畢建蝶?劉淑敏?何秋月?韓睿輝?杜艷

摘要：目的 對(duì)收集的肺炎克雷伯菌進(jìn)行高毒力鑒定，探討其對(duì)鼠源巨噬細(xì)胞RAW264.7炎癥相關(guān)因子表達(dá)的影響。方法 收集臨床分離的高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulent Klebsiella pneumoniae，HVKP）疑似菌株，首先回顧性分析患者臨床情況，再結(jié)合拉絲試驗(yàn)、PCR擴(kuò)增毒力質(zhì)粒相關(guān)基因和藥敏試驗(yàn)鑒定其高毒力特性及耐藥情況。然后將細(xì)菌分別感染RAW264.7細(xì)胞4 h和24 h后，黏附與抗吞噬試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)菌免疫逃避能力，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β的表達(dá)。結(jié)果 兩株臨床菌株均為高黏液表型、攜帶毒力質(zhì)粒相關(guān)基因及患者病情嚴(yán)重復(fù)雜，判定為HVKP，并且出現(xiàn)了多重耐藥（Muiti-drug resistant，MDR）且對(duì)碳青霉烯類耐藥的HVKP（MDR-HVKP）。在感染4 h和24 h后，巨噬細(xì)胞胞外細(xì)菌黏附數(shù)及胞內(nèi)活菌數(shù)都為：標(biāo)準(zhǔn)菌株>HVKP臨床>MDR-HVKP臨床，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在感染4 h內(nèi)TNF-α的表達(dá)水平顯著升高，而IL-6和IL-1β的表達(dá)水平均較低。與標(biāo)準(zhǔn)菌株相比，HVKP臨床（P=0.007）和MDR-HVKP臨床（P=0.009）更能增加TNF-α的表達(dá)水平。當(dāng)感染達(dá)到24 h時(shí)，IL-6和IL-1β的表達(dá)水平上升較明顯，同樣高毒力菌株感染引起IL-6和IL-1β表達(dá)水平增加的程度大于標(biāo)準(zhǔn)菌株，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 本研究的HVKP具有高黏液表型、攜帶毒力質(zhì)粒相關(guān)基因及免疫逃避能力強(qiáng)的特性，易對(duì)免疫力低下的重癥患者造成嚴(yán)重感染。在感染鼠源巨噬細(xì)胞RAW264.7后，主要通過釋放促炎因子TNF-α、IL-6和IL-1β來加劇炎癥反應(yīng)。

關(guān)鍵詞：高毒力肺炎克雷伯菌；多重耐藥；免疫逃避；炎癥因子

中圖分類號(hào)：R9，R517.6文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Virulence characteristics of hypervirulent Klebsiella pneumoniae and its effect on the inflammatory cytokine response of RAW264.7 cells

Bi Jian-die， Liu Shu-min， He Qiu-yue， Han Rui-hui， and Du Yan

（Department of Clinical Laboratory， the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University， Yunnan Key Laboratory of Laboratory Medicine， Yunnan Province Clinical Research Center for Laboratory Medicine， Kunming 650032）

Abstract Objective To identify the hypervirulence of collected Klebsiella pneumoniae and to explore the effect of Klebsiella pneumoniae on the expression of RAW264.7 inflammatory cytokines in mouse macrophages. Methods? ? The suspected strains of hypervirulent Klebsiella pneumoniae （HVKP） were collected. Firstly， the clinical situation of the patients was analyzed retrospectively， and then the high virulence characteristics and drug resistance were identified by the string test， PCR amplification of virulence plasmid related genes， and the drug sensitivity test. Then， the bacteria were infected with RAW264.7 cells for 4 h and 24 h， respectively. The immune escape ability of bacteria was detected by adhesion and anti-phagocytosis tests， and the expression of cytokines， TNF-α， IL-6， and IL-1β in the supernatant of cell culture was detected by ELISA. Results? ? The two clinical strains had hypermucoid phenotype， carried virulence plasmid related genes， and patients with serious and complicated conditions， identified as HVKP， and showed carbapenem resistance and multiple-drug resistance （MDR-HVKP）. At 4 h and 24 h after infection， the number of extracellular bacterial adhesion and intracellular viable bacteria of macrophages were as follows： standard strain > HVKP clinical > MDR-HVKP clinical， and the difference was statistically significant. Within 4 hours of infection， the expression of TNF-α was significantly increased， while the expression of IL-6 and IL-1β was low. Compared with the standard strains， the HVKP clinical （P=0.002） and MDR-HVKP clinical （P=0.009） strains could increase the expression level of TNF-α in clinic. When the infection reached 24 hours， the expression level of IL-6 and IL-1β increased significantly. The increase of IL-6 and IL-1β expression caused by the hypervirulent strain was higher than that of the standard strain， and the difference was statistically significant. Conclusion? ? The HVKP in this study has the characteristics of hypermucoid phenotype， virulent plasmid-related genes， and strong immune escape ability. It is easy to cause serious infection in critically ill patients with low immunity. After infection with mouse macrophage RAW264.7， the inflammatory response was aggravated mainly by releasing pro-inflammatory factors TNFα， IL-6， and IL-1β.

Key words Hypervirulent Klebsiella pneumoniae; Multidrug-resistant; Immune escape; Cytokines

肺炎克雷伯菌可引起多種感染，包括肺炎、尿路感染、菌血癥和肝膿腫等[1]，通常在免疫低下的人群中引起嚴(yán)重感染，但高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulent Klebsiella pneumoniae，HVKP）的出現(xiàn)和傳播則擴(kuò)大了易感人群，該菌既是醫(yī)院感染相關(guān)的原因也是社區(qū)獲得性感染的原因[2]。在臨床微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室沒有對(duì)HVKP進(jìn)行常規(guī)檢測(cè)且近年來碳青霉烯耐藥的HVKP、多粘菌素耐藥的HVKP和多重耐藥（muiti-drug resistant，MDR）的HVKP正在出現(xiàn)的情況下[3-5]，使得這類感染的治療非常具有挑戰(zhàn)性。巨噬細(xì)胞作為人體的主要效應(yīng)細(xì)胞，通過識(shí)別、吞噬和殺死微生物，在宿主防御中起著基礎(chǔ)性的作用[6]。當(dāng)機(jī)體被肺炎克雷伯菌感染后，大量中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞能夠募集至感染部位，導(dǎo)致促炎因子TNF-α、IL-6和IL-1β的大量產(chǎn)生、釋放和激活增加[7-8]。目前HVKP菌株直接作用于免疫細(xì)胞方面的研究較少，其確切作用和相關(guān)機(jī)制仍有待進(jìn)一步探索。為了進(jìn)一步了解HVKP的臨床特征、毒力特點(diǎn)和耐藥性，并改善患者護(hù)理和預(yù)后，所以本研究將從患者臨床情況、分子水平和細(xì)胞水平對(duì)源于臨床的兩株HVKP疑似菌株進(jìn)行鑒定及毒力特性分析，初步探討其對(duì)鼠源巨噬細(xì)胞RAW264.7炎癥相關(guān)因子表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和細(xì)胞株來源

本研究應(yīng)用的兩株肺炎克雷伯菌分離自昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院的兩名重癥住院患者，經(jīng)MALDI-TOF MS質(zhì)譜儀進(jìn)行鑒定。因兩位患者病情嚴(yán)重且檢出的肺炎克雷伯菌疑似HVKP，故納入本研究。肺炎克雷伯菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC BAA-1706、鼠源巨噬細(xì)胞RAW264.7購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。

1.1.2 主要試劑

哥倫比亞血瓊脂平板購(gòu)自鄭州安圖生物工程股份有限公司；革蘭陰性細(xì)菌藥敏卡（AST-GN16卡）購(gòu)自法國(guó)BioMérieux公司；2×Taq PCR MasterMix購(gòu)自北京博邁德生物公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶消化液購(gòu)自Biological Industries公司；TritonX-100購(gòu)自Sigma Aldrich公司；慶大霉素液購(gòu)自索萊寶公司；Mouse TNF-α、 IL-6、IL-1β ELISAKit 購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 患者臨床情況、拉絲試驗(yàn)和PCR試驗(yàn)相結(jié)合進(jìn)行高毒力鑒定及藥敏試驗(yàn)

臨床信息收集：菌株攜帶者的臨床信息利用LIS系統(tǒng)回顧性分析。

拉絲試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)菌高黏液表型：用接種環(huán)輕觸培養(yǎng)基上的單個(gè)菌落后向外拉，能夠形成≥5 mm的黏液絲判斷為拉絲試驗(yàn)陽性[9]。

參照文獻(xiàn)[10]，PCR擴(kuò)增毒力質(zhì)粒相關(guān)基因（rmpA、rmpA2、HI1B、iroN、iutA）以判定毒力質(zhì)粒的攜帶情況：使用基因組試劑盒進(jìn)行菌株DNA提取，PCR反應(yīng)采用25 μL反應(yīng)體系：基因組DNA模板1 μL；Taq Master Mix 12.5 μL；ddH2O 9.5 μL；上下游引物各1 μL，毒力基因引物序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度見表1。反應(yīng)條件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，30 cycles；72℃，5 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳PCR產(chǎn)物，陽性產(chǎn)物送至北京博邁德生物公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果于NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST比對(duì)。

藥敏試驗(yàn)：VITEK-2 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏儀和AST-GN16藥敏卡測(cè)定美羅培南、亞胺培南、厄他培南、頭孢他啶、頭孢唑林、頭孢吡肟、頭孢曲松、哌拉西林、阿莫西林/克拉維酸、氨曲南、慶大霉素、阿米卡星、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星和復(fù)方磺胺甲惡唑的藥敏結(jié)果和ESBLs產(chǎn)生情況。ESBLs確證采用紙片擴(kuò)散法克拉維酸抑制實(shí)驗(yàn)：將菌液均勻涂布于MH瓊脂平板上，分別將頭孢噻肟、頭孢他啶單藥及其與克拉維酸復(fù)合藥的藥敏紙片貼于平板上，任何一對(duì)藥物中復(fù)合藥的抑菌圈直徑大于單藥直徑5 mm即可確認(rèn)為產(chǎn)ESBLs的肺炎克雷伯菌。藥敏結(jié)果判讀依據(jù)2020年CLSI M100 S30文件進(jìn)行。

1.2.2 HVKP菌株與RAW264.7細(xì)胞共培養(yǎng)

（1）細(xì)菌黏附試驗(yàn)

將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)周期的細(xì)菌用PBS懸浮并利用細(xì)菌比濁儀調(diào)節(jié)菌懸液濃度為1×108 CFU/mL備用。將RAW264.7細(xì)胞以每孔1×105個(gè)細(xì)胞的密度接種到12孔板中37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)12 h，于倒置顯微鏡下觀察約90%細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后3組細(xì)菌按感染復(fù)數(shù)MOI=100：1比例與RAW264.7細(xì)胞分別共培養(yǎng)4 h和24 h，PBS洗滌3次，然后每孔加入200 ?L胰蛋白酶消化細(xì)胞，用800 ?L培養(yǎng)基終止消化。最后將1 mL細(xì)胞懸液稀釋合適倍數(shù)后（4 h稀釋10倍，24 h稀釋100倍）取10 ?L涂布于哥倫比亞血瓊脂平板上進(jìn)行培養(yǎng)以計(jì)數(shù)菌落。

（2）細(xì)菌抗吞噬試驗(yàn)

如上所述進(jìn)行細(xì)菌細(xì)胞共培養(yǎng)4 h和24 h后PBS洗滌3次，然后加入 DMEM-10%胎牛血清-慶大霉素（終濃度100 ?g/mL）500 ?L，并將反應(yīng)混合物孵育1 h殺死細(xì)胞外細(xì)菌。無菌PBS再洗滌3次，加入200 ?L0.5%的Triton-X100，于37℃條件下裂解細(xì)胞5 min，加入800 ?L無菌PBS，吹打混勻后懸液（除標(biāo)準(zhǔn)菌株需稀釋2倍，其余均不稀釋）取10 ?L涂布于哥倫比亞血瓊脂平板上進(jìn)行培養(yǎng)以計(jì)數(shù)菌落。

（3）細(xì)胞因子檢測(cè)

如上所述進(jìn)行細(xì)菌細(xì)胞共培養(yǎng)4 h和24 h后取細(xì)胞培養(yǎng)上清，4 ℃下10000 r/min離心10 min，參照聯(lián)科生物ELISA試劑盒說明書檢測(cè)細(xì)胞上清液中的TNF-α、IL-6、IL-1β含量。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

每次試驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，使用 SPSS 25. 0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。定量資料表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s），多組均值間采用單因素方差分析，方差齊用LSD 法進(jìn)一步作多重比較；方差不齊則采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，P<0.05，認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高毒力菌株的鑒定及藥敏結(jié)果

2.1.1 菌株攜帶患者情況

兩株菌分別分離于腫瘤和腦部疾病患者，兩位患者均有肺部感染且患有高血壓等基礎(chǔ)疾病，具體情況見表2。

2.1.2 兩株臨床菌株判定為高黏液型HVKP

與標(biāo)準(zhǔn)菌株相比，本研究中的兩株臨床分離株拉絲試驗(yàn)陽性，具有高黏液表型，且PCR擴(kuò)出毒力質(zhì)粒相關(guān)基因rmpA、rmpA2、iroN、iutA 和質(zhì)粒復(fù)制子相關(guān)基因HI1B，提示攜帶毒力質(zhì)粒，如圖1～2。

2.1.3 兩株臨床HVKP菌株具有不同的抗生素敏感性

其中一株對(duì)檢測(cè)的16種抗生素均表現(xiàn)為敏感且ESBLs檢測(cè)為陰性，而另一株除了對(duì)碳青霉烯類抗生素（亞胺培南、美羅培南、厄他培南）耐藥，還對(duì)頭孢菌素類抗生素（頭孢他啶、頭孢唑林、頭孢曲松）、青霉素類抗生素（哌拉西林、阿莫西林/克拉維酸）、單環(huán)β-內(nèi)酰胺酶類抗生素（氨曲南）及磺胺類抗生素（復(fù)方磺胺甲惡唑）耐藥，ESBLs確證實(shí)驗(yàn)為陰性，表現(xiàn)出MDR。根據(jù)抗生素敏感性的差異將兩株菌標(biāo)識(shí)為HVKP臨床和MDR-HVKP臨床繼續(xù)后續(xù)研究。

2.2 HVKP臨床株和MDR-HVKP臨床株的免疫逃避能力遠(yuǎn)強(qiáng)于標(biāo)準(zhǔn)菌株

黏附試驗(yàn)顯示：3株菌在RAW264.7細(xì)胞外的黏附數(shù)4 h和24 h都為標(biāo)準(zhǔn)菌株>HVKP臨床>MDR-HVKP臨床，

差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在抗吞噬試驗(yàn)中，當(dāng)這些菌株被RAW264.7吞噬時(shí)，觀察到類似的趨勢(shì)，如表3。只有少部分的HVKP臨床和MDR-HVKP臨床株被吞噬，提示高毒力菌株有較強(qiáng)的抗吞噬特性。

2.3 HVKP臨床株和MDR-HVKP臨床株感染能促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)

在感染4 h內(nèi)，與標(biāo)準(zhǔn)菌株相比，TNF-α的表達(dá)水平在HVKP臨床（P=0.007）和MDR-HVKP臨床（P=0.009）感染后顯著升高。當(dāng)感染到達(dá)24 h時(shí)，TNF-α表達(dá)的水平均升高較少，且整體趨勢(shì)和4h時(shí)相似。對(duì)于IL-6的表達(dá)水平，與標(biāo)準(zhǔn)菌株相比4h內(nèi)在HVKP臨床（P=0.004）和MDR-HVKP臨床（P=0.124）感染后略微升高。當(dāng)感染達(dá)到24 h時(shí)，IL-6的表達(dá)水平較4 h時(shí)明顯升高，整體趨勢(shì)與4 h時(shí)相似。IL-1β的表達(dá)水平在感染4 h內(nèi)較低，在3株菌中均無顯著差異，但當(dāng)感染達(dá)到24 h時(shí)，與標(biāo)準(zhǔn)菌株相比，HVKP臨床株（P<0.001）和MDR-HVKP臨床（P<0.001）株感染更能增加IL-1β的表達(dá)水平。本研究?jī)芍闔VKP在4 h、24 h誘導(dǎo)的IL-6、IL-8和TNF-α的產(chǎn)生均顯著高于標(biāo)準(zhǔn)菌株，如圖3。提示高毒力菌株在感染鼠源巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞后，4 h內(nèi)主要通過釋放促炎因子TNF-α引起更嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，而4～24 h主要通過釋放IL-6和IL-1β來加劇炎癥反應(yīng)。

3 討論

HVKP在社區(qū)和醫(yī)院獲得性肺炎患者中普遍存在[11]，特別會(huì)對(duì)免疫功能低下的人（糖尿病或惡性腫瘤患者）引起嚴(yán)重感染，如肺炎、菌血癥或腦膜炎，臨床進(jìn)展迅速，最終預(yù)后不良[2]。本研究中兩株HVKP分離自腦部疾病和腫瘤患者，患者分別進(jìn)行過侵入性操作和免疫治療，可能造成局部免疫力薄弱而更易誘發(fā)HVKP肺部感染[2]。早期的研究將高黏液表型作為HVKP菌株的定義特征，然而并非所有的HVKP菌株都具有高黏液表型，且一些CKP菌株也具有這一特征[12]，因此需要結(jié)合其他指標(biāo)來進(jìn)行判斷。HVKP毒株最具特征性的毒力因子是由毒力質(zhì)粒上的莢膜調(diào)節(jié)基因（rmpA或rmpA2）、沙門菌素（iroBCDN）和氣桿菌素（iucABCD-iutA）鐵載體合成基因簇等編碼，這些基因在毒力過程中起著至關(guān)重要的作用，臨床上常用于檢測(cè)HVKP菌株[13]。本研究綜合考慮患者臨床情況、高黏液表型和毒力質(zhì)粒的攜帶，將菌株鑒定為HVKP，對(duì)于警示臨床防治HVKP的暴發(fā)感染具有重要意義。

巨噬細(xì)胞對(duì)細(xì)菌有較強(qiáng)的吞噬殺傷作用，細(xì)菌的抗吞噬能力越強(qiáng)則證明毒力越強(qiáng)[14]。在本研究中，初步判定為HVKP的兩個(gè)臨床分離株抵抗巨噬細(xì)胞RAW264.7吞噬殺傷的能力明顯強(qiáng)于標(biāo)準(zhǔn)菌株，表明其擁有比標(biāo)準(zhǔn)菌株更強(qiáng)的毒力。已知莢膜在感染過程中對(duì)細(xì)菌具有多種保護(hù)作用，作為一種抗吞噬因子能夠阻止細(xì)菌與哺乳動(dòng)物細(xì)胞的黏附[1]。rmpA或rmpA2協(xié)調(diào)莢膜和高黏液表型[15]，丟失可降低莢膜產(chǎn)量、黏液黏度和毒力[16]。本研究中兩株高黏液HVKP均攜帶rmpA和rmpA2基因，而在非高黏液的標(biāo)準(zhǔn)菌株中則沒有，說明rmpA和rmpA2是與高黏性相關(guān)的基因。據(jù)報(bào)道：與非高黏液分離株相比，高黏液肺炎克雷伯菌具有較低的黏附能力和較強(qiáng)的抗吞噬能力，但引起宿主細(xì)胞損傷和凋亡的程度較嚴(yán)重，高黏液表型能夠影響細(xì)菌與宿主細(xì)胞間的聯(lián)系[17-19]。高黏液表型似乎是免疫逃避更關(guān)鍵的決定因素。在本研究中高黏液型的兩株HVKP同樣具有黏附能力低而抗吞噬能力強(qiáng)的特性，與以上研究結(jié)果一致，提示高黏液HVKP菌株有較強(qiáng)的免疫逃避能力。另外推測(cè)肺炎克雷伯菌的快速黏附能夠促進(jìn)細(xì)胞對(duì)其進(jìn)行吞噬殺傷，因?yàn)榫奘杉?xì)胞胞內(nèi)吞噬的活菌數(shù)總是與胞外細(xì)菌黏附數(shù)成正比關(guān)系。盡管高黏液表型對(duì)HVKP很重要，但莢膜與高黏液表型之間的聯(lián)系仍在闡明中，高黏液表型并不一定依賴于莢膜合成[18]。高黏液表型也可能影響藥敏試驗(yàn)，隨著MDR菌株的增加，這可能成為一個(gè)更常見的問題[13]。

病原體與宿主細(xì)胞的黏附是致病性的初始階段，而隨后進(jìn)入宿主細(xì)胞，如果宿主細(xì)胞被病原體激活或者凋亡延遲，則會(huì)釋放大量自由基等有害物質(zhì)會(huì)引起機(jī)體的過度炎癥反應(yīng)，甚至遷延全身[20]。 TNF-α、IL-6、IL-1β是抗肺炎克雷伯菌感染的主要效應(yīng)因子，Cheng等[17]用乳腺炎奶牛分離的兩株肺炎克雷伯菌感染牛微血管內(nèi)皮細(xì)胞，結(jié)果顯示兩株菌均能促進(jìn)IL-6、IL-1β和TNF-α產(chǎn)生，且高黏液分離株激發(fā)了更明顯的促炎反應(yīng)。另一研究同樣顯示高黏液HVKP對(duì)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的致炎性較非高黏液的經(jīng)典的肺炎克雷伯菌更強(qiáng)[14]。在本研究中得到了同樣的趨勢(shì)，兩株具有高黏液表型的HVKP菌株在4 h和24 h都引起了更嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。TNF-α是革蘭陰性菌急性炎癥反應(yīng)的主要介質(zhì)，出現(xiàn)在感染的最初幾個(gè)小時(shí)內(nèi)，主要由激活的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生然后刺激中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞募集到感染部位，并激活這些細(xì)胞以清除微生物[4]。在與TNF-α的聯(lián)合作用中，IL-1β被認(rèn)為對(duì)自然免疫和炎癥起作用，它的產(chǎn)生可能是由細(xì)菌產(chǎn)物如脂多糖，以及其他細(xì)胞因子如TNF-α本身誘導(dǎo)的[21]。Friedrich等[22]的肺炎克雷伯菌小鼠膿毒癥模型中描述到感染病灶中IL-1β水平升高出現(xiàn)在TNF-α升高之后，特別是在細(xì)菌滴注72 h之后。然而，本研究結(jié)果顯示在高毒力菌株感染最初的4 h TNF-α基本達(dá)到最大釋放量，感染4 h之后到達(dá)24 h主要通過釋放IL-6和IL-1β來加劇炎癥反應(yīng)，3種炎癥因子的釋放均出現(xiàn)較早，可能是感染模型與菌株毒力的不同造成的差異。

綜上所述，本研究分離的高毒力菌株具有高黏液表型、表達(dá)毒力質(zhì)粒相關(guān)基因及免疫逃避能力強(qiáng)的特性，且感染鼠源巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞后，可釋放促炎因子TNF-α、IL-6和IL-1β引起嚴(yán)重感染。雖然目前由于敏感性和特異性問題拉絲試驗(yàn)作為高毒力篩查方法存在缺陷，但因操作簡(jiǎn)單用于臨床初步篩查高毒力菌株還是非常具有參考意義的。必要時(shí)要充分考慮將患者臨床情況、菌株表型、毒力基因攜帶情況及免疫逃避能力等結(jié)合起來判斷菌株是否為HVKP，然后對(duì)分離的HVKP菌株及時(shí)給予高度關(guān)注并采取適當(dāng)治療措施。本院的MDR-HVKP菌株很可能是由經(jīng)典的MDR菌株獲得了一個(gè)毒力質(zhì)粒進(jìn)化而來，MDR-HVKP菌株具備經(jīng)典多重耐藥菌株擁有的高耐藥性和高傳播能力，這應(yīng)當(dāng)引起相關(guān)科室的足夠重視。然而本研究標(biāo)本源于臨床存在較多未知因素，量少不足以代表絕大多數(shù)HVKP，在進(jìn)一步的研究中將進(jìn)行全基因組測(cè)序完善菌株信息，以比較這兩個(gè)分離株的不同而在細(xì)胞水平做更加深入的機(jī)制研究。

參 考 文 獻(xiàn)

Paczosa M K， Mecsas J. Klebsiella pneumoniae： Going on the offense with a strong defense[J]. Microbiol Mol Biol Rev， 2016， 80（3）： 629-661.

Russo T A， Marr C M. Hypervirulent Klebsiella pneumoniae[J]. Clin Microbiol Rev， 2019， 32（3）： e00001-19.

Gu D X， Huang Y L， Ma J H， et al. Detection of colistin resistance gene mcr-1 in hypervirulent Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli isolates from an infant with diarrhea in China[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2016， 60（8）： 5099-5100.

Shu L， Dong N， Lu J， et al. Emergence of OXA-232 carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae that carries a plvpk-like virulence plasmid among elderly patients in China[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2019， 63（3）： 1-13.

Zhang Y， Jin L， Ouyang P， et al. Evolution of hypervirulence in carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae in China： A multicentre， molecular epidemiological analysis[J]. J Antimicrob Chemother， 2020， 75（2）： 327-336.

Saha P， Xiao X， Yeoh B S， et al. The bacterial siderophore enterobactin confers survival advantage to Salmonella in macrophages[J]. Gut Microbes， 2019， 10（3）： 412-423.

Probst J J， Martins G H C， Dos Santos Sumar A H， et al. Pulmonary and muscle profile in pneumosepsis： A temporal analysis of inflammatory markers[J]. Cytokine， 2019， 114： 128-134.

徐方明， 蘇叢， 伍婷， 等. CRISPR/Cas9技術(shù)敲除RAW264.7細(xì)胞的GPR43基因抑制其對(duì)肺炎克雷伯菌的吞噬功能[J]. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志， 2020， 36（6）： 481-486.

Zhan L， Wang S， Guo Y， et al. Outbreak by hypermucoviscous Klebsiella pneumoniae ST11 isolates with carbapenem resistance in a tertiary hospital in China[J]. Front Cell Infect Microbiol， 2017， 7： 182.

Yu F， Lv J， Niu S， et al. Multiplex PCR analysis for rapid detection of Klebsiella pneumoniae carbapenem-resistant （sequence type 258 [ST258] and ST11） and hypervirulent （ST23， ST65， ST86， and ST375） strains[J]. J Clin Microbiol， 2018， 56（9）： e00731-18.

Liu C， Du P， Xiao N， et al. Hypervirulent Klebsiella pneumoniae is emerging as an increasingly prevalent K. pneumoniae pathotype responsible for nosocomial and healthcare-associated infections in Beijing， China[J]. Virulence， 2020， 11（1）： 1215-1224.

Yang Q， Jia X， Zhou M， et al. Emergence of ST11-K47 and ST11-K64 hypervirulent carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae in bacterial liver abscesses from China： A molecular， biological， and epidemiological study[J]. Emerg Microbes Infect， 2020， 9（1）： 320-331.

Choby J E， Howard-Anderson J， Weiss D S. Hypervirulent Klebsiella pneumoniae-clinical and molecular perspectives[J]. J Intern Med， 2020， 287（3）： 283-300.

惠靖雯， 倪焰， 欒潔， 等. 肺炎克雷伯菌的毒力特性及其對(duì)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞炎癥相關(guān)因子表達(dá)的影響. 眼科新進(jìn)展[J]. 眼科新進(jìn)展， 2018， 38（9）： 829-831.

陳辭言， 杜艷. 高毒力肺炎克雷伯菌研究進(jìn)展[J]. 中華實(shí)驗(yàn)和臨床感染病雜志（電子版）， 2019， 13（2）： 89-92.

Hsu C R， Lin T L， Chen Y C， et al. The role of Klebsiella pneumoniae rmpA in capsular polysaccharide synthesis and virulence revisited[J]. Microbiology （Reading）， 2011， 157（Pt 12）： 3446-3457.

Cheng J， Zhang J， Han B， et al. Klebsiella pneumoniae isolated from bovine mastitis is cytopathogenic for bovine mammary epithelial cells[J]. J Dairy Sci， 2020， 103（4）： 3493-3504.

Walker K A， Miner T A， Palacios M， et al. A Klebsiella pneumoniae regulatory mutant has reduced capsule expression but retains hypermucoviscosity[J]. mBio， 2019， 10（2）： e00089-19.

Palacios M， Miner T A， Frederick D R， et al. Identification of two regulators of virulence that are conserved in Klebsiella pneumoniae classical and hypervirulent strains[J]. mBio， 2018， 9（4）： e01443-18.

Chen W， Liu Y， Zhang L， et al. Nocardia cyriacigeogica from bovine mastitis induced in vitro apoptosis of bovine mammary epithelial cells via activation of mitochondrial-caspase pathway[J]. Front Cell Infect Microbiol， 2017， 7： 194.

Wajant H， Pfizenmaier K， Scheurich P. Tumor necrosis factor signaling[J]. Cell Death Differ， 2003， 10（1）： 45-65.

Friedrich O， Reid M B， Van den Berghe G， et al. The sick and the weak： Neuropathies/myopathies in the critically Ill[J]. Physiol Rev， 2015， 95（3）： 1025-1109.