曹 婧,戴忠良,徐迎春,劉春貴,徐 婷,孫春青,*

(1 江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,江蘇句容 212400;2 南京農(nóng)業(yè)大學(xué),南京 210095;3 江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,江蘇揚(yáng)州 225000)

睡蓮科(Nymphaeaceae)有8～9屬約100個(gè)種,其中睡蓮屬(Nymphaea)有50余種[1]。睡蓮屬植物根據(jù)心皮附屬物的有無(wú)可分為Nymphaea亞屬、Brachyceras亞屬、Anecphya亞屬、Lotos亞屬和Hydrocallis亞屬[2]。其中,Nymphaea亞屬包括8種,在北半球的溫帶地區(qū)分布;Brachyceras亞屬包括14～16個(gè)種,在熱帶和亞熱帶地區(qū)分布;Anecphya亞屬包括7～10個(gè)種,主要在澳大利亞和新幾內(nèi)亞分布;Lotos亞屬包括3～4個(gè)種,在熱帶地區(qū)分布;Hydrocallis亞屬包括14個(gè)種,在熱帶地區(qū)分布[3]。盡管有些睡蓮亞屬的種數(shù)量少,但是睡蓮屬植物在生活史、心皮形態(tài)、繁育系統(tǒng)、傳粉生物學(xué)等方面表現(xiàn)出顯著的多樣性[4-8]。

目前,從形態(tài)學(xué)[9]、解剖學(xué)[10]和分子生物學(xué)[3]已對(duì)睡蓮屬植物的系統(tǒng)分類(lèi)和進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行了相關(guān)研究,但仍存在互相矛盾的觀點(diǎn)[2],因此,有必要從孢粉學(xué)角度研究睡蓮屬植物的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。更重要的是,睡蓮屬處于被子植物系統(tǒng)進(jìn)化的關(guān)鍵位置[11],并且睡蓮屬植物在生態(tài)和形態(tài)特征上具有多樣性,因此,睡蓮屬植物孢粉學(xué)的特征對(duì)于研究早期被子植物生殖特征進(jìn)化至關(guān)重要。但是先前的研究?jī)H對(duì)睡蓮屬植物的數(shù)種花粉特征開(kāi)展研究。例如,楊梅花等僅對(duì)4種睡蓮的花粉形態(tài)進(jìn)行研究,結(jié)果表明雪白睡蓮(N.candida)的花粉形態(tài)特征在睡蓮屬植物中較原始[12]。

同樣地,Zini等僅對(duì)Hydrocallis亞屬的3個(gè)種花粉粒發(fā)育特征和超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)Hydrocallis亞屬花粉的花粉壁較光滑,花粉壁無(wú)顆粒、棒狀、疣狀等紋飾[10]?，F(xiàn)有睡蓮屬植物孢粉學(xué)研究缺乏多個(gè)亞屬關(guān)鍵的花粉形態(tài)特征資料,因此需要對(duì)睡蓮屬植物未報(bào)道的花粉形態(tài)特征進(jìn)行研究,并對(duì)其進(jìn)行全面比較分析。此外,耐寒睡蓮與熱帶睡蓮跨亞屬雜交的母本大多選擇香睡蓮塊莖類(lèi)型的耐寒睡蓮[13],因此本研究對(duì)香睡蓮的花粉活力進(jìn)行評(píng)價(jià),因?yàn)樵谒忞s交組合中母本自交結(jié)實(shí)率高更易獲得跨亞屬雜交種[14],而花粉生活力可直接影響自交結(jié)實(shí)率,以期為耐寒睡蓮與熱帶睡蓮的跨亞屬雜交提供理論依據(jù)。

本研究利用掃描電鏡對(duì)4個(gè)亞屬的18種或品種睡蓮花粉進(jìn)行形態(tài)觀察,測(cè)量和分析了花粉的形態(tài)特征,采用離體萌發(fā)法對(duì)‘彼得’的花粉活力進(jìn)行測(cè)定,研究結(jié)果可為睡蓮屬植物的系統(tǒng)進(jìn)化提供證據(jù),也可為睡蓮雜交育種親本的選擇提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試材料均保存在江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所水生植物資源保存圃。本試驗(yàn)選擇4個(gè)亞屬的18種或品種睡蓮的具體性狀特征見(jiàn)表1。2021年9月,待睡蓮陸續(xù)開(kāi)放,收集供試睡蓮的成熟新鮮花粉。

1.2 方 法

1.2.1 睡蓮花粉形態(tài)學(xué)研究將睡蓮花藥分別置于2.5%戊二醛(用pH 7.2的0.1 mol/L的磷酸緩沖液配制)溶液中4 ℃固定4 h固定8 h以上。

用生理鹽水進(jìn)行3次沖洗,每次10 min;再經(jīng)50%乙醇→60%乙醇→70%乙醇→80%乙醇→90%乙醇→100%乙醇梯度脫水,每個(gè)處理15～20 min,將樣品置于4 ℃過(guò)夜。

再將脫水過(guò)夜處理的花粉進(jìn)行乙酸異戊酯置換、二氧化碳臨界點(diǎn)干燥[15-17]。脫水和干燥后用雙面膠將花粉均勻地粘在金屬臺(tái)上,真空噴金、鍍膜后用Hitachi S-3000N型掃描電鏡(日本Hitachi公司)進(jìn)行觀察。

運(yùn)用系統(tǒng)聚類(lèi)組間聯(lián)接的分析方法,根據(jù)平方歐氏距離測(cè)量,最終獲得18種或品種睡蓮屬植物花粉聚類(lèi)分析圖,從而推斷其系統(tǒng)進(jìn)化規(guī)律以及它們的親緣關(guān)系[20]。

1.2.3 睡蓮花粉生活力研究采用離體培養(yǎng)法對(duì)睡蓮品種‘彼得’進(jìn)行花粉生活力測(cè)定。用吸管吸取2～3滴柱頭液于載玻片作為培養(yǎng)液,選擇第2天開(kāi)放的耐寒睡蓮花朵,于上午9:00用鑷子沾取花粉播種于載玻片的柱頭液上,后將載玻片放入墊有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中,置于恒溫光照培養(yǎng)箱,28 ℃培養(yǎng)4～6 h。

顯微鏡下觀察花粉萌發(fā)情況,以花粉管長(zhǎng)度大于或者等于花粉粒長(zhǎng)度作為花粉管成功萌發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)[21]。

隨機(jī)選擇3個(gè)視野,統(tǒng)計(jì)花粉粒數(shù)量及萌發(fā)數(shù)量,每個(gè)視野隨機(jī)抽取3粒萌發(fā)的花粉粒,測(cè)量花粉管長(zhǎng)度。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2003進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析,圖片處理采用Adobe Photoshop CS5。

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉粒形態(tài)特征

利用掃描電鏡對(duì)18種或品種睡蓮屬植物的花粉形態(tài)進(jìn)行觀察,發(fā)現(xiàn)18種或品種睡蓮屬植物的花粉都是單?；ǚ?。

如圖版Ⅰ所示,18種或品種睡蓮屬植物花粉粒極軸/赤道軸比值范圍為:0.62～0.89,形態(tài)均為近球體或扁球體,極面觀為圓形或近圓形,赤道面觀為圓形、長(zhǎng)圓形或近圓形;其中,花粉粒極軸長(zhǎng)度范圍:15.1～27.9 μm,赤道軸長(zhǎng)度范圍:24.5～32.8 μm,巨花睡蓮花粉粒最大,體積指數(shù)為30.3;埃及白花粉粒最小,體積指數(shù)為19.2;其余花粉粒體積指數(shù)在26左右(表2)。此外,埃及白睡蓮、喀麥隆睡蓮、印度紅睡蓮、墨西哥黃睡蓮的花粉形態(tài)具有異極性。例如:墨西哥黃睡蓮花粉的遠(yuǎn)極面光滑,而近極面為瘤狀紋飾。

埃及藍(lán)睡蓮的萌發(fā)溝為單槽萌發(fā)溝,而其他17種睡蓮屬植物都為環(huán)槽萌發(fā)溝,且與赤道平行(圖版Ⅰ和Ⅱ)。

栽培品種‘達(dá)爾文’和‘佛羅里達(dá)’為遠(yuǎn)級(jí)環(huán)槽類(lèi)型,其他15個(gè)種或品種屬于赤道環(huán)槽或者近赤道環(huán)槽。

香睡蓮、‘達(dá)爾文’、‘火冠’、‘亞克’、‘佛羅里達(dá)’和‘征服者’的花粉萌發(fā)溝較淺。Brachyceras亞屬的藍(lán)星睡蓮萌發(fā)溝內(nèi)有環(huán)形嵴。

18種或品種睡蓮屬植物花粉外壁紋飾存在一定差異,類(lèi)型也比較豐富(表3),大部分為小顆粒狀、瘤狀和小柱狀,少數(shù)具有長(zhǎng)條狀、微波紋起伏狀和網(wǎng)紋狀(圖版Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)。Lotos亞屬喀麥隆睡蓮、埃及白睡蓮的花粉外壁表面均較為平滑,附屬物少;而印度紅睡蓮的花粉外壁表面可觀察到顆粒狀紋飾。巨花睡蓮、小花睡蓮和睡蓮子午蓮的花粉外壁為顆粒狀凸起紋飾。

藍(lán)星睡蓮和一些具有香睡蓮塊莖的種和品種(香睡蓮、‘亞克’、‘火冠’)花粉外壁具有顆粒狀凸起、棒狀和刺狀紋飾,只是紋飾的密度和高度有差異。

2.2 聚類(lèi)分析

聚類(lèi)分析結(jié)果如圖1所示,18種或品種睡蓮屬植物可分為4個(gè)類(lèi)群。第1類(lèi)群有香睡蓮、白睡蓮、墨西哥黃睡蓮和睡蓮子午蓮4個(gè)原生種以及‘寬瓣白睡蓮’、‘達(dá)爾文’、‘火冠’、‘亞克’、‘佛羅里達(dá)’、‘征服者’和‘彼得’7個(gè)栽培種,其花粉主要為圓球形,幾乎每個(gè)品種都有多個(gè)外壁紋飾類(lèi)型,P/E值在0.70～0.84之間。第2類(lèi)群有藍(lán)星睡蓮、小花睡蓮和埃及藍(lán)睡蓮3個(gè)原生種,花粉為扁球形,其P/E值在0.70～0.73之間,體積指數(shù)相近(22.0～23.0),均有瘤狀附屬物。第3類(lèi)群僅有巨花睡蓮,花粉形態(tài)為圓球形,P/E值為0.85,外壁紋飾為微波紋起伏狀,極軸、赤道軸等各項(xiàng)指標(biāo)數(shù)據(jù)均較大。第4類(lèi)群有印度紅睡蓮、喀麥隆睡蓮和埃及白睡蓮3個(gè)原生種,其P/E值在0.62～0.89之間,這3個(gè)原生種的體積指數(shù)、溝長(zhǎng)遠(yuǎn)小于其他種(品種),表面紋飾單一,與其他3個(gè)類(lèi)群又明顯區(qū)別。

2.3 花粉生活力

‘彼得’花粉在28 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱生長(zhǎng)6 h后,花粉萌發(fā)比例高達(dá)95%,如圖2所示,睡蓮花粉粒生長(zhǎng)出花粉管,平均長(zhǎng)度約為260 μm,花粉管生長(zhǎng)狀態(tài)好。因?yàn)樗徥诜酆蠡ǚ凼锹涞街^液中,經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期進(jìn)化選擇,柱頭液內(nèi)含豐富的氨基酸、微量元素[21],為睡蓮花粉發(fā)育提供了最有利的條件,使得花粉具有較好的育性。

3 討 論

3.1 睡蓮屬植物花粉形態(tài)多樣性及分類(lèi)學(xué)意義

18種或品種睡蓮屬植物的花粉形態(tài)具有豐富的多樣性?；ǚ坌螒B(tài)的聚類(lèi)分析結(jié)果可將18種或品種睡蓮屬植物分為4個(gè)類(lèi)群,這一結(jié)果與基于核糖體DNA的ITS序列[3]和葉綠體基因[2]所建立的系統(tǒng)分類(lèi)一致。18種或品種睡蓮屬植物的花粉萌發(fā)溝除了埃及藍(lán)睡蓮是單槽的,其余均為環(huán)槽形的,并且環(huán)槽形花粉溝的位置在花粉遠(yuǎn)極端和赤道間變化,而以前的研究結(jié)果都認(rèn)為睡蓮屬植物的花粉萌發(fā)溝都是環(huán)槽類(lèi)型的[22-23]。Brachyceras亞屬的3個(gè)種都有明顯區(qū)別于其他種的花粉形態(tài)特征,這為這些種的鑒定提供了依據(jù)。Anecphya亞屬的澳大利亞巨睡蓮的花粉體積最大,可能由于其所處的生態(tài)環(huán)境影響所致,這些特征也是鑒定這些種的可靠依據(jù)。Lotos亞屬的花粉外壁紋飾較光滑,且花粉形態(tài)差異小,這與前人的研究結(jié)果[24]一致,可以利用花粉形態(tài)特征從睡蓮屬植物中將Lotos亞屬區(qū)分開(kāi)來(lái)。Nymphaea亞屬中具有香睡蓮塊莖的種和品種的花粉外壁紋飾相似度較高,一般都具有棒狀、刺狀和顆粒狀紋飾,只是紋飾的密度和高度有差異,這一特征可以區(qū)分大多數(shù)睡蓮屬植物中具有香睡蓮血統(tǒng)的種和品種。根據(jù)上述特征,我們推斷Nymphaea亞屬的栽培品種‘亞克’、‘火冠’、‘佛羅里達(dá)’和‘征服者’都可能是香睡蓮的雜交品系。此外,以Brachyceras亞屬藍(lán)星睡蓮、Nymphaea亞屬香睡蓮為代表,其花粉粒表面小顆粒突出且數(shù)量多,且都具有棒狀、刺狀紋飾,這些特征可對(duì)花粉起到較好的保護(hù)作用,有利于結(jié)實(shí)和發(fā)育,因此這些種作為親本雜交成功率大。

3.2 睡蓮屬植物花粉形態(tài)特征的系統(tǒng)進(jìn)化趨勢(shì)

花粉的形態(tài)特征,特別是花粉外壁紋飾、萌發(fā)溝等特征,對(duì)于了解睡蓮屬植物系統(tǒng)演化、親緣關(guān)系及系統(tǒng)分類(lèi)均有重要意義?；ǚ弁獗诒砻婕y飾特點(diǎn)可以反映植物進(jìn)化的一般規(guī)律[25],花粉外壁表面較光滑的較為原始,其次為顆粒狀凸起,再到棒狀、刺狀,最終演化為條紋狀及網(wǎng)狀[26]。本研究中,Lotos亞屬中喀麥隆睡蓮、埃及白睡蓮和印度紅睡蓮的花粉形態(tài)相似,但三者的花粉外壁紋飾不同,其中喀麥隆睡蓮、埃及白睡蓮的花粉外壁表面均較為平滑,附屬物少,說(shuō)明它們?cè)谒弻僦参镏休^為原始、進(jìn)化程度較淺,而印度紅睡蓮的花粉外壁表面可觀察到有顆粒狀附屬物存在,說(shuō)明有進(jìn)化發(fā)展的趨勢(shì);Zini等[23]發(fā)現(xiàn)Hydrocallis亞屬的3個(gè)種花粉壁較光滑,表明Hydrocallis亞屬和Lotos亞屬的種在睡蓮屬植物中最原始,并且這2個(gè)亞屬的種可能有共同的起源[24]。Anecphya亞屬巨花睡蓮、Brachyceras亞屬的小花睡蓮、Nymphaea亞屬的睡蓮子午蓮的花粉外壁都有顆粒狀凸起,Brachyceras亞屬的藍(lán)星睡蓮、Nymphaea亞屬的香睡蓮花粉外壁的顆粒狀凸起更加明顯,且藍(lán)星睡蓮和香睡蓮粉外壁在顆粒狀凸起的基礎(chǔ)上演變出棒狀和刺狀紋飾,說(shuō)明睡蓮屬植物是不斷進(jìn)化的,其中Nymphaea亞屬的香睡蓮在睡蓮屬植物中進(jìn)化程度較高。此外,Nymphaea亞屬中的墨西哥黃睡蓮花粉的遠(yuǎn)極面是光滑的,而近極面具有顆粒狀凸起,說(shuō)明墨西哥黃睡蓮可能是睡蓮屬植物進(jìn)化中的過(guò)渡類(lèi)型。

關(guān)于睡蓮屬植物環(huán)槽萌發(fā)溝的起源一直有爭(zhēng)議,現(xiàn)有兩種假說(shuō)。第一種假說(shuō)認(rèn)為環(huán)槽萌發(fā)溝起源于萍蓬草屬(Nuphar)的單槽萌發(fā)溝[27]。本研究中埃及藍(lán)睡蓮的萌發(fā)溝為單槽萌發(fā)溝,而其他17種睡蓮屬植物都為環(huán)槽萌發(fā)溝,根據(jù)第一種假說(shuō),筆者推斷埃及藍(lán)睡蓮的萌發(fā)溝為睡蓮屬植物的原始形態(tài),而環(huán)槽萌發(fā)溝是睡蓮屬植物的進(jìn)化形式。第二種假說(shuō)認(rèn)為睡蓮屬植物環(huán)槽萌發(fā)溝是單孔形式的,環(huán)槽是單孔結(jié)構(gòu)的擴(kuò)展,花粉粒的整個(gè)遠(yuǎn)極端半球可看作是單孔的修飾部分[27]。根據(jù)第二種假說(shuō),如果遠(yuǎn)極端半球可以看作是修飾蓋,那遠(yuǎn)極端與近極端的超微結(jié)構(gòu)不同[28]。在本研究中,Nymphaea亞屬的白睡蓮和墨西哥黃睡蓮的遠(yuǎn)極面和近極面的超微結(jié)構(gòu)不同,這一結(jié)果支持了第二種假說(shuō),但本研究其他睡蓮屬植物不存在這種現(xiàn)象。睡蓮屬植物萌發(fā)溝的進(jìn)化歷程可能為:遠(yuǎn)極單槽→遠(yuǎn)極環(huán)槽→赤道環(huán)槽[24]。根據(jù)這一進(jìn)化歷程,本研究中埃及藍(lán)睡蓮的萌發(fā)溝屬于最原始類(lèi)型,Nymphaea亞屬白睡蓮和睡蓮子午蓮屬于較原始類(lèi)型,其余原生種萌發(fā)溝都是較進(jìn)化類(lèi)型(赤道環(huán)槽)。此外,栽培品種中‘佛羅里達(dá)’和‘達(dá)爾文’屬于遠(yuǎn)極環(huán)槽,可能是由于品種間雜交的原因。

3.3 睡蓮屬植物花粉形態(tài)特征的親緣關(guān)系分析

花粉形態(tài)特征的穩(wěn)定性強(qiáng),可用于植物種間親緣關(guān)系分析[29]。18種或品種睡蓮屬植物的聚類(lèi)分析結(jié)果表明:Nymphaea亞屬和Brachyceras亞屬中的種和栽培種間的親緣關(guān)系較近;Lotos亞屬中印度紅睡蓮和喀麥隆睡蓮親緣關(guān)系較近,而它們與埃及白睡蓮的親緣關(guān)系較遠(yuǎn);Nymphaea亞屬和Brachyceras亞屬間親緣關(guān)系較近,許多育種者已經(jīng)獲得了這2個(gè)亞屬的雜交種[13,30];Brachyceras亞屬和Anecphya亞屬親緣關(guān)系較遠(yuǎn),但是我們已經(jīng)得到了這2個(gè)亞屬的雜交種,說(shuō)明利用花粉形態(tài)特征分析睡蓮屬植物的親緣關(guān)系有一定的誤差。Nymphaea亞屬和Anecphya亞屬、Lotos亞屬與其他3個(gè)亞屬間的親緣關(guān)系遠(yuǎn),至今無(wú)育種者獲得這些亞屬間的雜交種。

綜上所述,花粉形態(tài)特征,特別是花粉萌發(fā)溝類(lèi)型、外壁紋飾等特征可為睡蓮屬植物種間分類(lèi)、亞屬間以及種間親緣關(guān)系、系統(tǒng)進(jìn)化規(guī)律提供關(guān)鍵的證據(jù)。但孢粉學(xué)的研究對(duì)分析睡蓮屬演化、親緣關(guān)系及系統(tǒng)分類(lèi)具有一定的局限性,仍需通過(guò)形態(tài)學(xué)、解剖學(xué)和分子生物學(xué)等手段深入探討和分析,以便更深層次地了解睡蓮屬植物系統(tǒng)演化過(guò)程。