譚秀文 孟憲鋒 劉昭華 劉興華 朱榮生 王可 崔緒奎 王建英 靳青

摘要：瘤胃是反芻動(dòng)物重要的消化器官，瘤胃微生物的組成及其多樣性直接關(guān)系到反芻動(dòng)物對(duì)飼料的消化利用。本研究通過(guò)測(cè)定不同月齡魯西黑頭羊瘤胃液微生物菌群多樣性及組成結(jié)構(gòu)，探索瘤胃微生物發(fā)育規(guī)律，為魯西黑頭羊高技飼養(yǎng)提供理論依據(jù)。結(jié)果表明：（1）Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)各組之間無(wú)顯著性差異．ACE指數(shù)和Cha01指數(shù)3月齡顯著低于6月齡和12月齡；（2）擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）和厚壁菌門(mén)（FirmicuLes）為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，普雷沃菌屬（PrevoreDa）為瘤胃優(yōu)勢(shì)菌屬，但各類群豐度在不同月齡間存在顯著差異；（3）PCA分析顯示，3月齡魯西黑頭羊瘤胃菌群個(gè)體間差異較?。?月齡與12月齡明顯分離，表明菌群結(jié)構(gòu)差異較大。綜上，魯西黑頭羊瘤胃菌群在3月齡時(shí)相對(duì)穩(wěn)定，隨著月齡的增長(zhǎng)，群落豐富度有所提高，表明3月齡時(shí)瘤胃功能仍在發(fā)育。

關(guān)鍵詞：魯西黑頭羊；瘤胃；細(xì)菌；多樣性

中圖分類號(hào)：S826.9+21 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2023）02-0155-04

瘤胃是反芻動(dòng)物特有的消化器官，也是反芻動(dòng)物消化和代謝的重要場(chǎng)所。瘤胃能夠消化飼料中70%-85％的可消化物和50%的粗纖維，在此過(guò)程中，瘤胃微生物發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。瘤胃微生物可將飼糧中的養(yǎng)分經(jīng)發(fā)酵轉(zhuǎn)化為可供反芻動(dòng)物吸收利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，為維持動(dòng)物正常生理活動(dòng)以及生產(chǎn)肉類和奶制品提供所需能量和營(yíng)養(yǎng)，因此瘤胃微生物充當(dāng)了主要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)“轉(zhuǎn)換器”。

反芻動(dòng)物的瘤胃在斷奶前類似于非反芻哺乳動(dòng)物的單胃，斷奶后逐漸發(fā)育具備反芻功能，成年后瘤胃占整個(gè)消化系統(tǒng)的60％-80％。幼齡反芻動(dòng)物瘤胃微生物區(qū)系豐富度相對(duì)較低，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)在數(shù)量和種類上發(fā)生明顯變化，發(fā)育成熟后達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，功能也逐漸完善，在反芻動(dòng)物消化代謝和健康維持過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

瘤胃及瘤胃微生物的發(fā)育受反芻動(dòng)物品種、年齡、營(yíng)養(yǎng)水平等多種因素的影響，充分了解瘤胃微生物區(qū)系的發(fā)育特點(diǎn)，是挖掘生產(chǎn)潛力的重要依據(jù)。魯西黑頭羊是以山東省地方品種小尾寒羊?yàn)槟副?、以南非黑頭杜泊綿羊作父本雜交選育而成的優(yōu)質(zhì)肉羊新品種，關(guān)于其瘤胃微生物的結(jié)構(gòu)及發(fā)育規(guī)律目前尚未展開(kāi)研究。為此，本試驗(yàn)對(duì)不同生長(zhǎng)階段魯西黑頭羊公羊瘤胃微生物區(qū)系進(jìn)行比較分析，以期為提高魯西黑頭羊生產(chǎn)性能提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1樣品采集

以山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所培育的肉羊新品種魯西黑頭羊?yàn)檠芯繉?duì)象，在魯西黑頭羊核心育種場(chǎng)隨機(jī)選取3月齡、6月齡、12月齡3個(gè)年齡段的魯西黑頭羊各4只。晨飼6h后通過(guò)胃管式瘤胃液采樣器（武漢科立博牧業(yè)科技有限公司）采集瘤胃液，分裝于15 mL離心管，液氮速凍，帶回實(shí)驗(yàn)室后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存待測(cè)。

1.2瘤胃液細(xì)菌測(cè)定

瘤胃細(xì)菌16S rDNA測(cè)序委托北京諾禾致源科技股份有限公司完成。首先，采用SDS方法對(duì)樣本的基因組DNA進(jìn)行提取，之后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA純度和濃度，使用無(wú)菌水稀釋樣本至1 ng/uL。然后，以稀釋的基因組DNA為模板，以細(xì)菌16S rDNA V4區(qū)引物（515F和806R）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用2％瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，合格后進(jìn)行等量混樣并回收；最后，使用TruSeq@ DNA PCR-Free SamplePreparation Kit建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，利用Illumina Miseq 2500高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.3數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

測(cè)序完成后，使用FLASH（V 1.2.7）對(duì)樣本的Reads進(jìn)行拼接，使用fastp軟件對(duì)拼接得到的Raw Tags進(jìn)行過(guò)濾得到高質(zhì)量的Clean Tags，Uchime algorithm去除其中的嵌合體序列后得到最終的有效數(shù)據(jù)（Effective Tags）。利用Uparse算法（Uparsev 7.0.1001）對(duì)全部Effective Tags進(jìn)行聚類，以97％的一致性（idemity）將序列聚類成為OTUs。用Mothur方法與SILVA138的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種注釋與分析，使用Qiime軟件（Version 1.9.1）計(jì)算Chao 1、Shannon、Simpson、ACE、Goods-coverage指數(shù)，使用R軟件（Version2.15.3）繪制PCA圖。

數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2007進(jìn)行整理，使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析，并采用Duncan's法進(jìn)行多重比較，P<0.05表示差異顯著。

2結(jié)果與分析

2.1不同月齡魯西黑頭羊瘤胃細(xì)菌OTUs分析

為研究不同月齡魯西黑頭羊瘤胃細(xì)菌的物種組成，對(duì)所有樣本的Effective Tags以97%的一致性進(jìn)行OTUs聚類，共產(chǎn)生5 708個(gè)OTUs（圖1），3月齡、6月齡、12月齡分別有3 559、3 824、3833個(gè)，三組共同擁有的OTUs為2 216個(gè)。這表明不同月齡魯西黑頭羊瘤胃菌群結(jié)構(gòu)具有一定的特異性與相似性。平均序列長(zhǎng)度為414 bp，所有樣品測(cè)序覆蓋率均在99.6％以上，表明測(cè)序深度能夠準(zhǔn)確反映瘤胃細(xì)菌的組成。

2.2不同月齡魯西黑頭羊瘤胃細(xì)菌alpha多樣性

對(duì)不同月齡魯西黑頭羊瘤胃細(xì)菌多樣性指數(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果（表1）顯示，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)在各月齡間無(wú)顯著差異，表明各月齡間瘤胃細(xì)菌群落多樣性相似：Chao 1指數(shù)和ACE指數(shù)在3月齡顯著低于6月齡和12月齡，6月齡和12月齡間無(wú)顯著差異，表明6月齡和12月齡的魯西黑頭羊細(xì)菌群落豐富度較3月齡時(shí)顯著升高。

2.3不同月齡魯西黑頭羊瘤胃細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)

對(duì)所得有效序列在不同分類水平上進(jìn)行物種注釋和統(tǒng)計(jì)，魯西黑頭羊瘤胃液中共注釋到細(xì)菌界和古生菌界微生物46門(mén)99綱272科342屬。對(duì)總豐度前10的物種在門(mén)水平和屬水平上進(jìn)行分析，結(jié)果（圖2）顯示，在門(mén)水平上，擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）和厚壁菌門(mén)（Firmicutes）為魯西黑頭羊瘤胃中的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，平均相對(duì)豐度分別為54.09％和21.17％：其次為廣古菌門(mén)（Euryarchaeota）和變形菌門(mén)（Proteobacteria），平均相對(duì)豐度分別為4.98%和3.64％，其他菌門(mén)相對(duì)豐度均低于3%。擬桿菌門(mén)的相對(duì)豐度隨月齡的增長(zhǎng)而升高，12月齡極顯著高于3月齡和6月齡（P<0.01）：3月齡厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度顯著高于6月齡和12月齡（P<0.05）。

在屬水平上，普雷沃菌屬（Ptevotella）為瘤胃優(yōu)勢(shì)菌屬，相對(duì)豐度為19.75%-25.80%，且12月齡顯著高于3月齡（P<0.05）；其次為Rikenellace-ae_RC9_gut_group和Methanobrevibacter，平均相對(duì)豐度分別為9.83%和4.98%，各月齡間無(wú)顯著差異；瘤胃球菌屬（Runminococcus）在3月齡時(shí)平均相對(duì)豐度為3.2%，到12月齡時(shí)顯著降至0.89％（P<0.05）。

2 4不同月齡魯西黑頭羊瘤胃細(xì)菌主成分分析

如圖3所示，第一主成分和第二主成分的貢獻(xiàn)率分別為17.65%和13.31％。3月齡各樣本聚集在一起，表明個(gè)體間差異較小：6月齡組與12月齡組較為分散，表明個(gè)體間有一定的差異。與3月齡組相比，6月齡組群落結(jié)構(gòu)差異不明顯，但表現(xiàn)出分離的趨勢(shì)，12月齡組與3月齡組能很好地分離，表明3月齡組和12月齡組間群落結(jié)構(gòu)差異顯著。

3討論與結(jié)論

瘤胃是反芻動(dòng)物區(qū)別于其他哺乳動(dòng)物的消化器官，剛出生時(shí)瘤胃微生物的組成相對(duì)單一，隨著對(duì)母乳及飼糧的采食，瘤胃不斷發(fā)育，瘤胃微生物逐漸定殖并繁殖，最終形成穩(wěn)定微生物區(qū)系，以維持反芻動(dòng)物正常的生長(zhǎng)發(fā)育需求。幼齡階段的瘤胃微生物區(qū)系組成與成熟動(dòng)物差異明顯，一般情況下，將4周歲以后反芻動(dòng)物的瘤胃微生物區(qū)系定義為成熟的瘤胃微生物區(qū)系。另有研究認(rèn)為，在2周歲以前反芻動(dòng)物瘤胃微生物都有可能發(fā)生較大變化。本研究中，魯西黑頭羊在3月齡時(shí)的瘤胃微生物豐富度顯著低于6月齡和12月齡，且個(gè)體間差異較小。這說(shuō)明此時(shí)瘤胃菌群相對(duì)比較均一，仍處于快速發(fā)展時(shí)期，若此時(shí)通過(guò)優(yōu)化飼糧組成以及合理使用添加劑等調(diào)控手段對(duì)瘤胃微生物進(jìn)行干預(yù)以加強(qiáng)瘤胃的消化代謝功能，仍可取得一定的效果。隨著月齡的增加和瘤胃的發(fā)育，6月齡之后至成年，瘤胃菌群逐漸趨于成熟達(dá)到各自的“穩(wěn)態(tài)”，再對(duì)其進(jìn)行調(diào)整，難度增大。

馬健等統(tǒng)計(jì)表明，反芻動(dòng)物瘤胃微生物區(qū)系在門(mén)水平上以變形菌門(mén)（Proteobacteria）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）和擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）細(xì)菌為優(yōu)勢(shì)菌，在屬水平上以普雷沃菌屬（Prevotella）細(xì)菌為優(yōu)勢(shì)菌，但其在不同年齡段所占比例不同，其中變形菌門(mén)的豐度隨動(dòng)物年齡的增長(zhǎng)顯著降低。本研究中，擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）和厚壁菌門(mén)（Firmicutes）在魯西黑頭羊瘤胃菌群中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，且擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）豐度隨月齡顯著增長(zhǎng)，變形菌門(mén)（Proteobacteria）豐度隨月齡的增長(zhǎng)顯著降低，與以上研究結(jié)果一致，說(shuō)明試驗(yàn)羊瘤胃發(fā)育正常，微生物區(qū)系處于動(dòng)態(tài)平衡，體況較佳；在屬水平上，普雷沃菌屬（Prevotella）相對(duì)豐度在20%左右，且12月齡時(shí)較3月齡顯著提高，說(shuō)明瘤胃降解蛋白、淀粉等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化代謝能力有所增強(qiáng)。

綜上，魯西黑頭羊在3月齡之前，瘤胃仍處于快速發(fā)育階段，微生物區(qū)系具有較高的可塑性。在飼養(yǎng)管理過(guò)程中，可在3月齡前對(duì)其進(jìn)行有效調(diào)控，為后期生產(chǎn)性能的提高奠定基礎(chǔ)。