周顧鑫 何月梅 陳小月 常方圓

江蘇省東臺(tái)市人民醫(yī)院 224200

宮頸癌作為臨床最常見的婦科惡性腫瘤,近年來發(fā)病已逐漸趨向于年輕化,數(shù)據(jù)顯示,我國每年有新發(fā)病例13萬,占世界宮頸癌新發(fā)病例的28%[1]。臨床雖在宮頸癌治療方面取得較大突破,但由于大多數(shù)患者確診時(shí)已處于晚期,其復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移以及病死率仍較高[2]。因此,早期診斷宮頸癌對(duì)改善患者預(yù)后有著重要的意義。鈉氫交換子調(diào)節(jié)因子1(Na+/H+exchanger regulating factor 1,NHERF1)是一種由358個(gè)氨基酸組成的多功能連接蛋白,既往研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌病情發(fā)展中發(fā)揮重要作用[3-4]。NF2是Ⅱ型神經(jīng)纖維瘤病的關(guān)鍵基因,作為一種抑癌因子,在很多腦瘤中表達(dá)缺失,并且其編碼Merlin蛋白功能的缺失是造成腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要因素[5-6]。目前NHERF1、NF2表達(dá)與宮頸癌的關(guān)系尚不清楚。因此,本研究擬分析宮頸癌組織中NHERF1、NF2蛋白表達(dá)水平及臨床預(yù)后意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年7月—2017年7月經(jīng)我院病理檢查確診的80例宮頸癌患者作為研究對(duì)象,年齡30～70歲,平均年齡(50.69±3.33)歲。收集80例宮頸癌癌組織標(biāo)本及癌旁組織(距腫瘤邊緣2cm處)標(biāo)本。本研究已獲我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合宮頸癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[7],并經(jīng)術(shù)后病理檢查已確診;(2)知情同意;(3)術(shù)前未行放化療治療。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)伴有其他惡性腫瘤者;(2)重要臟器功能障礙者;(3)術(shù)前接受放療、化療及生物治療者;(4)精神病史或存在語言、認(rèn)知功能障礙者;(5)臨床、隨訪資料不全者;(6)無法完全配合治療者。本研究所有患者以術(shù)后出院為觀察點(diǎn),采用電話、門診復(fù)診或者上門等及結(jié)合復(fù)診病歷等方式隨訪5年,隨訪截至2022年7月30日或患者死亡。

1.2 方法

1.2.1 NHERF1、NF2表達(dá)檢測方法。本研究所有組織標(biāo)本均經(jīng)石蠟、包埋、4μm連續(xù)切片、脫蠟,再用梯度酒精脫去苯至水以及蘇木素染色后確定病變區(qū)域,隨后采用檸檬酸修復(fù)液高溫高壓修復(fù)抗原,冷卻后經(jīng)PBS漂洗3次(3min/次),再加入按比例稀釋的一抗(NHERF1鼠抗人單克隆抗體,購自美國Santa Cruz生物技術(shù)公司)4℃孵育過夜,PBS漂洗3次(3min/次),加入按比例稀釋的二抗(NF2鼠抗人單克隆抗體,購自美國Santa Cruz生物技術(shù)公司)37℃孵育30min,PBS漂洗3次(3min/次),使用DAB顯色、蘇木素復(fù)染、樹脂膠封片,鏡下觀察染色情況。一切操作均嚴(yán)格按照SP試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.2 結(jié)果判定[8]。免疫結(jié)果由兩位高年資的病理醫(yī)師共同采用雙盲法完成。隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野(×400),每個(gè)視野讀取細(xì)胞計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞,最終根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分比進(jìn)行綜合評(píng)分。陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分:無色為0分、淺黃色為1分、棕色為2分、深褐色為3分。陽性細(xì)胞占總細(xì)胞百分比:<25%為1分、26%～50%為2分、51%～75%為3分、>75%為4分。最終得分為陽性細(xì)胞百分比和染色強(qiáng)度平均分乘積,≥3分為陽性表達(dá),< 3分為陰性表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23. 0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗(yàn);采用Kaplan-Meier法分析宮頸癌預(yù)后生存情況;采用單因素和多因素Cox模型分析影響宮頸癌患者預(yù)后的相關(guān)因素,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NHERF1、NF2在宮頸癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況 宮頸癌組織中的NHERF1、NF2陽性表達(dá)率分別低于癌旁組織NHERF1、NF2陽性表達(dá)率(P<0.05),見表1。

表1 NHERF1、NF2在宮頸癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況[n(%)]

2.2 NHERF1、NF2表達(dá)與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系 NHERF1、NF2表達(dá)水平與宮頸癌患者的年齡、腫瘤直徑、深層肌浸潤均無明顯關(guān)系(P>0.05);NHERF1、NF2表達(dá)水平與宮頸癌臨床分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在顯著關(guān)系(P<0.05),見表2。

表2 NHERF1、NF2表達(dá)與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系

2.3 NHERF1、NF2表達(dá)與宮頸癌患者預(yù)后的關(guān)系 80例宮頸癌患者的5年生存率為43.75%(35/80)。NHERF1陽性、陰性宮頸癌患者的5年生存率分別為66.67%(18/27)、32.08%(17/53),二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);NF2陽性、陰性患者5年生存率分別為68.97%(20/29)、29.41%(15/51),二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 宮頸癌預(yù)后的單因素分析 單因素分析得出:不同臨床分期、分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移、NHERF1及NF2表達(dá)的宮頸癌患者5年生存率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表3。

表3 宮頸癌患者預(yù)后的單因素分析[n(%)]

2.5 宮頸癌預(yù)后的多因素Cox回歸分析 多因素Cox回歸分析得出:臨床Ⅲ/Ⅳ期、低分化、淋巴轉(zhuǎn)移、NHERF1陰性、NF2陰性均為宮頸癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05),見表4。

表4 宮頸癌預(yù)后的多因素Cox回歸分析

3 討論

宮頸癌作為發(fā)病率僅次于乳腺癌的常見的婦科惡性腫瘤,近年來受環(huán)境改變以及性傳播疾病的影響,宮頸癌發(fā)病率不僅逐年升高,且逐漸趨向年輕化[9]。世界衛(wèi)生組織報(bào)告,我國宮頸癌發(fā)病率為14.6/10萬[10],每年宮頸癌新發(fā)病例為13萬例,每年死亡病例為5.3萬例[11]。雖然隨著科技和醫(yī)療的進(jìn)步可有效控制疾病進(jìn)展,但晚期宮頸癌患者預(yù)后生存率仍不理想。因此,尋找影響宮頸癌患者病情進(jìn)展和預(yù)后的相關(guān)因素并積極予以干預(yù),是改善宮頸癌患者預(yù)后的關(guān)鍵。近年來隨著對(duì)宮頸癌的深入研究發(fā)現(xiàn),分子生物學(xué)在涉及宮頸癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移等各個(gè)方面。而本研究主要是分析宮頸癌組織中NHERF1、NF2蛋白表達(dá)水平及與臨床預(yù)后意義。

NHERF1即膜—細(xì)胞骨架結(jié)合磷酸化蛋白50(Ezrin-radixin-moesin binding phosphoprotein 50,EBP50),作為一種由358個(gè)氨基酸組成的多功能連接蛋白,可通過PDZ-1、PDZ-2和EB結(jié)構(gòu)域與多種蛋白質(zhì)結(jié)合[12]。NHERF1目前在腫瘤疾病中具有抗腫瘤或促腫瘤功能,有文獻(xiàn)表明, 肝細(xì)胞癌細(xì)胞株標(biāo)本中, EBP50表達(dá)明顯升高[13]。但同時(shí)研究顯示,乳腺癌組織中NHERF1表達(dá)量低于癌旁組織,并影響了乳腺癌的惡性表型[14],結(jié)腸癌組織EBP50蛋白表達(dá)下調(diào),與結(jié)腸癌臨床病理特征有一定關(guān)系[15]。本研究分析發(fā)現(xiàn),宮頸癌組織中NHERF1陽性表達(dá)率明顯低于癌旁組織,且NHERF1表達(dá)水平與宮頸癌臨床分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在顯著關(guān)系(P<0.05),說明NHERF1在宮頸癌組織中表達(dá)降低,且與疾病的發(fā)生、發(fā)展存在一定聯(lián)系,與既往其他癌癥中的表達(dá)結(jié)果類似。本研究預(yù)后分析顯示,NHERF1陽性宮頸癌患者5年生存率高于陰性患者(P<0.05),提示NHERF1表達(dá)與宮頸癌預(yù)后密切相關(guān)。與肖雪蘭[16]的研究結(jié)果(EBP50在透明細(xì)胞性腎細(xì)胞癌高表達(dá)患者的預(yù)后生存期明顯長于低表達(dá)患者)相符。多因素分析發(fā)現(xiàn),NHERF1陰性表達(dá)是宮頸癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05),證實(shí)NHERF1在宮頸癌的發(fā)生、進(jìn)展以及預(yù)后中有著重要的作用。NHERF1作為一種新發(fā)現(xiàn)的乳腺癌抑制基因,具有調(diào)控細(xì)胞周期、促進(jìn)凋亡和抑制腫瘤等作用[17]。既往研究顯示,NHERF1可能有助于調(diào)節(jié)其核積累的分子變化,抑制腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞增殖[18]。因此,本研究宮頸癌患者NHERF1表達(dá)降低,說明其抑癌作用減弱,導(dǎo)致癌細(xì)胞增殖及侵襲能力增強(qiáng),進(jìn)而增加患者預(yù)后不良發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。

NF2作為腫瘤抑制基因,其編碼蛋白-Merlin蛋白是ERM家族的成員之一,具有調(diào)控細(xì)胞增殖信號(hào)及導(dǎo)致腫瘤發(fā)生等作用。既往研究顯示,NF2基因突變可導(dǎo)致其編碼蛋白Merlin缺失,進(jìn)而引起Ⅱ型神經(jīng)纖維瘤病發(fā)生[19]。同時(shí)研究顯示,肝癌細(xì)胞中恢復(fù)Merlin表達(dá)可減少TGF-β1的表達(dá),抑制肝纖維化的發(fā)生[20]。本研究分析發(fā)現(xiàn),宮頸癌組織中NF2陽性表達(dá)率明顯低于癌旁組織,且與宮頸癌臨床分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在顯著關(guān)系(P<0.05),說明NF2低表達(dá)在腫瘤進(jìn)展過程中具有推動(dòng)和促進(jìn)腫瘤進(jìn)展以及更早發(fā)生轉(zhuǎn)移的惡性作用。本研究結(jié)果顯示,NF2陽性患者5年生存率高于陰性患者(P<0.05),說明NF2表達(dá)與宮頸癌預(yù)后密切相關(guān)。多因素分析顯示,NF2陰性表達(dá)是宮頸癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05),證實(shí)NF2表達(dá)與宮頸癌發(fā)生、進(jìn)展以及預(yù)后有關(guān)。NF2基因是一種腫瘤抑制基因,當(dāng)其失活可誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生。因此本研究宮頸癌患者NF2表達(dá)降低時(shí),說明其抑癌作用減弱,導(dǎo)致患者病情加重,影響其預(yù)后。

綜上所述,宮頸癌組織中NHERF1、NF2蛋白均呈低表達(dá)水平,且表達(dá)水平與臨床病理特征及預(yù)后有關(guān),有望作為臨床評(píng)估宮頸癌預(yù)后的有效標(biāo)志物。但本研究為單中心,更多研究結(jié)果需在今后進(jìn)一步分析。