趙 琪，李松碩，王 嬌，郭 鵬，呂愛枝，周 碩，焦 博*

（1.河北省農(nóng)林科學(xué)院 生物技術(shù)與食品科學(xué)研究所/河北省植物轉(zhuǎn)基因中心重點實驗室，河北 石家莊 050051；2.河北北方學(xué)院 農(nóng)林科技學(xué)院，河北 張家口 075000；3.河北科技大學(xué) 食品與生物學(xué)院，河北 石家莊 050018）

0 引言

氮是植物中氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸、葉綠素以及激素等生物大分子物質(zhì)的主要組成成分，是植物生長發(fā)育的主要限制因素［1］。施用氮肥是提高農(nóng)作物產(chǎn)量的有效方法，也是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)主要的成本支出。在我國的實際農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，長期存在氮肥施用不合理、農(nóng)作物氮肥吸收利用率低等主要問題，這不僅導(dǎo)致了土壤酸化、水體富營養(yǎng)化，且可能造成嚴(yán)重的環(huán)境污染［2］。此外農(nóng)作物種植成本的提高也嚴(yán)重制約了我國農(nóng)業(yè)的發(fā)展。因此，解析植物對氮的吸收、轉(zhuǎn)運以及代謝過程，培育高氮肥利用率的農(nóng)作物品種，不僅可以降低氮肥施用量，減少環(huán)境污染，還能降低農(nóng)民的生產(chǎn)成本，有力推動我國農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展［3］。

植物的根主要從土壤的硝酸鹽(NO3-)、銨(NH4+)等無機氮形態(tài)中吸收氮元素，這2種形式的氮源分別通過相應(yīng)的轉(zhuǎn)運蛋白實現(xiàn)其在細(xì)胞和組織器官之間的吸收、轉(zhuǎn)運和移動，其中硝酸鹽是植物在有氧條件下從土壤中獲取氮源的主要形式［3-4］。硝酸鹽通過不同親和力的硝酸轉(zhuǎn)運系統(tǒng)(NRTs)進入細(xì)胞，然后在細(xì)胞質(zhì)中經(jīng)NADPH-依賴硝酸還原酶(NAR)還原為亞硝酸鹽，在葉綠體和前質(zhì)體中通過鐵氧還蛋白與亞硝酸還原酶(NiR)催化轉(zhuǎn)變?yōu)殇@。土壤中的銨鹽也可以通過銨轉(zhuǎn)運蛋白(AMT)進入植物體內(nèi)，后經(jīng)谷氨酰胺合成酶/谷氨酰胺-α-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶(GS/GOGAT)催化合成谷氨酰胺或谷氨酸，進一步通過不同的氨基轉(zhuǎn)移酶合成其他氨基酸，最后被植物所利用［5］。

丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AlaAT)又稱谷丙轉(zhuǎn)氨酶，是參與植物氮素同化的關(guān)鍵酶類，該酶在輔酶磷酸吡哆醛(PLP)存在時催化丙氨酸和α-酮戊二酸反應(yīng)形成丙酮酸和谷氨酸的可逆反應(yīng)。此催化反應(yīng)中的丙酮酸和α-酮戊二酸也是碳代謝中的重要中間產(chǎn)物，谷氨酸參與了氮素同化以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，丙氨酸是缺氧時氨基酸的主要來源［6］，所以丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶將植物初級碳代謝與氨基酸合成聯(lián)系在一起，在碳氮代謝中發(fā)揮了不可或缺的作用。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶在擬南芥［6］、水稻［7］、玉米［8］、大麥［9］、苜蓿［10］、豆類［11］、辣椒［12］、蓮花［13］、茶葉［14］、楊樹［15］以及小麥［16］等植物中均有一定的研究報道。研究發(fā)現(xiàn)，低氧、光照、氮肥施用、高溫以及低溫［14］均可影響丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因的表達水平，并且在許多組織和器官中均能檢測到AlaAT的活性，如擬南芥的葉、根、花［17］以及水稻發(fā)育中的種子［7］等。

現(xiàn)有研究報道的擬南芥中有4個AlaAT基因，分別為AtAlaAT1和AtAlaAT2、AtGGAT1和AtGGAT2。GGAT為包含編碼過氧化物酶體靶向信號(PTSs)序列的谷氨酸：乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶［17-18］，其能催化谷氨酸和乙醛酸反應(yīng)生成α-酮戊二酸和甘氨酸，在光呼吸和氨基酸代謝中發(fā)揮重要作用。在缺氧條件下，AtAlaAT1和AtAlaAT2均被誘導(dǎo)表達。在擬南芥中突變AtAlaAT1證實，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶在低氧脅迫恢復(fù)過程中，對于丙氨酸分解代謝至關(guān)重要［6］。大豆基因組已鑒定出4個AlaAT基因，GmAlaAT1～GmAlaAT4。在淹水導(dǎo)致的缺氧條件下，GmAlaAT表達增強，并參與到丙氨酸的分解代謝［11］。過表達GmAlaAT1可提高大豆中抗氧化保護酶活性并促進根系發(fā)育［19］。同樣，在苜蓿中也發(fā)現(xiàn)了4個AlaAT基因，它們與幼苗耐缺氧有關(guān)［10］。在水稻中鑒定出5個AlaAT基因，其中OsAlaAT1在發(fā)育種子中的表達量高于其他4個基因的，并且受缺氧誘導(dǎo)表達最顯著。在木本植物楊樹中確定了4個丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶同源基因AlaAT1～AlaAT4，其中AlaAT1和AlaAT2屬于GGAT蛋白基因，主要在葉中表達，均能被外施N誘導(dǎo)表達，并且受晝夜變化調(diào)節(jié)，而AlaAT3和AlaAT4屬于AlaAT蛋白基因，在根、莖、葉中均有表達。研究證明AlaAT3能夠被谷氨酰胺調(diào)控，受外施N的誘導(dǎo)表達，可能在根氮代謝中發(fā)揮重要作用［15］。

Miyashita等［6］研究表明AlaAT被證實參與植物中許多生理代謝過程，如氨基酸代謝、光呼吸、糖異生和糖酵解等，其還可作為C和N的反應(yīng)者和生產(chǎn)者參與C4光合作用以及淀粉的合成［20-21］，參與植物應(yīng)對非生物脅迫以及提高氮素利用率等反應(yīng)過程。在低N條件下，油菜根特異性啟動子btg26啟動大麥HvAlaAT能夠增加油菜地上部分的生物量和產(chǎn)量［22］，水稻啟幼子OsAnt1啟動大麥HvAlaAT可以提高水稻根和苗的生物量［23］并提高氮素利用率［9］。研究發(fā)現(xiàn)，OsAlaAT1可以調(diào)節(jié)水稻種子發(fā)育過程中淀粉的合成，增加籽粒重量。OsAlaAT1基因的缺失會導(dǎo)致籽粒中直鏈淀粉的含量下降，支鏈淀粉結(jié)構(gòu)改變，并出現(xiàn)白色胚乳［21,24］。OsAlaAT1的表達還可以調(diào)控水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)，提高水稻氮素利用率［25］。

丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶在植物氮吸收利用過程中發(fā)揮重要功能，并影響了農(nóng)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量。AlaAT基因在擬南芥、水稻、大麥、苜蓿、豆類和楊樹等多種植物中均有一定的報道，但在小麥中的研究還不夠深入。因此，本研究根據(jù)小麥的基因組信息，對丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶家族成員進行鑒定分析，并進行了生物學(xué)特性以及功能分析，以期為提高小麥的氮素利用率及產(chǎn)量奠定理論基礎(chǔ)，為培育氮高效小麥品種提供理論支撐。

1 材料和方法

1.1 小麥全基因組丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶家族成員鑒定

本文結(jié)合HMM和BLAST這2種方法篩選小麥丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因。首先從Ensembl(http://plants.ensembl.org/index.html)網(wǎng)站中下載小麥蛋白數(shù)據(jù)庫。根據(jù)包含典型氨基轉(zhuǎn)移酶家族結(jié)構(gòu)域的Pfam碼(PF00155)，通過Pfam數(shù)據(jù)(http://pfamlegacy.xfam.org/)庫查找并下載Stockholm種子文件，并使用HMMER軟件在小麥蛋白數(shù)據(jù)庫中篩選小麥丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶家族成員基因；根據(jù)擬南芥和水稻丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因蛋白序列在小麥蛋白數(shù)據(jù)庫進行blast同源蛋白比對，篩選小麥丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因，結(jié)合兩種方法的結(jié)果進行分析，確定目標(biāo)蛋白；通過NCBI-CDD在線網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)篩選剔除缺失或含有不完整氨基轉(zhuǎn)移酶保守結(jié)構(gòu)域的蛋白，最終確定小麥丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因；通過Ensembl數(shù)據(jù)庫(http://plants.ensembl.org/index.html)獲得基因序列、CDS序列、蛋白序列、基因染色體位置信息、蛋白分子質(zhì)量和等電點；通過WoLF PSORT網(wǎng)站(https://wolfpsort.hgc.jp/)進行亞細(xì)胞定位預(yù)測。

1.2 進化樹分析

通過MEGA7對小麥丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因及其在水稻、擬南芥和大麥中的同源基因的氨基酸序列進行進化樹分析，經(jīng)氨基酸序列比對后，再計算確定最佳進化樹的算法模型為JTT+G，設(shè)定Bootstrap取樣值為1000。15個小麥丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因最佳進化樹算法模型為LG+G。所有氨基酸序列從Ensembl數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站下載。基因ID號如下：5個水稻OsAlaAT1(LOC_Os10g 25130)、OsAlaAT2(LOC_Os03g 08530)、OsAlaAT3(LOC_Os07g42600)、OsAlaAT4(LOC_Os10g25140)、OsAlaAT5(LOC_Os09g26380)；4 個擬南芥AtAlaAT1(At1g17290)、AtAlaAT2(At1g72330)、AtGGAT1(At1g233100)、AtGGAT2(At1g70580)；2個苜蓿MtmAlaAT(Medtr8g023140)；MtcAlaAT(Medtr5g03 3230)。

1.3 蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析及基因結(jié)構(gòu)分析

將小麥氨基酸序列通過MEME網(wǎng)站進行保守結(jié)構(gòu)域分析，設(shè)置結(jié)構(gòu)域個數(shù)設(shè)為10。通過GSDS 2.0網(wǎng)站(http://gsds.gao-lab.org/index.php)對小麥成員基因CDS序列與全長基因序列的結(jié)構(gòu)進行分析。

1.4 染色體定位及Ka/Ks計算

根據(jù)小麥染色體長度與基因在染色體上的位置信息，利用TBtools軟件將15個基因定位至染色體上。

1.5 啟動子順式作用元件預(yù)測

通過Ensembl數(shù)據(jù)庫獲得基因ATG上游2000 bp核苷酸序列，通過PlantCARE網(wǎng)站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)進行啟動子順式作用元件預(yù)測。

1.6 基因表達分析

收集溫室培養(yǎng)的中國春小麥灌漿期的根、莖、葉、旗葉和種子。選取均勻飽滿無傷的種子，平鋪在發(fā)芽盤上，避光2 d進行萌發(fā)，隨后正常光照培養(yǎng)3 d，去掉胚乳，轉(zhuǎn)入96孔板上并使用Hoagland營養(yǎng)液水培3 d，達到2葉1心期進行缺氮處理，處理0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、6.0、24.0 h后收集根組織。使用Trizol提取不同組織的RNA后，通過Nano-Drop 2000分光光度計測定其濃度。每個樣品包含3個生物學(xué)重復(fù)，每個樣品取1 μg RNA通過HiScript RT SuperMix試劑反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以每個樣品的cDNA為模板，使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix通過ABI 7500 Real-Time PCR定量PCR儀進行基因表達分析，引物見表1，采用ΔΔCT法計算基因的相對表達量。使用TaActin作為內(nèi)參基因。每個樣品進行3次技術(shù)復(fù)制。

表1 引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因篩選、鑒定及進化樹分析

根據(jù)典型氨基轉(zhuǎn)移酶家族結(jié)構(gòu)域的Pfam碼(PF00155)，通過HMM和blast結(jié)合，篩選出小麥中的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶家族成員，并使用SMART和CDD網(wǎng)站進行蛋白保守結(jié)構(gòu)域檢測，除去缺失和不完整保守結(jié)構(gòu)域的基因，鑒定出73個小麥丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因序列(圖1)。對73個小麥丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因的進化關(guān)系進行分析，通過與其在擬南芥、水稻和苜蓿中的同源基因進行進化樹聚類分析，發(fā)現(xiàn)只有15個基因與擬南芥、水稻和苜蓿中的同源基因聚類到同一分支上，且這一分支可分為2個亞族，其中12個基因與擬南芥中AtAlaAT和所有的水稻OsAlaAT親緣關(guān)系較近，聚類到第1組。小麥中有3個基因與水稻中OsAlaAT1、OsAlaAT3、OsAlaAT4和OsAlaAT5基因同源，其余3個基因與擬南芥中AtGGAT1/2和苜蓿中的MtcAlaAT的親緣關(guān)系較近，聚類到第2組。

圖1 小麥丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因及其同源基因進化樹分析

2.2 小麥丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶家族成員信息分析

對小麥中15個丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因進行分析，根據(jù)其在染色體上的位置以及水稻丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因，將小麥的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因分別命名為TaAlaAT1-A/B/D，TaAlaAT3-A/B/D，TaAlaAT4-A/B/D，TaAlaAT5-A/B/D和TaGGAT1-A/B/D。根據(jù)基因序列以及氨基酸序列信息分析這15個基因的化學(xué)特性，結(jié)果顯示15個丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因的等電點在5.6613～6.9316之間，蛋白質(zhì)分子量介于43.7～65.9 kDa之間，轉(zhuǎn)錄本長度介于1209～2434 bp之間。亞細(xì)胞定位預(yù)測顯示TaAlaAT1-A/B定位于細(xì)胞質(zhì)中，TaAlaAT1-D定位于葉綠體中，TaAlaAT3-A/B/D均定位于線粒體，TaAlaAT4-A/B/D均定位于葉綠體中，TaAlaAT5-A/B/D定位于細(xì)胞質(zhì)中，而TaGGAT1-A/B定位于過氧化物酶體，TaGGAT1-D定位于細(xì)胞質(zhì)中(表2)。不同的亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，15個丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因在小麥生長發(fā)育過程中發(fā)揮了不同的生物學(xué)功能。

表2 小麥丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶家族成員信息分析

2.3 小麥丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因染色體定位分析

普通小麥為異源六倍體(AABBDD)，包含3個染色體組(ABD)，每個染色體組含有7條染色體，總共21條染色體。基因染色體定位信息結(jié)果顯示，15個基因主要分布在1、2和5號染色群組上，定位信息（圖2）分布如下：Chro1A(TaAlaAT1-A)；Chro1B(TaAlaAT1-B)；Chro1D(TaAlaAT1-D)；Chro2A(TaAlaAT3-A、TaGGAT1-A)；Chro2B(TaAlaAT3-B、TaGGAT1-B)；Chro2D(TaAlaAT3-D、TaGGAT1-D)；Chro5A(TaAlaAT4-A、TaAlaAT5-A)；Chro5B(TaAlaAT4-B、TaAlaAT5-B)；Chro5D(TaAlaAT4-D、TaAlaAT5-D)。

圖2 TaAlaAT基因的染色體分布情況

2.4 小麥丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因序列及蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

根據(jù)AlaAT家族成員氨基酸序列信息，通過MEME網(wǎng)站進行蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測。設(shè)定10個保守結(jié)構(gòu)域進行分析，結(jié)果顯示在10個TaAlaAT氨基酸序列中，除TaAlaAT1-D外均含有10個完整的保守結(jié)構(gòu)域；TaAlaAT1-D缺少N端的Motif9和Motif6保守結(jié)構(gòu)域；TaGGAT1-A/B均含有8個完整的保守結(jié)構(gòu)域，缺少N端的Motif9和Motif7保守結(jié)構(gòu)域；TaGGAT1-D只含有7個完整的保守結(jié)構(gòu)域，N端缺少Motif9和Motif7，C端缺少Motif8保守結(jié)構(gòu)域?；蛐蛄薪Y(jié)構(gòu)分析顯示，所有基因均含有多個外顯子和內(nèi)含子，其中外顯子數(shù)目分別為10、12、13、15和18個，絕大部分為15個，外顯子數(shù)目最少的為TaAlaAT1-D，數(shù)目最多的為TaAlaAT4-B(圖3)。

圖3 15個TaAlaAT基因氨基酸及基因結(jié)構(gòu)分析

2.5 基因?qū)a/Ks分析

通過進化樹分析發(fā)現(xiàn)，15個小麥丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因可進化為5支，每支有3個同源基因，基因序列高度同源。為了研究每個分支中一組基因在進化過程中是否受到選擇壓力的影響，對每對基因Ka/Ks值進行分析。由表3可知，5組基因?qū)Φ腒a/Ks值均小于1，這說明基因在進化過程中受純化選擇作用。

表3 基因?qū)a/Ks分析

2.6 小麥丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因啟動子順式作用元件分析

啟動子中的順式作用元件決定了基因的表達特異性。通過對基因啟動子的順式作用元件進行預(yù)測，可以為研究AlaAT家族成員的功能提供更多的參考依據(jù)。由圖4可知，每個基因啟動子上均含有多種類型的反應(yīng)元件，如激素響應(yīng)元件、脅迫響應(yīng)元件以及與發(fā)育相關(guān)的順式作用元件；激素響應(yīng)元件包括脫落酸響應(yīng)元件(ABRE)、生長素響應(yīng)元件(AuxRR-core/TGA-element)、赤霉素響應(yīng)元件(P-box/GARE-motif/TATC-box)、茉莉酸響應(yīng)元件(TGACG-motif/CGTCA-motif)和水楊酸響應(yīng)性(TCA-Element)；脅迫反應(yīng)相關(guān)元件包括缺氧誘導(dǎo)反應(yīng)元件(ARE)、防御和脅迫響應(yīng)元件(TC-rich repeats)、低溫反應(yīng)元件(LTR)、干旱誘導(dǎo)響應(yīng)元件(MYB結(jié)合位點，MBS)、光響應(yīng)相關(guān)元件(TCTmotif/TCCC-motif/GATA-motif/L-box/GA-motif/I-box/LAMP-element/chs- cma1a/Sp1/GT1-motif/MRE/Box4/G-Box)和創(chuàng)傷反應(yīng)元件(WUN-motif)；在啟動子上還檢測到一些與植物生物合成和發(fā)育相關(guān)的順式作用元件，如黃酮類生物合成基因調(diào)控(MYB結(jié)合位點，MBSI)、種子特異性調(diào)控(RYelement)、玉米蛋白代謝調(diào)控(O2-site)、細(xì)胞周期調(diào)控(MSA-like)和胚乳表達調(diào)控元件(GCN4-motif)、調(diào)控分生組織表達(CAT-box)和晝夜節(jié)律調(diào)控(circadian)。綜上，小麥丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶可能參與小麥的生長發(fā)育、激素響應(yīng)以及脅迫響應(yīng)等過程。

圖4 啟動子順式作用元件預(yù)測

2.7 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因在小麥不同組織中的表達模式分析

為了研究丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因在小麥不同組織中的表達模式，本研究以小麥灌漿期根、莖、葉、旗葉以及種子為材料，提取RNA并分析基因表達量。由于同源基因序列相似度較高，分別設(shè)計了5對引物，每對引物可同時檢測包含了ABD染色體組上的3個同源基因(表1)。由圖5可知，所有基因在根、莖、葉、旗葉以及種子中均有表達，且在葉、旗葉中的表達量均較高。

圖5 基因的組織表達量分析

2.8 小麥丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因缺氮處理的表達水平分析

丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶是氮代謝通路中的重要酶類，本研究對小麥丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶在不同時長缺氮處理的表達模式進行分析。由圖6可知，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因在缺氮處理后表達模式均有變化，其中TaAlaAT1-A/B/D在缺氮處理后相對表達水平上調(diào)，在處理0.5 h時的表達量最高，隨后下降，在處理24.0 h后，相對表達水平恢復(fù)到處理前水平；TaAlaAT3-A/B/D基因在缺氮處理1.0 h后相對表達水平上調(diào)，處理2.0 h的表達量達到最高水平，在3.0、6.0、24.0 h時的表達量均高于處理前水平；TaAlaAT4-A/B/D基因?qū)θ钡幚頉]有顯著性的響應(yīng)；TaAlaAT5-A/B/D基因在缺氮處理后表達量顯著下調(diào)；TaGGAT1-A/B/D基因在缺氮處理1.0、2.0、3.0、6.0、24.0 h的表達量均上調(diào)，在處理2.0 h時表達量達到最高值。綜上，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶能夠參與小麥響應(yīng)氮脅迫的調(diào)控過程。

圖6 基因在缺氮脅迫不同時間的表達量分析

3 結(jié)論與討論

氮是植物生長所必需的基本元素，對植物施用氮肥可以促進植物的生長發(fā)育，提高植物的生物量和產(chǎn)量。小麥(Triticum aestivumL.)是世界“三大谷物”之一，為人類和牲畜提供蛋白質(zhì)、淀粉和能量。本文結(jié)合HMM、BLAST這2種方法在小麥中篩選鑒定出73個丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因，通過進化樹分析發(fā)現(xiàn)：只有15個基因與擬南芥、水稻、苜蓿中的AlaAT基因親緣關(guān)系比較近(圖1)，在5個水稻丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因中，除了OsAlaAT2基因，其余4個OsAlaAT基因在小麥中均有3個同源基因，并且3個同源基因分布于ABD不同染色體組上(圖2)。目前，有關(guān)水稻中GGAT基因的研究還鮮有報道，而在擬南芥中有2個AtGGAT1/2，大麥中有1個MtcAlaAT，在小麥中有3個TaGGAT分別分布于ABD不同染色體組上。研究報道擬南芥中AlaAT1定位于細(xì)胞質(zhì)中，AlaAT2預(yù)測定位于線粒體中，GGAT定位于過氧化物酶體中［10,18］，水稻OsAlaAT1定位于細(xì)胞質(zhì)中［21］。亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示，小麥中與水稻OsAlaAT1親緣關(guān)系較近的TaAlaAT1-A/B定位于細(xì)胞質(zhì)中，TaAlaAT1-D定位于葉綠體中，說明OsAlaAT1和TaAlaAT1-A/B可能在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮相同的生物學(xué)功能；與擬南芥AlaAT2親緣關(guān)系較近的TaAlaAT3-A/B/D也定位于線粒體；與GGAT親緣關(guān)系較近的TaGGAT1-A/B也定位于過氧化物酶體中，TaGGAT1-D則定位于細(xì)胞質(zhì)中，這是由于TaGGAT1-A/B氨基酸序列C端含有過氧化物酶體靶向信號-PTS1的3個保守多肽(SRL)［17］，而TaGGAT1-D氨基酸序列C端則不含有(表2)。蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示：所有基因均含有典型的依賴于磷酸吡哆醛的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶超家族AAT-like保守結(jié)構(gòu)域，磷酸吡哆醛通過與賴氨酸殘基形成希夫堿中間化合物。TaGGAT1與TaAlaAT氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)域?qū)Ρ劝l(fā)現(xiàn)，TaGGAT1氨基酸序列N端缺少Motif9和Motif7保守結(jié)構(gòu)域(圖3)，說明TaGGAT和TaAlaAT功能上的差異可能是由于這2個結(jié)構(gòu)域的缺失導(dǎo)致。

有研究報道，Kendziorek等［16］在小麥中分離出4個丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因，并分別命名為AlaAT1-2和GGAT1-2，定量結(jié)果顯示只有AlaAT1在缺氧脅迫下轉(zhuǎn)錄水平升高，其余3個基因在缺氧脅迫后表達沒有顯著性差異。這4個基因在缺氮后表達量均下調(diào)，其中AlaAT1-2基因表達下調(diào)顯著，而GGAT1基因下調(diào)不顯著，GGAT2基因在缺氮處理24.0 h后才開始下調(diào)表達。AlaAT基因不僅受缺氧調(diào)控，還受光照影響。小麥中AlaAT和GGAT的活性在黃化幼苗中均能檢測到，并且其活性在放入有光環(huán)境后增強。根據(jù)序列比對確認(rèn)AlaAT1在本文中命名為TaGGAT1-A/B/D，AlaAT2在文中為TaGGAT5-A/B/D，GGAT1在文中為TaAlaAT3-A/B/D，GGAT2在文中為TaGGAT1-A/B/D。本文定量結(jié)果顯示TaAlaAT1-A/B/D、TaAlaAT3-A/B/D和TaGGAT1-A/B/D基因在缺氮處理后均被誘導(dǎo)上調(diào)表達，其中TaAlaAT1-A/B/D基因在處理0.5 h時表達水平上調(diào)，隨后下降，在處理24.0 h后恢復(fù)到處理前水平；TaAlaAT3-A/B/D基因缺氮處理1.0 h后表達水平上調(diào)，處理2.0 h時達到最高水平，隨后在處理24.0 h內(nèi)的表達量均高于處理前水平；TaGGAT1-A/B/D基因在缺氮處理1.0 h后表達水平上調(diào)，處理2.0 h時達到最高表達水平；而TaAlaAT5-A/B/D在基因缺氮處理后表達水平下調(diào)。上述基因可能在不同時間參與小麥響應(yīng)氮脅迫調(diào)控過程。TaAlaAT4-A/B/D基因在缺氮處理后表達量與處理前相比沒有顯著性的差異，說明該基因可能未參與小麥氮代謝的調(diào)控過程。本文定量結(jié)果與前人報道上存在的差異可能是由于小麥品種差異造成。小麥中AlaAT基因被證實在小麥根、莖、葉、雄蕊和雌蕊中均有表達，但在葉片中的表達量最高，該基因參與小麥響應(yīng)鎘脅迫調(diào)控過程，經(jīng)鎘脅迫處理后，該基因的表達量先上升后下降［26］。AlaAT基因即本文中的TaGGAT1-B基因，本文組織表達分析顯示15個丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因在根、莖、葉、種子和旗葉中均有表達，且在葉、旗葉中的表達量均較高。