盛政，杜文凱，王崇崇，張博安，張海華*，杜琪珍*

茶多酚對(duì)茶食品中還原糖檢測方法的影響

盛政1，杜文凱2，王崇崇1，張博安1，張海華1*，杜琪珍1*

1. 浙江農(nóng)林大學(xué)食品與健康學(xué)院，浙江 杭州 311300；2. 浙江省糧油產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)中心，浙江 杭州 310012

為尋找準(zhǔn)確測定茶面制品消化產(chǎn)物中還原糖含量的方法，選取了表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、沒食子酸、原花青素和阿魏酸4種典型酚類物質(zhì)，分別以單獨(dú)的酚類、酚類與葡萄糖共混、酚類與淀粉酶解物共混體系為樣品，研究酚類物質(zhì)對(duì)3,5-二硝基水楊酸（DNS）法、葡萄糖氧化酶/過氧化物酶（GOPOD）法和熒光輔助糖電泳（FACE）法定量測定還原糖的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，阿魏酸對(duì)DNS法無影響，EGCG、沒食子酸和原花青素可與DNS反應(yīng)顯色，表明其會(huì)影響DNS法的準(zhǔn)確性；4種酚類物質(zhì)均顯著降低了GOPOD法測定的葡萄糖結(jié)果，而FACE法不受酚類影響且能直觀表征淀粉酶解物中低聚還原糖分布。因此，F(xiàn)ACE法在測定茶面制品及其酶解消化物中還原糖含量方面有較好的應(yīng)用價(jià)值。

茶食品；茶多酚；EGCG；還原糖含量；熒光輔助糖電泳

茶是世界上消費(fèi)量最大的飲料之一，因其含有豐富的茶多酚、礦物質(zhì)、膳食纖維等營養(yǎng)素，可預(yù)防肥胖、代謝綜合征、糖尿病、癌癥等慢性疾病而被廣泛關(guān)注[1-4]。茶面制品是茶或茶的功能成分融入以糧食為主料加工而成的食品[5]。茶面制品作為一種新型復(fù)合食品，是發(fā)揮茶的保健功能的重要方式，契合人們對(duì)于食品的健康功能性新需求。

茶多酚良好的生理活性使其在健康食品的開發(fā)和功能強(qiáng)化方面表現(xiàn)出較高的應(yīng)用潛力，尤其是在預(yù)防糖尿病，以及防控餐后高血糖反應(yīng)等方面是目前研究的熱點(diǎn)[6]，而準(zhǔn)確檢測還原糖含量是這方面研究工作科學(xué)性的關(guān)鍵和前提。當(dāng)前測定食品還原糖廣泛使用的化學(xué)方法有3,5-二硝基水楊酸（DNS）法和葡萄糖氧化酶/過氧化物酶試劑盒（GOPOD）法[7-8]，具有快速便捷、價(jià)格低、易操作的優(yōu)點(diǎn)。例如，采用DNS法測定還原糖含量用于表征基于淀粉酶抑制的茉莉花茶拼配效果[9]；采用DNS法測定文冠果芽茶與葉茶的還原糖和可溶性多糖[10]；GOPOD法則常被用于測定綠茶面條、EGCG-木薯淀粉等茶面食品中淀粉的消化率[11-12]。此外，還有熒光輔助糖電泳法（FACE），可測定單糖和寡糖分布[13]。但在嘗試采用DNS法和GOPOD法測定含有茶多酚的還原糖體系時(shí)發(fā)現(xiàn)茶多酚的存在可能干擾了還原糖測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，有必要評(píng)估多酚類物質(zhì)對(duì)DNS法、GOPOD法和FACE法測定還原糖的影響，以期找到適用于多酚共存體系中還原糖的檢測方法。

基于此，本研究選取茶多酚中沒食子酸、阿魏酸、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、原花青素4種單體，分別對(duì)應(yīng)羥基苯甲酸類酚酸、羥基肉桂酸類酚酸、單體黃烷醇類和聚合黃烷醇類4種類型多酚（圖1[14-15]），研究其對(duì)DNS法、GOPOD法和FACE法測定還原糖的影響，并分析其可能的原因，以期找到適用的還原糖測定方法。

圖1 4種類型酚類物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥淀粉（含量≥87%）食品級(jí)，購于山東渠風(fēng)食品科技有限公司；EGCG（純度≥98%）食品級(jí)，購于江蘇德和生物科技有限公司；葡萄糖（≥99%）、麥芽糖（≥95%）、麥芽三糖（≥95%）、麥芽四糖（≥98%）、麥芽五糖（≥95%）、麥芽六糖（≥95%）、麥芽七糖（≥90%）和麥芽八糖（≥90%）8種還原糖標(biāo)準(zhǔn)品，-淀粉酶（貨號(hào)S31769，2?U·mg-1），三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽和磷酸二氫鈉，購于上海源葉生物科技有限公司；阿魏酸（≥99%）、沒食子酸（≥99%）、原花青素（≥95%）、,′-亞甲基雙丙烯酰胺（NAPP，≥99%）、,,,-四甲基乙二胺（TEMED、≥99%）、丙烯酰胺（≥99%）、8-氨基1,3,6-萘三磺酸二鈉鹽（ANTS，≥98%）、過硫酸銨（≥99%）和氰基硼氫化鈉（NaCNBH3，≥95%），購于上海麥克林生化科技有限公司；葡萄糖氧化酶/過氧化物酶試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

真空冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），PHS-920型pH計(jì)（上海騁克儀器有限公司），JY04S-3C凝膠成像分析系統(tǒng)（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司），DYY-6C電泳儀電源和DYCZ-24EN型雙垂直電泳儀（北京六一生物科技有限公司），SYC-C型電熱恒溫調(diào)速振蕩器（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司），HBS-1096A酶標(biāo)儀（南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），UV-6100A紫外分光光度計(jì)（上海Metash儀器有限公司）。

1.3 淀粉酶解物的制備

將5.0?g小麥淀粉分散在150?mL磷酸鹽緩沖液中（0.2?mol·L-1，pH 5.2），混合均勻后在37?℃恒溫振蕩水浴鍋中預(yù)熱5?min。隨后向淀粉溶液中加入1?mL-淀粉酶，于37?℃水浴20?min。然后，將淀粉溶液沸水浴5?min以滅活-淀粉酶。冷卻至室溫后，在4?℃、8?000轉(zhuǎn)速下離心5?min，保留上清液。

1.4 還原糖測定方法

1.4.1 DNS比色法

以單獨(dú)葡萄糖溶液（0.2?mg·mL-1）、多酚-葡萄糖混合液（多酚質(zhì)量濃度依次為0、1、5、10?mg·mL-1，葡萄糖質(zhì)量濃度為0.2?mg·mL-1）和多酚-淀粉酶解物混合溶液（多酚質(zhì)量濃度依次為0、1、5、10?mg·mL-1）為樣品，分別標(biāo)記為G、PG、PS；葡萄糖溶液（質(zhì)量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0?mg·mL-1）為還原糖標(biāo)準(zhǔn)品。

取1.0?mL樣品與0.5?mL DNS溶液均勻混合后，置于沸水浴5?min轉(zhuǎn)至冰水冷卻后，加水4?mL，以水為空白在540?nm下測定吸光度[16]，采用線性回歸法擬合回歸曲線。

1.4.2 GOPOD法

使用葡萄糖氧化酶/過氧化物酶試劑盒，按試劑盒說明，在505?nm處測定0.2?mg·mL-1葡萄糖溶液和多酚-葡萄糖混合溶液（多酚質(zhì)量濃度依次為0、1、5、10?mg·mL-1，葡萄糖質(zhì)量濃度為0.2?mg·mL-1）吸光值。

1.4.3 熒光輔助糖電泳法（FACE）

分別配制葡萄糖、麥芽糖、麥芽標(biāo)準(zhǔn)品系列溶液，配制的質(zhì)量濃度都為1、2、3、4?mg·mL-1；配制酚類物質(zhì)-淀粉酶解液樣品，配制的酚類物質(zhì)質(zhì)量濃度依次為1、5、10?mg·mL-1。

按照FACE法流程處理[17]，具體操作如下：

樣品衍生處理：用NaCNBH3和ANTS溶液各10?μL在37?℃下衍生樣品16?h后進(jìn)行冷凍干燥。使用時(shí)用250?μL甘油水溶液（1︰4，︰）復(fù)溶。

分離膠的制備：制備60%（/）丙烯酰胺、1.6%（/）,′-亞甲基雙丙烯酰胺的凝膠貯存液，微孔濾膜過濾。儲(chǔ)備凝膠緩沖溶液為pH 8.8、1.5?mol·L-1的Tris-HCl。每10?mL分離膠由5?mL凝膠貯存液，2.5?mL儲(chǔ)備凝膠緩沖溶液，2.5?mL去離子水，50?μL過硫酸銨，10?μLTEMED組成。凝膠長13?cm，厚1.0?mm，孔寬為0.5?cm。

電泳條件：使用垂直凝膠電泳儀，加入pH 8.8的Tris-HCl電泳緩沖溶液，然后每個(gè)泳道上樣2?μL衍生樣品。在10?℃循環(huán)冷卻水、150?V電壓中，電泳到熒光前沿移動(dòng)至凝膠底部。

凝膠成像：電泳后采用凝膠成像儀的透射紫外模式，可視化記錄后，使用配套軟件（Gelpro32）掃描凝膠熒光強(qiáng)度。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)結(jié)果均為3次平行試驗(yàn)的平均值。采用Origin 2021軟件畫圖，采用SPSS 25軟件在<0.05水平下進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA）確定統(tǒng)計(jì)顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 酚類對(duì)DNS法測定還原糖含量的影響

DNS法測定還原糖的本質(zhì)是利用氧化還原反應(yīng)原理，即3,5-二硝基水楊酸的硝基被還原糖還原為氨基顯色，而還原糖被氧化成糖酸（圖2A）。當(dāng)用酚類物質(zhì)替代還原糖與DNS反應(yīng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)除阿魏酸以外，其他3種酚類物質(zhì)均會(huì)與DNS發(fā)生顯色反應(yīng)（圖2B），且等濃度下顯色強(qiáng)度順序?yàn)樵ㄇ嗨?EGCG>沒食子酸，這可能與酚類型尤其是酚羥基數(shù)量有關(guān)[18-20]。阿魏酸屬于羥基肉桂酸類酚酸，其與DNS試劑無顯色反應(yīng)的原因，可能是其結(jié)構(gòu)中鄰位甲氧基對(duì)酚羥基活性產(chǎn)生了影響[21]。3種顯色的酚類物質(zhì)與葡萄糖相比，等濃度下吸光度都要弱一些，說明葡萄糖更優(yōu)先與DNS反應(yīng)。進(jìn)一步分別對(duì)EGCG、沒食子酸和原花青素的DNS顯色反應(yīng)進(jìn)行濃度-吸光度線性相關(guān)性擬合，得出EGCG、沒食子酸和原花青素濃度與吸光度的相關(guān)系數(shù)（2）分別為0.980、0.896、0.996，這說明EGCG、沒食子酸和原花青素與DNS反應(yīng)存在較高的濃度線性依賴。

當(dāng)酚類物質(zhì)與葡萄糖共存時(shí)，沒食子酸（羥基苯甲酸類酚酸）、EGCG（單多酚）和原花青素（聚合多酚）都提高葡萄糖的吸光度值（圖2D），說明共存體系中3種酚類物質(zhì)仍與DNS發(fā)生了顯色反應(yīng)。將酚類物質(zhì)濃度與吸光度進(jìn)一步線性擬合，發(fā)現(xiàn)EGCG、沒食子酸仍保持較高的濃度線性相關(guān)，EGCG、沒食子酸濃度與吸光度的相關(guān)系數(shù)（2）分別為0.995和0.947，但原花青素由于是聚合多酚，容易發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，導(dǎo)致濃度線性關(guān)系不強(qiáng)，相關(guān)系數(shù)（2）僅為0.783。當(dāng)酚類物質(zhì)與淀粉酶解物（不同聚合度的還原糖）共存時(shí)，吸光度變化與葡萄糖共混體系相似，即EGCG、沒食子酸保持濃度線性相關(guān)性，EGCG、沒食子酸濃度與吸光度的相關(guān)系數(shù)（2）分別為0.994和0.987，原花青素相關(guān)系數(shù)（2）僅為0.778（圖2E）。

從3類不同樣品體系與DNS顯色反應(yīng)結(jié)果看，EGCG、沒食子酸、原花青素代表的3類酚類物質(zhì)都會(huì)與DNS發(fā)生顯色反應(yīng)且具有濃度依賴性，根據(jù)單色光吸光度具有線性加和特性，在線性濃度范圍內(nèi)可通過調(diào)整試驗(yàn)參比排除酚類影響。

2.2 酚類對(duì)GOPOD法測定還原糖含量的影響

如圖3A所示，GOPOD法的原理是葡萄糖經(jīng)過葡萄糖氧化酶作用生成葡萄糖酸和過氧化氫，進(jìn)一步過氧化氫在過氧化酶的作用下，將還原性的4-氨基安替比林與酚偶聯(lián)縮合成紅色的醌亞胺類化合物質(zhì)[22]。如圖3B所示，采用GOPOD法檢測EGCG、原花青素、沒食子酸和阿魏酸分別與葡萄糖共混體系中還原糖含量，發(fā)現(xiàn)吸光度都會(huì)顯著降低，這說明4種酚類物質(zhì)參與了GOPOD反應(yīng)過程。而EGCG和原花青素質(zhì)量濃度為10?mg·mL-1時(shí)，與葡萄糖相比，吸光度顯著增加（＜0.05），這是由于高濃度EGCG或原花青素與試劑盒反應(yīng)產(chǎn)生懸濁物。

從GOPOD法的反應(yīng)原理上可知，多酚可能通過3種途徑參與葡萄糖試劑盒反應(yīng)：（1）酚類物質(zhì)影響葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖的生成物（過氧化氫）[23]；（2）酚類物質(zhì)與試劑盒中的4-氨基安替比林反應(yīng)，從而抑制顯色物質(zhì)的生成[20]；（3）酚類物質(zhì)直接抑制葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶的活性[24]。因此，GOPOD法并不適用于茶食品中還原糖的直接測定。

2.3 酚類對(duì)FACE法測定還原糖含量的影響

FACE法的原理是還原糖與ANTS發(fā)生衍生化形成不穩(wěn)定亞胺，然后通過氰基硼氫化鈉選擇性還原亞胺形成穩(wěn)定胺，再通過聚丙烯酰胺凝膠將反應(yīng)樣品電泳分離出不同聚合度的還原糖ANTS衍生物[25]，如圖4A所示。從原理上推測，多酚無醛基，因此不能參與ANTS衍生反應(yīng)。

注：A為DNS反應(yīng)示意圖，B為酚類體系，C為酚類與DNS試劑反應(yīng)的實(shí)物圖，D為酚類-葡萄糖體系，E為酚類-水解物體系

注：A為酚類參與GOPOD反應(yīng)的示意圖，B為酚類-葡萄糖混合物與葡萄糖試劑盒反應(yīng)的實(shí)物圖，C為酚類-葡萄糖共混體系

注：A為FACE法的反應(yīng)示意圖；B為葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖與熒光強(qiáng)度的關(guān)系

如圖4B所示，葡萄糖、麥芽糖和麥芽三糖的濃度與熒光強(qiáng)度顯示出良好的線性關(guān)系，2分別為0.991、0.988、0.992，表明可以利用熒光強(qiáng)度計(jì)算糖濃度。FACE法能分離葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖、麥芽七糖、麥芽八糖，并且在4種酚類物質(zhì)對(duì)應(yīng)的泳道上無熒光條帶（圖5A），試驗(yàn)驗(yàn)證了EGCG、沒食子酸、原花青素、阿魏酸不參與ANTS衍生反應(yīng)。進(jìn)一步采用不同濃度的酚類物質(zhì)與淀粉酶解物（低聚還原糖）共混，研究共混樣品的FACE熒光顯色情況，發(fā)現(xiàn)酚類-淀粉酶解物的熒光條帶分布及強(qiáng)度與對(duì)照淀粉酶解物無顯著差異，說明酚類不影響低聚還原糖的測定（圖5B～5D）。因此，采用FACE法測定還原糖是科學(xué)可行的。

此外，與DNS法和GOPOD法相比，F(xiàn)ACE法還可同時(shí)獲得淀粉酶解物中低聚糖的分布情況，有助于闡釋酚類物質(zhì)對(duì)淀粉酶的酶解特性及酶解產(chǎn)物的影響。

3 結(jié)論

本文通過將EGCG、沒食子酸、原花青素和阿魏酸4種類型酚類物質(zhì)單獨(dú)、與葡萄糖共混、與淀粉酶解物共混3類樣品體系，研究了酚類物質(zhì)對(duì)還原糖測定常用的DNS法、GOPOD法和FACE法的影響。結(jié)果表明，對(duì)DNS法而言，阿魏酸無影響，而EGCG、沒食子酸和原花青素能夠與DNS發(fā)生顯色反應(yīng)且呈濃度線性相關(guān)性，增加了DNS法測定的吸光度，意味著酚類物質(zhì)的存在可能會(huì)使常規(guī)DNS法測定結(jié)果偏高，建議通過更換參比進(jìn)行方法改良；對(duì)GOPOD法來說，EGCG、沒食子酸、原花青素和阿魏酸能參與酶促反應(yīng)生成顯色物質(zhì)，導(dǎo)致測定結(jié)果偏離真值，因此該方法應(yīng)用時(shí)需考慮去除體系中的酚類物質(zhì)再測定還原糖；4種酚類物質(zhì)均對(duì)FACE方法無干擾，且FACE方法還能同時(shí)獲得低聚還原糖的分布信息，是定量測定含酚類物質(zhì)體系中還原糖含量的良好方法。

注：A為低聚還原糖標(biāo)品和4種酚類物質(zhì)，B、C、D分別為1、5、10?mg·mL-1的酚類物質(zhì)-淀粉酶解物；各圖泳道1為低聚糖標(biāo)準(zhǔn)品；泳道2為空白；泳道3—6分別為EGCG、沒食子酸、原花青素、阿魏酸

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Effect of Tea Polyphenols on the Determination of Reducing Sugar in Tea Food

SHENG Zheng1, DU Wenkai2, WANG Chongchong1, ZHANG Boan1, ZHANG Haihua1*, DU Qizhen1*

1. College of Food and Health, Zhejiang Agriculture and Forestry University, Hangzhou 311300, China;2. Zhejiang Quality Inspection Center of Grain and Oil Products, Hangzhou 310012, China

In order to find an accurate method to determine the content of reducing sugar in the digestive products of tea noodle products, phenolic acid, phenolic and glucose blending systems and phenolic and amylenzymeate blending systems alone were used to study the effects of four typical phenols including epigallocatechin gallate (EGCG), gallic acid, proanthocyanidin and ferulic acid on the quantitative determination of reducing sugars by 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) method, glucose oxidase/peroxidase (GOPOD) method and fluorescence-assisted sugar electrophoresis (FACE) method. The results show that ferulic acid had no effect on the DNS method, while EGCG, gallic acid and proanthocyanidin could react with DNS, indicating that they would affect the accuracy of the DNS method. All four phenolic substances significantly reduced the glucose results determined by GOPOD method, while the FACE method was not affected by phenols and could visually characterize the distribution of oligo reducing sugar in the amylase hydrolysate. Therefore, the FACE method has a good application value in determining the content of reducing sugars in tea noodle products and their enzymatic digestion products.

tea food, tea polyphenols, EGCG, reducing sugar content, fluorescence-assisted sugar electrophoresis

S571.1；Q946.3

A

1000-369X(2023)04-567-09

2023-03-02

2023-05-11

浙江農(nóng)林大學(xué)科研發(fā)展基金人才啟動(dòng)項(xiàng)目（203402000601）

盛政，男，碩士研究生，主要從事食品加工與營養(yǎng)強(qiáng)化方面的研究。*通信作者：18758884373@163.com；Qizhendu@163.com