甯 媛，段 琛，常瓊瓊，侯曉暉

(遵義醫(yī)科大學 基礎(chǔ)醫(yī)學院，貴州 遵義563000)

庫蠓屬(CulicoidesLatreille)隸屬于雙翅目(Diptera)、蠓科(Ceratopogonidae)，是蠓科中最大的屬，也是最重要的吸血蠓。目前，全世界的吸血蠓已知4屬1 671種，其中庫蠓1 415種，而我國已知吸血蠓有3屬475種[1]，其中庫蠓可達350種[2-5]。庫蠓不僅嗜吸食人畜血液，而且傳播牛羊藍舌病、非洲馬瘟等，是國際上重要蟲媒病毒的生物載體[6-8]。近10年來，蠓作為藍舌病等傳染病暴發(fā)流行的生物媒介，給歐洲牲畜貿(mào)易帶來了重大影響，造成了巨大的經(jīng)濟損失，現(xiàn)已成為歐洲各國應用昆蟲學研究的熱點。正確地識別病媒在傳播疾病的風險評估至關(guān)重要，因此，庫蠓的分類與防治成為蠓科昆蟲研究的關(guān)鍵。目前，對庫蠓的分類主要利用其口器、觸須、翅斑、尾器等外部形態(tài)特征作為依據(jù)，但由于庫蠓體型微小、種類繁多，部分庫蠓近似種僅依靠形態(tài)學方法很難區(qū)分，且迄今為止仍有許多種類無法歸屬到任一亞屬。因此，需要開發(fā)更多的新技術(shù)、新方法實現(xiàn)蠓蟲的分類鑒定，如分子或數(shù)字化形態(tài)學工具，以便可靠地對近似物種進行區(qū)分[9-11]。

幾何形態(tài)學(geometric morphometric)是一種研究二維或三維地標位置變化的形態(tài)統(tǒng)計分析方法，它通過對形狀特征進行定量描述和分析，能準確直觀地描述不同生物體種內(nèi)與種間微小的形狀差異[12]，被逐漸引入昆蟲分類學研究中。昆蟲的翅膀形態(tài)在自然界中具有很高的遺傳性，而且它們基本上是二維的，容易測量、易于識別。自1893年康斯托克首次將昆蟲翅膀脈序用于傳統(tǒng)分類以來，越來越多學者開始在系統(tǒng)發(fā)育研究中使用昆蟲的翅，尤其是二維形態(tài)計量學[13]。目前，幾何形態(tài)學已成為有效的輔助工具，被國內(nèi)外學者廣泛運用于膜翅目、雙翅目、鞘翅目、半翅目等多個類群的昆蟲研究[14-20]。雖然幾何形態(tài)學在國外的蠓類分類研究中已有應用[21-23]，但國內(nèi)應用僅見本課題組的相關(guān)研究[24]。

我國庫蠓現(xiàn)分屬于12個亞屬，但有一部分種類無法歸屬于任何亞屬。本研究以庫蠓6亞屬即帶紋亞屬(Beltranmyia)、二囊亞屬(Avaritia)、庫蠓亞屬(Culicoides)、屋室亞屬(Oecacta)、三囊亞屬(Trithecoides)、單囊亞屬(Monoculicodie)為研究對象，運用幾何形態(tài)學計量分析法對庫蠓翅的大小與形態(tài)變化進行分析，探討其亞屬間親緣關(guān)系，為庫蠓的分類和進化研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 庫蠓標本

本實驗所用標本采自貴州、遼寧、西藏、內(nèi)蒙古等省區(qū)，選用翅面無褶皺且完整的6亞屬、20種、雄性庫蠓標本共63張，所取標本與編號見表1。

1.1.2 儀器與試劑

OLYMPUS(SZ61)光學體視顯微鏡、LEICA(DM2500)光學顯微鏡與Canon DS照相機分別為日本OLYMPUS公司、德國LEICA公司和日本OLYMPUS公司生產(chǎn)。75%乙醇、無水乙醇、二甲苯、氫氧化鈉均為國產(chǎn)分析純，中性樹膠購于上海懿洋儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 翅圖像采集與地標點提取

首先采集庫蠓翅的圖像，然后使用TpsUtil軟件進行格式轉(zhuǎn)換。再利用TpsDig2.16軟件對每張翅圖進行人工標點，共標記10個地標點(圖1)，所得數(shù)據(jù)保存為TPS文件。

1.2.2 普氏疊加

表1 標本信息Table 1 Information of specimens in this study

續(xù)表1

Arc，弓脈；R，徑脈；R-M，徑中橫脈；M、M1、M2，中脈及其分支；Cu、Cu1、Cu2，肘脈及其分支；r1，徑1室。Arc， Arculus; R， Radial vein; R-M， Radial-median crossvein; M， M1 and M2， Medial vein and branches; Cu， Cu1 and Cu2， Cubital vein and branches; r1， First radial cell.圖1 庫蠓翅的10個地標點(以長緣庫蠓C. longirostris為例)Fig.1 Distribution of ten landmarks on the wing of Culicoides longirostris

利用廣義普氏分析法(generalized procrustes analysis， GPA)疊加地標構(gòu)型，其基礎(chǔ)是相應地標之間距離的廣義最小二乘疊加，使地標點離差最小化，剔除同一坐標體系中非形態(tài)因素的影響。使用Morpho J軟件包將所得地標點進行普氏疊加。

1.2.3 質(zhì)心值

為了評價物種翅的大小在鑒別中所起的作用，幾何形態(tài)學中常使用質(zhì)心值(centriod size， CS)比較樣本間翅的大小。CS是唯一與所有形狀變量無關(guān)的尺寸測量方法，其靈敏度遠遠高于常規(guī)測量。首先使用PAST 3.0軟件計算63種庫蠓翅形質(zhì)心值，然后進行shapiro-Wilk正態(tài)分布檢測，并通過Leven方差齊性檢驗，做單因素方差分析(One-way ANOVE)比較庫蠓6亞屬不同種類翅的大小差異及其顯著性。

1.2.4 主成分分析與典型變量分析

在普氏疊加的基礎(chǔ)上，利用主成分分析(principal component analysis， PCA)和典型變量分析(Canonical variate analysis， CVA)來評估形狀空間的變異性，以及亞屬間相似性和鑒別性。CVA通過假設(shè)協(xié)變量矩陣是相同的，從而找到相對于組內(nèi)變化而言，組均值最大化的形狀值。這是一種有效的分類單元間差異檢測方法。平均形狀兩兩差異的統(tǒng)計學意義通過馬氏(Mahalanobis)距離的置換試驗(1 000次重復)測定，由于形狀變化的各向異性(方向依賴)致P值不同，因此這種測試被用來評估顯著性。

1.2.5 聚類分析

通過6亞屬不同庫蠓翅的形態(tài)變化平均數(shù)據(jù)計算出亞屬間翅形的普氏距離，再根據(jù)普氏距離矩陣進行聚類分析，建立亞屬間翅的表型樹，比較庫蠓屬6亞屬間的親緣關(guān)系。首先運用tps-Super 32軟件計算種的平均形態(tài)，再應用tps-Small 1.20軟件計算樣本間的普氏距離，通過NTsys 2.10e軟件運用非加權(quán)組平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means， UPGMA)分析普氏距離矩陣，創(chuàng)建表型樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 6亞屬間翅的大小差異

庫蠓屬6亞屬不同種類的質(zhì)心值結(jié)果均符合Shapiro-Wilk正態(tài)分布，通過Leven方差齊性檢驗，進行WelchFtest非參數(shù)檢驗比較其翅的大小。結(jié)果表明，二囊亞屬平均翅形最大，屋室亞屬平均翅形最小，大小順序為：二囊亞屬(Avaritia)>三囊亞屬(Trithecoides)>B帶紋亞屬(eltranmyia)>庫蠓亞屬(Culicoides)>單囊亞屬(Monoculicodie)>屋室亞屬(Oecacta)，但差異不顯著(F=156.7，df=11，P=1.961>0.05)。

2.2 6亞屬間翅的形態(tài)變異

對庫蠓屬6亞屬不同種類的翅進行主成分分析，共產(chǎn)生16個主成分(PC)，其中PC1(73.648%)和PC2(12.372%)占總變異量的86.020%，可以解釋庫蠓屬6亞屬翅的主要差異，為了可視化，差異結(jié)果通過網(wǎng)格圖形式展現(xiàn)(圖2)。由圖2可知，在PC1軸上，翅的變異主要發(fā)生徑2室與翅基部(標點3和10)，徑2室呈外展趨勢，而翅基部呈縮小趨勢；在PC2軸上，翅的變異主要發(fā)生在徑中橫脈、徑1室、徑2室內(nèi)(標點1～3、7和8)，以及翅基部到肘1脈端部的區(qū)域(標點9到10)，徑中橫脈、徑1室、徑2室內(nèi)呈縮小趨勢，而中4室、翅基部呈現(xiàn)出外展的趨勢。由此可知，庫蠓屬6亞屬翅的差異主要集中于徑中橫脈、翅基部、徑1室、徑2室和中4室。此外，對庫蠓屬6亞屬不同種類的翅進行典型變量分析，由CVA散點圖(圖3)可知，同一亞屬的種類基本聚在一起，不同亞屬間基本無交叉。同時，通過庫蠓屬6亞屬翅的馬氏距離及其P值比較表(表2)可知，三囊亞屬和單囊亞屬間的馬氏距離最大，達9.476 3，即兩者間的翅形差異最大；而帶紋亞屬和屋室亞屬間的馬氏距離最小，為4.284 7，即兩者間的翅形差異最小。6亞屬間庫蠓的翅形變異顯著，具有統(tǒng)計學意義(P﹤0.05)。

2.3 庫蠓屬6亞屬翅的聚類分析

由圖4可知，該表型樹分成2大支：庫蠓亞屬與三囊亞屬聚為1支，而其余4亞屬聚為一大支；二囊亞屬和單囊亞屬先后從4亞屬的大支中分出來，帶紋亞屬和屋室亞屬聚為1支。說明6亞屬中帶紋亞屬和屋室亞屬的親緣關(guān)系最近，三囊亞屬與庫蠓亞屬的親緣關(guān)系次之，單囊亞屬與三囊亞屬的親緣關(guān)系最遠。

圖2 六亞屬庫蠓翅形在PC1和PC2上的形狀變化網(wǎng)格圖Fig.2 Distribution of wing shape variation in six subgenera along first two PCs

3 討論

本研究運用幾何形學方法對庫蠓屬6亞屬不同種類的翅進行了大小和形態(tài)比較分析，質(zhì)心值分析雖獲得了不同亞屬庫蠓翅的大小順序，但其統(tǒng)計學分析無顯著差異，說明翅的大小不能作為區(qū)分亞屬的特征依據(jù)[25-26]。主成分分析結(jié)果中PC1和PC2解釋了庫蠓6亞屬不同種類翅形的主要差異，并通過網(wǎng)格圖展示了差異的部位，其差異主要集中于徑中橫脈、翅基部、徑1室、徑2室和中4室內(nèi)，這幾個位置可作為鑒別庫蠓種類的依據(jù)。同時，CVA結(jié)果中散點圖和Mahalanobis距離均提示庫蠓6亞屬不同種類的翅形有顯著差異，利用翅形能成功鑒別出亞屬及其不同物種，這與國內(nèi)外學者利用幾何形態(tài)學在庫蠓、按蚊、實蠅等方面獲得的研究成果一致[27-30]。此外，聚類分析的結(jié)果與CVA結(jié)果一致，即6亞屬中帶紋亞屬與屋室亞屬的親緣關(guān)系最近，而三囊亞屬和庫蠓亞屬與其他4亞屬親緣關(guān)系較遠。上述結(jié)果雖依據(jù)不同種類庫蠓的翅形變化，但分類結(jié)果卻與各亞屬形態(tài)分類有一定的相似性，如帶紋亞屬和屋室亞屬均為兩復眼分離、觸須第三節(jié)有感覺器窩；較近的二囊亞屬與帶紋亞屬和屋室亞屬有一定區(qū)別，即兩復眼連接、第三節(jié)觸須有感覺器窩；較遠的庫蠓亞屬和三囊亞屬則形態(tài)特征區(qū)別最大，兩者皆為兩復眼連接、第三節(jié)觸須無感覺器窩。本研究表明，幾何形態(tài)學計量法能夠作為一種有效的輔助工具應用于蠓科的分類研究中，并且可用于探討亞屬間親緣關(guān)系，但由于自然界中存在普遍的協(xié)同進化現(xiàn)象，其結(jié)果能否準確地反映物種之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系還需結(jié)合分子生物學等多種數(shù)據(jù)進行綜合分析。

與傳統(tǒng)分類方法相比，幾何形態(tài)學具有量化、快速、準確等優(yōu)點，僅憑借翅脈中的幾個重要結(jié)合點所形成的幾何空間的差異變化就可以快速區(qū)分庫蠓屬的亞屬，相對于分子生物學鑒定技術(shù)，它具有成本低、可重復性強、輸出結(jié)果直觀等優(yōu)點。因此，本研究為蠓類分類鑒定工作提供了一個新方法、新思路。但幾何形態(tài)學在昆蟲研究中的應用仍存在一定局限性：(1)存在人為因素的誤差，如人工選取地標點、處理圖片等；(2)所選取的研究特征不具代表性和全面性，如翅脈特征在亞屬的分類和鑒定過程中，具有一定的意義但不能作為唯一或者最重要的鑒定分類特征；(3)幾何形態(tài)學分析不能處理缺失樣本，不完整的樣本可供分析的形態(tài)信息可能不夠充分。

圖3 庫蠓屬6亞屬翅形典型變量分析散點圖Fig.3 Scatter plots of canonical variate analysis of six subgenera

表2 六亞屬間翅的馬氏距離及其顯著性比較(基于10 000次重復)Table 2 Comparison of six subgenera wing based on the Mahalanobis distance and significant test (based on 10 000 permutation rounds)

圖4 基于普氏距離對6亞屬庫蠓進行聚類分析Fig.4 Phenetic tree of six subgenera wing based on the Procrustes distance