俞佳妮 馮彩霞 劉向前 李小軍 張曉丹

摘 要： 為探究中藥白簕（Acanthopanx trifoliatus （L.） Merr.）能否作為高效、低毒的防治阿爾茨海默病的天然藥物原料，選用大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤株P(guān)C12作為神經(jīng)細(xì)胞模型，建立Aβ_25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化損傷模型，測(cè)定白簕葉總多酚干預(yù)24 h后PC12細(xì)胞存活率；通過(guò)AAPH誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞衰老模型和β-半乳糖苷酶活性染色法評(píng)估PC12細(xì)胞衰老情況。結(jié)果表明：與僅損傷處理組相比，5～60 mg/L的白簕葉總多酚能夠顯著提高（p＜0.05）經(jīng)Aβ_25-35誘導(dǎo)的氧化損傷的PC12細(xì)胞的存活率，且能夠降低AAPH誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老模型中的β-半乳糖苷酶活性，表明白簕葉總多酚對(duì)PC12細(xì)胞具有顯著的保護(hù)作用，能有效緩解PC12細(xì)胞氧化損傷與衰老。該研究為尋找有效防治阿爾茨海默病的天然藥物的鑒定與篩選提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：白簕葉；總多酚；抗衰老；PC12細(xì)胞；體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

中圖分類號(hào)：TS195.644

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1673-3851 （2023） 05-0353-06

引文格式：俞佳妮，馮彩霞，劉向前，等. 白簕葉總多酚對(duì)Aβ_25-35與AAPH誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化損傷和衰老的保護(hù)作用［J］. 浙江理工大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)），2023，49（3）：353-358.

Reference Format： YU Jiani， FENG Caixia， LIU Xiangqian， et al. Protective effects of total polyphenols from Acanthopanx trifoliatus （L.） Merr. on Aβ_25-35-induced oxidative damage and AAPH-induced aging models in PC12 cells［J］. Journal of Zhejiang Sci-Tech University，2023，49（3）：353-358.

Protective effects of total polyphenols from Acanthopanx trifoliatus （L.）

Merr. on Aβ_25-35-induced oxidative damage and AAPH-induced aging models in PC12 cells

YU Jiani¹， FENG Caixia¹， LIU Xiangqian²， LI Xiaojun³， ZHANG Xiaodan¹

（1a.College of Life Sciences and Medicine; 1b.Zhejiang Provincial Key Laboratory of Plant Secondary Metabolic

Regulation， Zhejiang Sci-Tech University， Hangzhou 310018， China; 2. School of Pharmacy， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China; 3.School of Pharmacy， Gannan Medical University， Ganzhou 341000， China）

Abstract： In order to explore the possibility of Acanthopanx trifoliatus （L.） Merr. as a highly effective and low toxic agent for the prevention and treatment of Alzheimer′s disease， PC12， a rat adrenal pheochromocytoma cell line， was selected as the nerve cell model， the oxidative damage model of PC12 cells induced by Aβ_25-35was established， and the survival rate of PC12 cells was measured after 24 hours of intervention of total polyphenols of A trifoliatuscanthopanx . AAPH-induced aging model of PC12 cells and SA-β-Gal staining was used to evaluate the senescence of PC12 cells. The results show that， compared with the injury treated group， the survival rate of PC12 cells is significantly improved by adding 5～60 mg/L total polyphenols of A trifoliatuscanthopanx? （L.） Merr. and the β-Galactosidase activity of PC12 cells is also reduced， indicating that total polyphenols of A trifoliatuscanthopanx? （L.） Merr. has a significant protective effect on PC12 cells and can effectively alleviate the oxidative damage and aging of PC12 cells. The results of this paper provide a theoretical basis for the identification and screening of natural medicines that can effectively prevent and treat Alzheimer′s disease.

Key words：Acanthopanx trifoliatus （L.） Merr.; total polyphenols; anti-aging; PC12 cells ; in vitro cell experiment

0 引 言

白簕（Acanthopanx trifoliatus （L.） Merr.）為五加科（Araliaceae）五加屬（Acanthopanax）攀援狀灌木，又被稱為禾掌簕、三葉五加、三加皮等，廣泛分布于中國(guó)的中部和南部，是一種民間常用的草藥；味苦、澀、微寒，具有祛風(fēng)除濕、舒筋活血、消腫解毒的功效，用于治療感冒、咳嗽、風(fēng)濕和坐骨神經(jīng)痛等癥^［1］。白簕葉中富含皂苷^［2］、三萜羧酸^［3］、黃酮^［4］、糖苷^［5］等多種化學(xué)成分。

白簕總多酚具有良好的抗氧化作用，張?jiān)?sup>［6^］通過(guò)DPPH，ABTS和ORAC測(cè)定了經(jīng)優(yōu)化后的提取工藝提取所得白簕總多酚的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)白簕總多酚具有與Trolox相近的較高的抗氧化活性。Hamid等^［7］通過(guò)建立小鼠炎癥模型發(fā)現(xiàn)了白簕葉具有良好的抗炎效果，為白簕葉資源的深入利用和高價(jià)值的產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供了理論依據(jù)?？Х弱？鼘幩犷惪偠喾邮前缀{葉的有效成分群之一，具有多種不同的生物活性，能夠有效地抑制血小板聚集，并在抗血栓、抗氧化和自由基損傷和防治阿爾茨海默病^［8］等方面發(fā)揮作用。盛艷梅等^［9］通過(guò)建立大鼠腦缺血再灌注的損傷模型，探討了3，5-二咖啡酰奎寧酸對(duì)于腦神經(jīng)的保護(hù)作用。咖啡?？鼘幩犷惢衔镌诖笫竽Ｐ椭?，能夠有效改善其神經(jīng)行為，進(jìn)而使得腦梗死的比率顯著下降^［10］。

阿爾茨海默病是由大腦病理性變化引起的神經(jīng)退行性疾病，表現(xiàn)為患者認(rèn)知功能與學(xué)習(xí)功能下降，記憶功能出現(xiàn)障礙，且癥狀隨患病時(shí)間加長(zhǎng)而逐漸惡化^［11］。目前阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)制尚未明確，市面上用于治療阿爾茨海默病的藥物大多通過(guò)抑制乙酰膽堿酶活性來(lái)減緩癥狀，少數(shù)藥物通過(guò)靶向清除Aβ減緩病癥的惡化^［12］。能夠低毒、高效地治療阿爾茨海默病的藥物仍待進(jìn)一步找尋。

白簕葉富含咖啡酰奎寧酸類多酚，可能對(duì)腦神經(jīng)具有較好的保護(hù)作用，有關(guān)白簕葉藥理活性及在抗氧化、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞方面的研究仍為空白。為了探究白簕葉總多酚是否具有保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用，以及成為治療阿爾茨海默病的藥物的可能性，本文通過(guò)建立Aβ_25-35誘導(dǎo)的大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤株P(guān)C12氧化損傷模型以及AAPH誘導(dǎo)的大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤株P(guān)C12衰老模型，加入乙醇提取、大孔樹(shù)脂純化后的白簕葉總多酚進(jìn)行干預(yù)，利用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率，分析觀察大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤株P(guān)C12的衰老情況，探究白簕葉總多酚是否對(duì)大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤株P(guān)C12的氧化損傷與衰老具有保護(hù)作用，為研究白簕葉總多酚是否具有保護(hù)神經(jīng)效果、尋找有效治療阿爾茨海默病的藥物提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白簕（Acanthopanx trifoliatus （L.） Merr.）采集于廣東省鳳凰山，大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤株P(guān)C12購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自GE醫(yī)療生命科學(xué)，胰蛋白酶和青鏈霉素混合液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，二甲基亞砜購(gòu)自吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)公司，噻唑藍(lán)購(gòu)自上海寶曼生物科技有限公司，β-半乳糖苷酶染色試劑盒購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，Aβ_25-35和AAPH購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，DMSO、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鈉和氯化鉀購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，乙醇和濃鹽酸購(gòu)自杭州高晶精細(xì)化工有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

MCO-18AIC型二氧化碳培養(yǎng)箱（日本三洋公司）、Synergy H4型酶標(biāo)儀（美國(guó)伯騰儀器有限公司）、GL124-1SCN型電子分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）和MF53型熒光倒置顯微鏡（明美光電技術(shù)有限公司）。

1.3 試劑的配制

1.3.1 RPMI-1640完全培養(yǎng)基的配制

在超凈工作臺(tái)中，向RPMI-1640培養(yǎng)液中加入10%的胎牛血清，充分混勻后加入1%的青鏈霉素混合液，搖勻即為完全培養(yǎng)基，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 PBS緩沖液的配制

分別稱取0.24 g磷酸二氫鉀、1.44 g磷酸氫二鈉、8.00 g氯化鈉和0.20 g氯化鉀至燒杯中，加入800 mL蒸餾水，玻璃棒充分?jǐn)嚢枋怪芙?，用濃鹽酸調(diào)至pH值為7.2，最后在容量瓶中加水定容至1000 mL。將配制好的PBS滅菌（121 ℃，20 min）后，置于4 ℃冰箱保存。

1.3.3 Aβ_25-35母液配制

取1 mg Aβ_25-35于471.5 μL ddH₂O溶解，配制成2 mmol/L的母液，小管分裝，避免反復(fù)凍融，在-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。使用前將分裝的Aβ_25-35母液于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中孵育約7 d，增加Aβ_25-35的神經(jīng)毒性。

1.3.4 MTT溶液的配制

稱取MTT粉末500 mg于燒杯，加入100 mL配置完成的PBS緩沖液，完全溶解后，在超凈工作臺(tái)中用0.22 μm濾膜過(guò)濾，即為質(zhì)量濃度5 mg/mL的MTT。MTT需現(xiàn)配現(xiàn)用，過(guò)濾除菌后將其放在4 ℃冰箱避光保存。

1.4 樣品的制備

白簕葉總多酚的提取方法：將烘干至恒重后的白簕葉粉碎，取1 kg粉末，加入70%的乙醇，超聲提取4次，每次2 h，將提取液合并濃縮，干燥后加水溶解，用石油醚萃取4次去脂，取水相濃縮干燥，得到總多酚粗提物粉末^［13］。白簕葉總多酚的純化方法：稱取100 g D101大孔樹(shù)脂，加入500 mL 95%的乙醇，將其充分浸泡24 h，倒入層析柱后去除雜質(zhì)，然后進(jìn)行酸洗和堿洗，用蒸餾水浸泡備用；稱取2.8 g總多酚粗提物，配置成200 mL樣品，將大孔樹(shù)脂于水中濕法上柱，加入樣品進(jìn)行吸附，控制流速收集流出液，收集并濃縮洗脫液總多酚流段，冷凍干燥后獲得白簕葉總多酚^［14］。

1.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率

白簕葉總多酚處理24 h后，向每個(gè)孔加入20 μL的MTT溶液，置于含5%CO₂的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。取出96孔板，沿著培養(yǎng)液上部用移液槍小心吸取上清液，充分棄去MTT。每孔加150 μL的DMSO溶解結(jié)晶，輕輕振搖15 min。使用酶標(biāo)儀，在490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的吸光度，即OD值，計(jì)算不同質(zhì)量濃度下藥物對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率，抑制率用細(xì)胞存活率表示，計(jì)算公式為：

1.6 白簕葉總多酚對(duì)PC12細(xì)胞的細(xì)胞毒性

當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，棄培養(yǎng)液，用配制好的PBS洗兩次，加入1 mL的胰酶使貼壁細(xì)胞分散，消化完全后，加入培養(yǎng)液使貼壁細(xì)胞懸浮起來(lái)，800 r/min 離心3 min以充分去除胰酶。離心后保留細(xì)胞沉淀，加入1 mL完全培養(yǎng)基，用吸管輕輕吹打，吹散細(xì)胞使細(xì)胞飄浮起來(lái)，制成懸液。用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，最終向96孔板每孔中加入100 μL的細(xì)胞懸液（約5000個(gè)細(xì)胞），將不含細(xì)胞的100 μL完全培養(yǎng)基作為空白孔，在含5% CO₂的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，使之貼壁。將白簕葉總多酚用無(wú)血清培養(yǎng)基配制成240.000、120.000、60.000、30.000、15.000、7.500、3.750 mg/L和1.875 mg/L共8個(gè)質(zhì)量濃度梯度的白簕葉總多酚藥物組，每組分別設(shè)4個(gè)復(fù)孔。加藥后將96孔板置于5% CO₂，37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率。

1.7 白簕葉總多酚對(duì)Aβ_25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

1.7.1 Aβ_25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化損傷濃度的確定

將懸浮的PC12細(xì)胞用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，最終向96孔板每孔中加入100 μL細(xì)胞懸液（約5000個(gè)細(xì)胞），空白對(duì)照加100 μL完全培養(yǎng)基，放在含有5% CO₂的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，使之貼壁。將孵育7 d后的Aβ_25-35用培養(yǎng)基稀釋，分別稀釋為10、8、7、6、5、4、2 μmol/L和1 μmol/L ，向Aβ_25-35損傷組中加入10 μL上述不同濃度的Aβ_25-35，不加Aβ_25-35為陰性對(duì)照組，加入10 μL無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)液。每組分別設(shè)置4～6個(gè)孔，重復(fù)3次。在含5%CO₂的37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h后用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率，用GraphPad Prism 7軟件計(jì)算Aβ_25-35對(duì)PC12細(xì)胞的IC₅₀值確定誘導(dǎo)濃度，具體方法參考文獻(xiàn)［15］。

1.7.2 白簕葉總多酚對(duì)Aβ_25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化損傷模型的作用

將消化后的PC12細(xì)胞制成細(xì)胞懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)，向每孔加入90 μL 細(xì)胞懸液（約5000個(gè)細(xì)胞），設(shè)置空白組加90 μL完全培養(yǎng)基，放在含5% CO₂的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，使之貼壁。在小于白簕葉總多酚的最大安全質(zhì)量濃度基礎(chǔ)上設(shè)置加入白簕葉總多酚質(zhì)量濃度為5、10、20、30、40、50 mg/L和60 mg/L的白簕葉總多酚實(shí)驗(yàn)組，Aβ_25-35模型組與陰性對(duì)照組加入10 μL無(wú)血清培養(yǎng)基，預(yù)處理30 min，實(shí)驗(yàn)組與Aβ_25-35模型組加入濃度為4.141 μmol/L的Aβ_25-35溶液10 μL，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組加入10 μL無(wú)血清培養(yǎng)基。每組分別設(shè)4個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，在5% CO₂、37 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率，具體方法參考文獻(xiàn)［16］。

1.8 白簕葉總多酚對(duì)AAPH誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞衰老的抵抗作用

1.8.1 AAPH誘導(dǎo)的衰老模型的建立以及給藥

當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，吸去培養(yǎng)液，用PBS洗兩次。加入1 mL胰酶使貼壁細(xì)胞分散，消化完全后，加入培養(yǎng)液使貼壁細(xì)胞懸浮起來(lái)，800 r/min 離心3 min以充分去除胰酶。離心后保留細(xì)胞沉淀，加入1 mL培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打，使細(xì)胞飄浮起來(lái)，制成懸液。然后用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，最終向每孔加入2 mL 細(xì)胞懸液（約200000個(gè)細(xì)胞）到6孔板中，培養(yǎng)過(guò)夜使之貼壁。對(duì)照組繼續(xù)培養(yǎng)，PC12細(xì)胞加藥組和AAPH組均加入終濃度為1 mmol/L的AAPH，加藥組分別另外加入15、30mg/L和60 mg/L的白簕葉總多酚，培養(yǎng)48 h后進(jìn)行染色并檢測(cè)，具體方法參考文獻(xiàn)［17］。

1.8.2 β-半乳糖苷酶染色

按照試劑盒要求配制染色液，根據(jù)白簕葉總多酚對(duì)PC12細(xì)胞的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在不顯著降低PC12細(xì)胞的條件下選取低，中，高共三個(gè)濃度梯度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)組用15、30 mg/L和60 mg/L的白簕葉總多酚處理后，在超凈工作臺(tái)中棄去舊細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入2 mL的PBS洗滌1次，向每孔加入1 mL預(yù)先配制好的固定液，將PC12細(xì)胞在室溫條件下固定10～15 min；固定后吸去固定液，每孔加入2 mL的PBS 洗滌2次以充分去除殘留的固定液，每孔加入1 mL染色液進(jìn)行染色；將6孔板放入干燥的無(wú)CO₂的37 ℃培養(yǎng)箱過(guò)夜，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 白簕葉總多酚的細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果

以白簕葉總多酚加藥質(zhì)量濃度-細(xì)胞存活率為橫縱坐標(biāo)作圖，結(jié)果如圖1所示。圖1表明：當(dāng)白簕葉總多酚濃度為60 mg/L以下時(shí)，PC12細(xì)胞的存活率均大于95%，與空白對(duì)照組差異不顯著（p>0.05），而在質(zhì)量濃度高于60 mg/L時(shí)，細(xì)胞存活率明顯下降，因此，本文選取干預(yù)PC12細(xì)胞的白簕葉總多酚最大安全質(zhì)量濃度為60 mg/L。

2.2 Aβ_25-35對(duì)PC12細(xì)胞損傷濃度的確定

本文通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)定不同濃度Aβ_25-35處理24 h后的PC12細(xì)胞存活率，結(jié)果如圖2所示。圖2表明：在Aβ_25-35濃度為1～10 μmol /L范圍內(nèi)，細(xì)胞損傷率與Aβ_25-35呈濃度依賴性且為正相關(guān)。Aβ_25-35對(duì)PC12細(xì)胞的IC₅₀值為4.141 μmol/L，確定其為使用Aβ_25-35建立細(xì)胞氧化損傷模型的濃度。

2.3 白簕葉總多酚對(duì)Aβ_25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化損傷模型的保護(hù)作用

為了探究白簕葉總多酚對(duì)Aβ_25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化損傷模型的作用，以4.141 μmol/L的Aβ_25-35誘導(dǎo)PC12的氧化損傷模型。根據(jù)白簕葉總多酚對(duì)PC12細(xì)胞毒性的檢測(cè)結(jié)果，白簕葉總多酚質(zhì)量濃度小于60 mg/L時(shí)，對(duì)PC12細(xì)胞的增殖無(wú)顯著影響，因此加入質(zhì)量濃度為5、10、20、30、40、50 mg/L和60 mg/L的不同濃度白簕葉總多酚處理，MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率結(jié)果如圖3所示。圖3表明：加入質(zhì)量濃度范圍為5～60 mg/L白簕葉總多酚后，PC12細(xì)胞存活率顯著高于未加入白簕葉總多酚的Aβ_25-35模型組，通過(guò)白簕葉總多酚對(duì)該損傷模型的處理，顯著提高了細(xì)胞的存活率（p<0.05）；白簕葉總多酚對(duì)Aβ_25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化損傷具有顯著的保護(hù)作用，氧化損傷模型的細(xì)胞存活率低于50%，且白簕葉總多酚藥物組的質(zhì)量濃度越高，細(xì)胞存活率呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，其原因可能是Aβ_25-35是一種β淀粉樣蛋白，活性受溫度及孵育時(shí)間的影響，較不穩(wěn)定，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較低。

2.4 β-半乳糖苷酶染色結(jié)果

為了驗(yàn)證白簕葉總多酚對(duì)Aβ_25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化損傷模型的作用結(jié)果的可靠性，選取AAPH對(duì)PC12細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，將不同質(zhì)量濃度白簕葉總多酚處理后的損傷PC12細(xì)胞進(jìn)行染色，結(jié)果如圖4所示。圖4表明：AAPH模型組的大部分細(xì)胞被染為藍(lán)色，β-半乳糖苷酶活性較高，細(xì)胞處于衰老狀態(tài)，未經(jīng)AAPH誘導(dǎo)的對(duì)照組幾乎未見(jiàn)染色陽(yáng)性細(xì)胞，而各質(zhì)量濃度白簕葉總多酚作用后的細(xì)胞染色陽(yáng)性率均明顯小于模型組，且在15～60 mg/L濃度范圍內(nèi)，β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性率細(xì)胞數(shù)目隨著白簕葉總多酚質(zhì)量濃度增加而減少，白簕葉總多酚對(duì)PC12細(xì)胞的衰老具有保護(hù)作用，且在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)隨著質(zhì)量濃度的增加而提高。

3 討 論

Aβ-淀粉樣蛋白與阿爾茨海默病的防治息息相關(guān)，Aβ_25-35為一種Aβ淀粉樣蛋白，其聚集在阿爾茨海默病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Aβ蛋白通過(guò)減少細(xì)胞內(nèi)的抗凋亡因素加速細(xì)胞凋亡，使神經(jīng)元發(fā)生壞死^［18］。王凱等^［19］通過(guò)將不同濃度的β淀粉樣蛋白Aβ_25-35進(jìn)行側(cè)腦注射，發(fā)現(xiàn)Aβ_25-35會(huì)減退大鼠的記憶能力，損傷大鼠的突出超微結(jié)構(gòu)，使大鼠的海馬神經(jīng)元壞死。付劭靜等^［20］發(fā)現(xiàn)當(dāng)阿爾茨海默病患者神經(jīng)功能障礙與認(rèn)知功能障礙程度加重時(shí)，患者血清中的Aβ_1-42顯著增加，因此通過(guò)清除Aβ-淀粉樣蛋白防治阿爾茨海默病是阿爾茨海默病藥物的重要研究方向之一。利用Aβ_25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化損傷模型尋找防治阿爾茨海默癥藥物的實(shí)驗(yàn)方法的應(yīng)用較為廣泛，王媛等^［21］通過(guò)建立該模型探究了雌激素受體介導(dǎo)的柚皮苷抗Aβ_25-35損傷PC12 細(xì)胞凋亡作用。AAPH作為一種自由基誘導(dǎo)劑，是一種含氮的水溶性小分子，在生理溫度（37 ℃，pH值7.0）下，能夠分解產(chǎn)生自由基。氧氣能夠快速地和其中含碳的自由基發(fā)生反應(yīng)，生成過(guò)氧自由基，且以穩(wěn)定的速率釋放^［22］，被廣泛運(yùn)用于構(gòu)建氧化應(yīng)激模型。本文通過(guò)建立Aβ_25-35誘導(dǎo)的PC12神經(jīng)細(xì)胞損傷模型與AAPH誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化損傷模型探究白簕葉總多酚是否能夠通過(guò)清除Aβ_25-35與AAPH達(dá)到對(duì)大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤株P(guān)C12細(xì)胞的保護(hù)效果，結(jié)果表明白簕葉總多酚能夠有效保護(hù)PC12細(xì)胞不受氧化損傷，白簕葉總多酚在防治阿爾茨海默病上具有巨大潛力。

4 結(jié) 論

本文通過(guò)建立Aβ_25-35誘導(dǎo)的PC12神經(jīng)細(xì)胞損傷模型與APPH誘導(dǎo)的PC12神經(jīng)細(xì)胞衰老模型，加入不同質(zhì)量濃度的白簕葉總多酚后測(cè)定細(xì)胞存活率與β-半乳糖苷酶活性，探究白簕葉總多酚對(duì)氧化損傷的PC12細(xì)胞的保護(hù)作用，主要結(jié)論如下：

a）過(guò)高質(zhì)量濃度的白簕葉總多酚對(duì)PC12具有毒性。當(dāng)白簕葉總多酚質(zhì)量濃度為60 mg/L以下時(shí)，PC12細(xì)胞的存活率均大于95%，而在質(zhì)量濃度高于60 mg/L時(shí)，細(xì)胞存活率明顯下降低于95%，因此干預(yù)PC12細(xì)胞的白簕葉總多酚最大安全質(zhì)量濃度為60 mg/L。

b）Aβ_25-35能夠誘導(dǎo)PC12細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷，且氧化損傷程度隨著Aβ_25-35濃度的增加而增加。質(zhì)量濃度為5～60 mg/L的白簕葉總多酚均可顯著提高Aβ_25-35誘導(dǎo)的氧化損傷PC12細(xì)胞的存活率，對(duì)其產(chǎn)生顯著的保護(hù)作用。

c）AAPH能夠誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的衰老。在15～60 mg/L的濃度范圍內(nèi)，白簕葉總多酚對(duì)AAPH誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的衰老的保護(hù)作用隨著白簕葉總多酚濃度的增加而提高。

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（責(zé)任編輯：張會(huì)巍）