郝祖杭 袁于民

摘 要： 為研究聚乙二醇單甲醚（mPEG）鏈長及分散性對其膠束的理化性質及不同介質下穩(wěn)定性的影響，采用具有聚集發(fā)光特性的四苯乙烯（Tetraphenylethylene，TPE）為憎水段，合成了3種不同鏈長的單分散mPEGn-TPE酯（n=15，23，35），以及1種多分散mPEG1000-TPE酯的雙親分子。探討了mPEG鏈長及分散性的差異對mPEG-TPE膠束的臨界膠束濃度（Critical micelle concentration，CMC）、粒徑、熒光強度、水解速度及在牛血清白蛋白（BSA）溶液中穩(wěn)定性的影響。結果表明：所合成4種mPEG-TPE化合物均在水溶液中形成自組裝膠束并展現(xiàn)出AIE特征，膠束的尺寸、CMC值及在磷酸鹽緩沖液（PBS）中的水解速度，隨著PEG鏈長的增長而增加，但熒光強度減弱，這說明膠束內核TPE之間的相互作用減弱；在BSA介質下，保持膠束穩(wěn)定的時間隨PEG鏈增長而增加，與mPEG1000-TPE膠束對比，分子量相當?shù)膯畏稚PEG₂₃-TPE膠束在BSA溶液中能保持更長時間的穩(wěn)定，展示了單分散的優(yōu)勢。因此，納米載體系統(tǒng)在臨床應用時很有必要采用單分散的PEG，以獲得更好的藥物遞送效果。

關鍵詞：單分散聚乙二醇；四苯乙烯；聚集誘導發(fā)光；膠束；粒徑；抗蛋白吸附

中圖分類號：TQ432.2

文獻標志碼：A

文章編號：1673-3851 （2023） 05-0365-09

引文格式：郝祖杭，袁于民. mPEG鏈長及分散性對mPEG-TPE膠束行為影響［J］. 浙江理工大學學報（自然科學），2023，49（3）：365-373.

Reference Format： HAO? Zuhang，YUAN? Yumin. Effects of the chain length and dispersity of mPEG on mPEG-TPE micelle behavior［J］. Journal of Zhejiang Sci-Tech University，2023，49（3）：365-373.

Effects of the chain length and dispersity of mPEG on mPEG-TPE micelle behavior

HAO Zuhang^1a，1b， YUAN Yumin^{1a，1b，2}

（1a.School of Materials Science & Engineering; 1b.Institute of Smart Biomedical Materials， Zhejiang Sci-Tech University， Hangzhou 310018， China; 2. Biomatrik Inc.， Jiaxing 314001， China）

Abstract： To provide a greater insight to the effects of the chain length and dispersity of methoxy polyethylene glycol （mPEG） on its physicochemical properties and stability in different media， we used tetraphenylethylene （TPE） with aggregated luminescence characteristics as the hydrophobic segment， synthesizing three monodisperse mPEGn-TPE esters with different chain lengths （n=15， 23， 35） and one polydisperse counterpart mPEG1000-TPE. We discussed the effects of the differences of mPEG chain length and dispersity on the critical micelle concentration （CMC）， particle size， fluorescence intensity， hydrolysis rate and stability in bovine serum albumin （BSA） solution of mPEG-TPE micelles. Results indicate that the four mPEG-TPE compounds synthesized all formed self-assembled micelles in aqueous solution and showed AIE characteristics. The size of micelles， CMC value and hydrolysis rate in phosphate buffer solution （PBS） increased with the increase of PEG chain length， while the fluorescence intensity decreased， which indicated that the interaction between TPE in micelle core weakened. In BSA medium， the time to keep the micelle stable increases with the increase of PEG chain. Monodisperse mPEG₂₃-TPE has a much better stability than its polydisperse mPEG1000-TPE counterpart in BSA solution， suggesting that monodispersity of PEG could be a preferred choice when a nano-formulation is to be developed for a drug delivery application.

Key words：monodisperse PEG; tetraphenyl ethylene; AIE; micelles; partical size; resistance protein adsorption

0 引 言

自組裝納米結構，如膠束^［1-2］、囊泡^［3-4］、脂質體^［5］以及納米粒子^［6］等在藥物遞送、基因遞送、成像、疫苗等生物醫(yī)藥領域有著廣泛應用^［7-9］。聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）是兩親性化合物中最常用的水溶性嵌段，與憎水段通過自組裝形成的膠束被認為是一類非常有前途的藥物載體。PEG納米載體克服了疏水藥物水溶性差的問題，還能在膠束的外層形成生物惰性的mPEG冠，減少膠束與蛋白質的相互作用^［10］。膠束與蛋白質的相互作用可直接決定膠束在體內的循環(huán)半衰期，如蛋白質吸附可導致膠束在循環(huán)過程中或肝臟、脾臟等組織中被網狀內皮系統(tǒng)（Reticuloendothelial system，RES）的巨噬細胞滲透和吞噬，進而影響藥物載體的性能^［11-12］；吸附了蛋白質的膠束更容易解體，無法承擔藥物遞送的任務。因此，減少膠束表面蛋白質的吸附，有助于延長膠束的血液循環(huán)半衰期。

PEG的分子量與蛋白質吸附有直接的關系，在達到一定分子量的門檻前，分子量越小，載體吸附蛋白的量越大^［13］。目前多數(shù)PEG為多分散性的，由分子量大小不一的PEG鏈段組成；分子量小的部分決定了蛋白質吸附程度，是多分散性PEG的一個關鍵缺陷^［14］。

聚集誘導發(fā)光（Aggregation-induced emission，AIE）化合物是一類具備特殊的分子內旋轉受限機理的有機染料，能夠在聚集狀態(tài)下（水中或固態(tài)）發(fā)射熒光，并且其熒光強度隨聚集狀態(tài)的增強而提高，因此含AIE分子的膠束可通過熒光強度來檢測膠束的聚集狀態(tài)^［15］。在所有的AIE分子中，四苯乙烯（Tetraphenylethylene，TPE）是最經典也是使用最廣泛的聚集誘導發(fā)光化合物。Wu等^［16］將TPE與傳統(tǒng)有機染料共價連接在同一線性PEG的一側，通過檢測不同波長的熒光強度比值，實現(xiàn)了對膠束聚集狀態(tài)的實時檢測；聚集誘導發(fā)光化合物作為疏水段被引入至mPEG鏈的一端，以通過AIE效應產生的熒光強度評價mPEG-TPE膠束中mPEG長度及分散度對膠束聚集狀態(tài)的影響。

本文使用不同鏈長及分散性的mPEG合成了3種不同鏈長的單分散mPEGn-TPE（P15、P23、P35），以及1種多分散mPEG1000-TPE（P1k）。測定了4種mPEG-TPE膠束在CMC、粒徑、熒光強度、水解速度及在牛血清白蛋白（BSA）溶液中穩(wěn)定性差異，分析了mPEG鏈長及分散性對mPEG-TPE膠束的理化性質影響。本文為單分散mPEG膠束的在生物醫(yī)藥領域的應用提供了參考。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

1.1.1 實驗材料

單分散聚乙二醇甲醚乙酸（mPEGn-CH₂COOH，n=15，23，35）及多分散聚乙二醇甲醚乙酸（mPEG1000-CH₂COOH）由浙江博美生物技術有限公司提供；1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亞胺鹽酸鹽（EDCI）購自蘇州昊帆生物股份有限公司；4-二甲氨基吡啶（DMAP）購自上海共價化學科技有限公司；二苯甲酮、四氯化鈦（TiCl₄）、4-羥基二苯甲酮、鋅粉（Zn）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；石油醚（PE）、乙酸乙酯（EA）、二氯甲烷（DCM）購自杭州雙林化工試劑有限公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）購自北京沃凱生物科技有限公司；牛血清白蛋白（BSA）購自北京索萊寶科技有限公司。所有藥品使用前未經純化。

1.1.2 實驗儀器

液相色譜儀（HPLC，UltiMate3000，賽默飛世爾科技公司）；核磁共振氫譜儀（¹H NMR，600 MHz，布魯克公司）；基質輔助激光解析飛行時間質譜儀（MALDI-TOF，rapifleX，布魯克公司）；表面張力儀（OT-60，寧波新邊界科學儀器有限公司）；納米粒度及Zeta電位分析儀（Be Nano 180 Zeta Pro，丹東百特儀器有限公司）；穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀（FLS1000，英國愛丁堡公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 mPEG-TPE的合成

羥基-四苯乙烯（TPE-OH）按照文獻^［17］的方法合成，具體過程如下：稱取二苯甲酮（36.4 g，0.2 mol）、4-羥基二苯甲酮（40.4 g，0.2 mol）與鋅粉（32.5 g，0.5 mol），加至2 L反應瓶中，再將1 L THF加入反應瓶中，置于冰水浴下保持攪拌，在氬氣保護下，將四氯化鈦（45.5 g，0.24 mol）緩慢滴加至反應液中，滴加完畢后，升溫至70 ℃，回流反應12 h，得到黑色懸濁液。通過薄層色譜（TLC）監(jiān)測反應，反應結束后，反應液濃縮并通過柱層析純化（PE→PE∶EA=20∶1）后得到淡黃色固體。柱層析純化采用的洗脫液為PE與EA組成的混合溶液，其中PE與 EA 的體積比為20∶1。將淡黃色固體加入到混合溶劑（EA∶PE=EA和PE的體積比為2∶3）中打漿后得到8.5 g白色粉末狀TPE-OH，產率為49%，質譜的實測分子量（348.1 Da）與其計算值相符，合成方法如圖1（a）所示。

mPEGn-TPE的合成方法如圖1（b）所示，以mPEG₁₅-TPE （P15）的合成為例：mPEG₁₅-CH₂COOH（1 g，1.33 mmol）與TPE-OH（463 mg，1.33 mmol）加入100 mL含攪拌子的圓底燒瓶中，然后加入20 mL DCM，攪拌，再依次加入DMAP（32 mg，0.266 mmol）與EDCI（281 mg，1.46 mmol），置于室溫下反應8 h。反應液減壓濃縮后加入混合溶劑（EA∶PE=EA和PE的體積比為1∶1）中并置于-20 ℃重結晶，得到白色粉末狀mPEG₁₅-TPE（P15，1.2 g，產率83%），常溫下為淡黃色油狀液體。通過同樣的方法合成了mPEG₂₃-TPE（P23，0.83 g，產率81%）、mPEG₃₅-TPE（P35，0.83 g，產率86%）及mPEG1000-TPE（多分散，P1k，2.3 g，產率87%）。

1.2.2 高效液相色譜（HPLC）分析

分別稱取mPEG-TPE 10 mg，加入1 mL 色譜純乙腈中，配制為10 mg/mL溶液，經過0.45 μm濾膜過濾后，進行HPLC分析。采用Inertsil ODS-3 5 μm色譜柱，流動相流速為1 mL/min，色譜柱柱溫度40 ℃。

1.2.3 分子量表征

采用rapifleX型MALDI-TOF對P15、P23、P35、P1k的質譜進行表征，乙腈作為流動相，基質選擇反式-2-［3-（4-叔丁基苯基）-2-甲基-2-亞丙烯基］（DCTB），質譜掃描范圍為m/z=500～2500。

1.2.4 核磁氫譜（¹H NMR）表征

以四甲基硅烷（TMS）為內標的氘代二甲基亞砜（d6-DMSO）為溶劑，對樣品進行¹H NMR譜分析。

1.2.5 臨界膠束濃度測試

采用表面張力法測定膠束的CMC值。用超純水配制濃度為1 mmol/L的P15、P23、P35、P1k等4種標準液，分別稀釋至500、250、100、50、25、10 μmol/L和5 μmol/L。使用表面張力儀測量4種化合物在一系列濃度梯度下的表面張力值，繪制表面張力與濃度的關系曲線圖，兩線交點即為化合物的CMC值。

1.2.6 粒徑分布測試

分別配制濃度為1 mmol/L 的P15、P23、P35、P1k溶液，超聲震蕩30 min后，通過親水性0.45 μm濾膜過濾去除氣泡，測量4種膠束溶液的粒徑及其分布。

1.2.7 熒光強度測試

分別配制濃度為1 mmol/L 的P15、P23、P35、P1k溶液，測試其熒光強度。熒光激發(fā)波長設置為370 nm；熒光發(fā)射波長掃描范圍為380～700 nm。

1.2.8 水解穩(wěn)定性測試

稱取P15、P23、P35、P1k各20 mg分別溶解于PBS中攪拌，在特定的時間點（0 、24、48、72、96、120、144 h和168 h）下取100 μL溶液，加至900 μL乙腈中，經0.45 μm濾膜過濾，進行HPLC分析，計算出剩余化合物百分比，繪制穩(wěn)定性曲線圖。HPLC分析方法為：體積分數(shù)為0.1%的TFA乙腈溶液作流動相B、體積分數(shù)為0.1%的TFA水溶液作流動相A。0～13 min，流動相B由50%線性下降至40%；13～19 min由40%線性下降至10%，19.01 min，流動相B回至50%，并保持直至23 min結束。

1.2.9 抗蛋白吸附測試

P15、P23、P35、P1k加入PBS中，分別配制成濃度為1 mmol/L的膠束溶液，超聲震蕩30 min后與等量的1 mg/mL BSA溶液混合。用親水性0.45 μm濾膜過濾去除混合溶液中的氣泡，分別在0、1、2、3 、4、5 h和6 h測量4種膠束與蛋白質混合液的粒度分布。

2 結果與討論

2.1 純度及結構表征

2.1.1 高效液相色譜分析

對合成的4種mPEG-TPE產物用HPLC進行純度分析，結果顯示其純度均在98%以上，因此可對其進行進一步表征與膠束行為研究。圖2為4種mPEG-TPE的HPLC譜圖合并圖。由圖2可知，單分散的P15、P23及P35的主峰均為尖銳且很窄的單峰；而多分散的P1k的主峰為寬而鈍，其保留時間幾乎覆蓋了從P15至P35的保留時間，揭示了多分散P1k中混有分子量不等的mPEG-TPE組份。在單分散mPEGn-TPE的HPLC譜圖中，鏈長或重復單元數(shù)n影響其在色譜上的保留時間。

通過對P15、P23及P35的保留時間與PEG鏈長作圖并進行線性擬合分析，發(fā)現(xiàn) n越大，保留時間越短，二者存在線性關系為0.995，說明由散點擬合曲線與散點的相關性很好（見圖3），通過測定未知n的mPEGn-TPE的保留時間，根據圖3線性關系，可推算n值。

2.1.2 質譜分析

P15、P23、P35、P1k的實測分子量通過MALDI-TOF質譜獲得，結果如圖4所示。由圖4（a）可知，P15出現(xiàn)了3個分子離子峰，分別對應［M+H］+、［M+Na］+與［M+K］+；P23、P35中出現(xiàn)兩個離子峰，對應［M+Na］+與［M+K］+；P15中強度最高的質荷比為1119.52，對應［M+K］+，與理論分子量1119.48相符合。P23、P35中最強質荷比分別為1455.75、1984.08，正好與各自的［M+Na］+對應，證明P15、P23、P35的成功合成。圖4（b）表明：P1k由于多分散的原因，其質量呈現(xiàn)以1324.67為中心的多分散態(tài)，與P1k中聚合度為20的片段［P20+Na］+的計算分子量1324.58一致。由于其在質譜上主要呈現(xiàn)［M+Na］+與［M+K］+兩種狀態(tài)，相鄰兩峰間的質荷比差值分別為28與16，對應［M-1+K］+與［M+Na］+的分子量差與［M+Na］+與［M+K］+的分子量差，因此同種離子狀態(tài)與其前體離子之間質荷比差為44，也即分子量之差為44 Da，為一個PEG單元（CH₂CH₂O）的分子量，證實P1k的成功合成。

2.1.3 核磁氫譜分析

TPE-OH的核磁共振氫譜圖如圖5（a）所示，其中化學位移為9.35/10⁶的信號峰對應于羥基分子上的H^a原子?；瘜W位移為（6.64～6.54）/10⁶、（6.70～6.77）/10⁶、（6.88～7.07）/10⁶和（7.02～7.19）/10⁶上的4個信號峰分別對應苯環(huán)上的氫原子H^b、H^c、H^d和H^e，當以羥基上的氫原子特征峰計為峰面積是1的基準峰時，每種特征峰的峰面積與其分子中的氫原子個數(shù)對應。mPEG-TPE的化學結構同樣經¹H NMR譜圖分析圖5（b）所示。

圖5（b）顯示：P15、P23、P35和P1k的核磁共振氫譜圖中（3.41～3.67）/10⁶的信號峰對應聚乙二醇上的氫原子H^b，而化學位移為（6.93～7.17）/10⁶的信號峰對應四苯乙烯上的氫原子H^d；當以聚乙二醇中一端甲氧基上的氫原子H^a特征峰記為面積是3的基準峰時，P15、P23、P35和P1k中四苯基乙烯特征峰的峰面積均為19，與四苯乙烯上的氫原子數(shù)對應，而聚乙二醇的特征峰面積則與其各自聚乙二醇鏈上的氫原子個數(shù)對應，證明4種單甲醚聚乙二醇乙酸成功修飾四苯乙烯。

2.2 臨界膠束濃度

臨界膠束濃度是表征膠束熱力學穩(wěn)定性的重要參數(shù)，形成膠束的能力越強，則CMC越小，膠束的熱力學穩(wěn)定性越高^［18］。為分析PEG鏈長及分散性對膠束CMC的影響，本文通過懸滴法測定了這4種mPEG-TPE在不同濃度下的表面張力值，根據表面張力值拐點獲得4種mPEG-TPE的CMC值，結果如圖6所示。圖6表明：在單分散mPEG-TPE中，P15、P23及P35的CMC分別為11.6、12.2 μmol/L和15.4 μmol/L。隨著聚乙二醇鏈長增加，mPEGn-TPE更傾向于溶解在水中，因此在水溶液中需要更高的濃度達到CMC^［19］；而多分散P1k的CMC值為12.0 μmol/L，與分子量相同的單分散P23并無太大差別，證明分散性對于mPEG-TPE的臨界膠束濃度的影響較小，或者是表面張力法對揭示膠束的聚集狀況不夠靈敏。

2.3 粒 徑

圖7為不同鏈長的mPEG-TPE膠束在水溶液中的粒徑及粒徑分布的測試結果。由圖7可知，P15、P23、P35膠束的粒徑分別為8.4、9.1 nm和10.2 nm，膠束粒徑隨PEG鏈長的增加而增大，與預期的結果相符；在疏水段均為TPE時，親水段PEG鏈長的增加，使得整個分子的親水憎水平衡值（HLB）值向親水方向移動，更傾向于膠束解聚，導致粒徑變大，但影響并不顯著；多分散P1k膠束粒徑為9.1 nm，與同等鏈長的單分散P23膠束粒徑與粒徑分布（PDI）一致，表明mPEG的分散性對鏈長相當?shù)膍PEG-TPE膠束粒徑及粒徑分布影響甚微。這4種樣品的粒徑分布系數(shù)均小于0.1，分布較為均勻。

2.4 熒光強度

利用TPE聚集發(fā)光和mPEG-TPE在水溶液中自組裝形成膠束的特性，在相同的AIE組份的摩爾濃度下，通過測定mPEG的鏈長與分散度對TPE內核聚集發(fā)光強度的影響，以進一步揭示TPE聚集行為的變化^{［16，20］}。圖8是濃度為1 mmol/L下4種mPEG-TPE膠束在水溶液中的熒光強度對比。圖8顯示：隨著mPEG鏈長的增加，3種（由P15到P23再到P35的熒光強度逐漸下降，表明膠束內核TPE的聚集程度隨之逐漸減弱，與CMC、粒徑結果所呈現(xiàn)的趨勢一致，即在TPE物質的量固定的前提下，mPEG鏈增長，mPEG-TPE更傾向溶解于水中，粒徑變大，同時TPE的聚集減弱，CMC變大，熒光也減弱；而多分散的P1k分子量與P23相當，但熒光強度小于P23，介于其與P15之間，其原因是P1k中存在部分鏈短的mPEG（分子量小于1000）參與形成的膠束內，TPE的聚集程度比單分散P23膠束內TPE聚集更加緊密，導致更高的熒光強度。在CMC及粒徑的測定過程中，多分散與單分散mPEG-TPE膠束聚集狀態(tài)的差異難以區(qū)分，但分散度導致的膠束內核TPE集聚的微小差別，通過其聚集發(fā)光效應產生的熒光信號能輕松區(qū)別，較傳統(tǒng)CMC方法，這種方法能有效區(qū)別不同膠束內核聚集狀態(tài)的差異，具有更高的靈敏度^［21］。

2.5 水解穩(wěn)定性

mPEG-TPE的乙酸酯鍵在水溶液中發(fā)生水解從而導致膠束解體^［22］。4種mPEG-TPE膠束在PBS溶液中的穩(wěn)定性如圖9所示。由圖9可知，在37 ℃的PBS中攪拌168 h后，親水段最短的P15殘留量最高，為66%，代表其穩(wěn)定性最高；其次是P23，殘留量為47%；穩(wěn)定性最差的為親水段最長的P35，剩余43%；多分散P1k的穩(wěn)定性介于P15與P23之間，剩余60%。根據水解曲線比較可得其總體抗水解穩(wěn)定性的大小依次為：P15、P1k、P23、P35，與上述CMC與熒光強度的結果保持一致。

2.6 抗蛋白吸附

4種mPEG-TPE膠束與BSA水溶液共同孵育，測定鏈長與分散度對膠束穩(wěn)定性的影響，結果如圖10所示。圖10表明：單分散P15膠束的粒徑在孵育1h內顯著增大，而單分散的P23、P35膠束的粒徑則分別在2 h和3 h后才發(fā)生顯著增大，膠束粒徑變大跟BSA在其表面的吸附有關，隨著更多的BSA附著，導致自身膠束的粒徑變大，通過BSA融合，使得粒徑進一步變大；鏈長更長的聚乙二醇膠束具有更強的抵御蛋白吸附能力；多分散P1k與單分散P23的PEG鏈長相當，但其膠束在BSA溶液中的穩(wěn)定性（介于1～2 h）低于P23膠束（介于2～3 h），部分鏈短的mPEG-TPE無法在膠束表面起保護作用，難以抵御BSA的吸附，因此膠束粒徑的穩(wěn)定性實際上受制于鏈短部分。因膠束表面具有均勻的鏈長，單分散mPEG克服了多分散PEG膠束存在短鏈部分不足以保護其表面的缺陷。納米載體表面抵御蛋白吸附的能力與納米載體在體內半衰期存在著很大的關聯(lián)^［23-25］，因此，使用單分散PEG的納米制劑，有助于延長藥物在體內的半衰期，從而達到更好的療效。

3 結 論

本文通過合成3種不同鏈長的單分散mPEGn-TPE（P15、P23、P35）與1種多分散mPEG1000-TPE（P1k），分析了聚乙二醇鏈長及分散性對mPEG-TPE膠束的理化性質影響，主要結論如下：

a）在單分散P15、P23、P35膠束中，PEG鏈增長，膠束內核TPE集聚趨于松散、膠束的CMC增大，熱力學穩(wěn)定性降低，水解速度加快，膠束在BSA水溶液中的粒徑穩(wěn)定性隨著鏈長的增加而明顯增強。

b）與鏈長接近的多分散P1k膠束相比，單分散P23膠束在理化性質方面與P1k差異不明顯，在抵御BSA吸附方面有明顯的優(yōu)勢。

目前納米醫(yī)學領域中相關研究與應用均采用多分散mPEG，然而根據本文研究，單分散mPEG抗蛋白質吸附能力更優(yōu)，因此，在開發(fā)高端納米制劑中有必要使用單分散mPEG，從而獲得更好的臨床效果。

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（責任編輯：廖乾生）