（上海 200092）

Menke-Hennekam 綜合征（Menke-Hennekam syndrome,MKHK）是近年來新發(fā)現(xiàn)的常染色體顯性遺傳病，由CREBBP基因錯義雜合變異所致，2016年由Menke等[1]首次報道，迄今為止已報道了約30個病例、20 種CREBBP基因致病變異位點，變異均位于CREBBP基因的30 外顯子末端至31 外顯子首端（NM_004380.3: c.5128_5614）[1–6]。臨床表現(xiàn)為精神運動發(fā)育遲緩、不同程度智力障礙、矮身材、小頭畸形以及特殊面容（上斜眼瞼、內(nèi)眥距寬、塌鼻梁、短鼻、長人中、招風(fēng)耳、低耳位、小下頜等）。

Rubinstein-Taybi 綜合征（Rubinstein-Taybi syndrome,RSTS）是經(jīng)典的常染色體顯性遺傳病，其顯著臨床特征包括寬指/趾、矮身材，中至重度智力障礙、特殊面容（詭秘微笑，高拱眉、長睫毛、鷹鉤鼻、下斜眼瞼、高顎等）等[7–8]。RSTS由CREBBP基因的功能喪失（loss of function,LOF）變異（移碼變異、無義變異等）所致，變異廣泛分布于MKHK 變異區(qū)域以外的CREBBP基因區(qū)域。

CREBBP不同區(qū)域和類型變異導(dǎo)致的RSTS 和MKHK 均有發(fā)育遲緩、智力發(fā)育落后、小頭畸形等臨床特征，但特殊面容特征具顯著差異。目前對于RSTS 的臨床表型、基因型及致病機制均有較多報道，而對于MKHK 的研究較少，并且尚無中國病例的大規(guī)模報道。本文總結(jié)7 例CREBBP基因變異所致MKHK的臨床特征及基因變異特點，進一步擴大MKHK的臨床表型譜和基因變異譜。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2012—2022年就診于新華醫(yī)院內(nèi)分泌/遺傳科門診確診為Menke-Hennekam 綜合征的7 例患兒。診斷符合以下2條：①基因檢測，CREBBP基因雜合致病/可能致病變異且位于30外顯子末端至31外顯子首端區(qū)域（NM_004380.3: c.5128_5614）；②臨床表現(xiàn)，患兒具MKHK 特征性臨床表現(xiàn)（特殊面容包括上斜眼瞼、內(nèi)眥距寬、塌鼻梁、短鼻、長人中、招風(fēng)耳、低耳位、小下頜等）。

本研究獲得患兒監(jiān)護人的知情同意，并經(jīng)新華醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（No.XHEC-D-2023-028）。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 通過回顧門診、住院及隨訪資料或聯(lián)系患兒家屬獲得臨床數(shù)據(jù)，使用標(biāo)準(zhǔn)化表格收集整理信息，包括一般資料、臨床表現(xiàn)、出生與母孕史、家族遺傳史、實驗室檢查結(jié)果、影像學(xué)檢查結(jié)果、基因檢測結(jié)果等。患兒臨床表型由具有經(jīng)驗的兒內(nèi)分泌/遺傳科醫(yī)師進行評估，形態(tài)學(xué)評估標(biāo)準(zhǔn)參考文獻[9–18]。隨訪資料通過內(nèi)分泌/遺傳科門診復(fù)診或電話隨訪采集，隨訪周期不定，隨訪內(nèi)容包括患兒的身高、體重、精神運動發(fā)育情況及醫(yī)療問題等。

1.2.2 基因檢測方法 應(yīng)用EDTA 抗凝管抽取患兒及家長外周靜脈血2 mL 行核心家系外顯子組測序（Trio whole exome sequencing,Trio-WES）。采用全基因組DNA 提取試劑盒（Qiagen 公司，德國）提取DNA，用Covaris S220超聲破碎儀（Covaries公司，美國）將基因組DNA片段化為200 bp左右片段，用exome research panel（IDT公司，美國）進行捕獲，用Illumina NovaSeq 6000測序儀（Illumina公司，美國）對捕獲片段進行雙端測序（pair-end sequencing），測序片段長度為150 bp。測序產(chǎn)生的fastq數(shù)據(jù)用BWA比對到hg19參考基因組，按照GATK最佳實踐（v3）進行數(shù)據(jù)分析檢測變異。變異用vcfanno 和SNPEff進行注釋，排除人群數(shù)據(jù)庫中高頻變異，選擇錯義、無義、剪切位點、框移插入缺失及框內(nèi)插入缺失作為候選變異。候選變異參考美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）指南對變異位點進行致病性評估，利用Sanger 測序?qū)蚁颠M行基因變異驗證并判斷變異的來源。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料

7 例MKHK 患兒4 男3 女；平均就診年齡（2.6±1.7）歲；平均出生身長（48.8±2.3）cm，平均出生體重（2 548±369）g。除患兒2、4有宮內(nèi)發(fā)育遲緩?fù)猓? 例均無異常出生史，7 例均有產(chǎn)后發(fā)育遲滯。

7 例MKHK 患兒均以發(fā)育落后就診，為全面性發(fā)育遲緩，以運動及語言發(fā)育落后為主。存在多種表觀畸形，其中7例存在內(nèi)眥距寬、招風(fēng)耳、低耳位，6例存在眼瞼上斜、短瞼裂、塌鼻、長人中，均無多毛、高鼻梁和詭秘微笑。其余特殊表現(xiàn)見表1。

表1 7例Menke-Hennekam綜合征患兒臨床特征總結(jié)

7例患兒隨訪時長為2個月至4年，平均（11±16）月，末次隨訪日期見表1。末次隨訪時身高小于同年齡同性別兒童第三百分位數(shù)、體重低于同年齡同性別兒童第三百分位數(shù)均為6例（85.7%）。

2.2 基因型分析

7 例患兒的基因檢測結(jié)果顯示均攜帶CREBBP基因的雜合致病/可能致病變異，共涉及2種類型基因變異（6/7 錯義變異、1/7 不影響閱讀框的插入缺失），均為新發(fā)（de novo），其中2例攜帶c.5602C＞T（NM_004380.3）位點雜合變異。經(jīng)查詢HGMD、ClinVar及PubMed數(shù)據(jù)庫，c.5218C＞T與c.5225T＞A（NM_004380.3）既往文獻未報道過。根據(jù)ACMG遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)與指南，對7 例患兒的基因檢測結(jié)果進行變異致病性分析，共有5 例“致?。≒）”、2例“可能致病（LP）”，評析結(jié)果見表2。

表2 7例Menke-Hennekam綜合征患兒基因變異及致病性分析

結(jié)合臨床表現(xiàn)、家族基因測序及靶向測序驗證的結(jié)果，7例患兒均診斷為MKHK。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)2 例CREBBP基因新發(fā)錯義變異，c.5218 C＞T 及c.5225 T＞A，為國際上未報道的病例，屬于報道較少的MKHK 疾病的變異區(qū)域，豐富了CREBBP基因變異譜。MKHK的臨床表型異質(zhì)性強，無統(tǒng)一的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，需結(jié)合基因測序結(jié)果確定致病原因。目前尚無MKHK中國人群的大型報道，臨床醫(yī)師對此病認識可能不足，容易導(dǎo)致誤診和延遲診斷。

本研究7 例患兒攜帶的變異均位于CREBBP基因的30外顯子末端至31外顯子首端區(qū)域，且具有不同于RSTS 的特殊面容，本組病例雖然均屬亞洲血統(tǒng)，但仍與Menke等[1-2]于2016與2018年報道的疾病表型相近，支持MKHK診斷。既往文獻表明，變異位于c.5595_5614（NM_004380.3）區(qū)域的MKHK患者具較集中的特殊面容，表現(xiàn)為上瞼下垂（33%）、上斜眼瞼（58%）、短瞼裂（42%）、內(nèi)眥距寬（54%）、塌鼻梁（54%）、短鼻（50%）、前傾鼻孔（46%）以及長人中（50%），嬰兒時期的面容特征最顯著，隨著年齡增長疾病表型越不明顯[2]。本研究患兒4、5、6、7的基因變異位于該區(qū)域內(nèi)，且面容特征與文獻報道相符，進一步為該區(qū)域變異病例可能屬于MKHK獨特亞型提供臨床依據(jù)[2]。另外，相比于其他區(qū)域的MKHK 患兒，c.5595_5614 區(qū)域變異的患兒具更嚴(yán)重的視聽障礙（3/3聽力問題、3/3眼部問題），這一發(fā)現(xiàn)有待繼續(xù)收集病例提供證據(jù)支持。c.5357G＞A是文獻報道過的變異，同一堿基位點報道過的變異還有c.5357G＞C，相鄰區(qū)域變異還有c.5354G＞A[2,4]。文獻指出c.5354 及c.5357 位點變異的MKHK 患者具與RSTS 相似的特征[4]，如下斜眼瞼、長睫毛、禿鼻梁、寬鼻尖、高顎以及輕度寬指/趾等。本研究c.5357G＞A病例的特殊面容為前額突出、面頰飽滿、眼瞼下斜、眼距寬、寬鼻尖、牙齒不整齊、嘴唇上翻、小下頜，部分表型與上述研究[4]報道相近，需繼續(xù)收集更多病例以進行表型特征總結(jié)。此外本例患兒語言運動發(fā)育落后，經(jīng)康復(fù)訓(xùn)練后癥狀部分改善，也提示早期康復(fù)訓(xùn)練對于患者治療有指導(dǎo)意義?；純?、6 是本研究中有手指及腳趾畸形者，表現(xiàn)為并指及多趾。2018年Menke等[2]報道中C19病例也有手指皮膚并指表現(xiàn)，但他們都不具RSTS典型的大拇指寬及向橈側(cè)彎曲特征。

目前CREBBP變異導(dǎo)致RSTS的研究較為充分。RSTS 可由CREBBP雜合變異所致，約80%經(jīng)測序分析確定為基因內(nèi)的小缺失/插入、錯義、無義和剪接位點變異，約20%通過基因靶向缺失/重復(fù)分析確定為外顯子或整個基因缺失[8,19]。CREBBP基因編碼的蛋白是具有乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的轉(zhuǎn)錄共激活因子，以往研究表明CREBBP缺失可影響轉(zhuǎn)錄識別、降低乙酰化活性及破壞染色質(zhì)重組，繼而導(dǎo)致RSTS的發(fā)生[20-22]。與MKHK 相關(guān)的CREBBP基因變異研究主要與鋅指結(jié)構(gòu)域Zinc finger 2（1701-1744）及Zinc finger 3（1765-1846）相關(guān)，研究表明這兩個介導(dǎo)鋅離子結(jié)合的結(jié)構(gòu)域都包含半胱氨酸殘基，后者可穩(wěn)定蛋白螺旋折疊并介導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，c.5170G＞A（p.Glu1724Lys）的變異位點與ZNF2的第二個高度保守的半胱氨酸殘基(Cys 1723)相連，此變異導(dǎo)致的氨基酸改變引起靜電勢差，可能對蛋白質(zhì)相互作用產(chǎn)生重要影響[3]，進而解釋MKHK的病理機制。

綜上，本文報道了CREBBP基因的6個新發(fā)變異，其中2 個既往未報道過，進一步擴大了MKHK 的基因變異譜。由于MKHK臨床表型異質(zhì)性強且無國際上認可的診斷指南，診斷較難確立，臨床醫(yī)師在工作中遇到臨床表型疑似者，應(yīng)盡早行高通量測序以協(xié)助診斷。