徐蘇云，崔銘昊，燕 燕，李勤鋒，王宇磊

(1.上海理工大學(xué) 環(huán)境與建筑學(xué)院，上海 200093； 2.平湖市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，浙江 平湖 314200)

蘆筍因其良好的口感和質(zhì)地，以及富含維生素、類黃酮、酚酸和膳食纖維等高生物活性化合物而被廣泛食用。2012年中國蘆筍生產(chǎn)面積13.3萬hm2，占全球蘆筍栽培面積的50%以上，僅鮮筍的總產(chǎn)值就達(dá)150億元以上[1]。蘆筍主要作為蔬菜食用，可食用部分嫩莖僅占整株生物學(xué)產(chǎn)量的2/3，近40%莖葉被浪費(fèi)。采摘季節(jié)過后，蘆筍將繼續(xù)生長，地上莖的高度可達(dá)180～250 cm，這部分莖被稱為蘆筍老莖。蘆筍老莖的主要成分是木質(zhì)素、半纖維素和纖維素，可加工為飼料，但由于近年來我國部分地區(qū)的畜牧業(yè)受到限制，大量的蘆筍老莖在采摘季節(jié)后被丟棄，任其腐敗或就地焚燒，既污染環(huán)境又造成資源的浪費(fèi)。因此，尋找一種合理的蘆筍老莖處理方式，提高蘆筍整株的利用價值，已成為蘆筍種植戶和蘆筍加工企業(yè)亟待解決的問題。

一般認(rèn)為，富含纖維素的作物殘留物約占農(nóng)業(yè)廢物干質(zhì)量的50%。纖維素的生物降解是生物圈碳循環(huán)的重要組成部分，具有生產(chǎn)生物燃料或化學(xué)品生物產(chǎn)品的潛力[2]。如果將這些富含纖維素的農(nóng)業(yè)廢棄物用于厭氧消化，可以產(chǎn)生大量的沼氣和穩(wěn)定的肥料。然而，纖維素類有機(jī)物在厭氧消化過程中分解緩慢[3]。大量研究表明，細(xì)菌和真菌等外源微生物的接種可以分泌纖維素酶，加速水解過程中纖維素的生物降解[4]，可用于厭氧消化的水解預(yù)處理階段。

相關(guān)研究表明，在密閉的厭氧環(huán)境下，水解是農(nóng)業(yè)廢棄物的限速步驟。在有氧環(huán)境中，有機(jī)物水解的能力明顯超過厭氧環(huán)境[5]。微好氧環(huán)境可促進(jìn)微生物發(fā)酵，顯著提高纖維素的分解效率。近年來，國內(nèi)外開始將非密閉系統(tǒng)應(yīng)用于農(nóng)業(yè)廢棄物的水解，對傳統(tǒng)的連續(xù)攪拌槽反應(yīng)器(CSTR)稍加改動，利用被動通氣或向反應(yīng)器內(nèi)鋪設(shè)通氣裝置的方法來達(dá)到調(diào)節(jié)溶解氧(DO)濃度的目的。微好氧是介于好氧和厭氧之間的狀態(tài)。通常認(rèn)為，微好氧環(huán)境的DO在0.2～1 mg·L-1，好氧狀態(tài)的DO在2 mg·L-1以上，而傳統(tǒng)的厭氧發(fā)酵體系中DO低于0.2 mg·L-1。研究發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)?shù)钠貧饬坎粌H可以增加纖維素酶活性、促進(jìn)固體有機(jī)廢棄物的水解[6]，同時還可減少因過度曝氣而產(chǎn)生的碳損失[7]。

在富含纖維素的農(nóng)業(yè)廢棄物降解過程中，會形成腐殖質(zhì)類物質(zhì)(HS)等復(fù)雜的非均相有機(jī)化合物[8]。研究表明，HS中的多種官能團(tuán)會對厭氧發(fā)酵過程中的發(fā)酵細(xì)菌水解酶和蛋白酶起到破壞作用，導(dǎo)致復(fù)雜有機(jī)物質(zhì)水解出現(xiàn)障礙。此外，高含量的黃腐酸也會對厭氧消化池中的甲烷古菌產(chǎn)生不利影響[9]。至今，關(guān)于水解過程中HS產(chǎn)生機(jī)理的研究報道較少。本研究擬探討蔬菜廢棄物蘆筍老莖在非密閉系統(tǒng)中的水解情況，考查接種量和曝氣操作對其纖維素水解和HS生成的影響，以期為相關(guān)研究提供借鑒與參考。

1 材料與方法

1.1 原材料和接種物

以浙江平湖某農(nóng)場的蘆筍老莖為研究對象。蘆筍老莖的含水量為91.05%，揮發(fā)性固體(VS)與總固體(TS)的比值為94.39%，干固體纖維素含量為27.06%。水解菌劑是以土壤為菌種來源，以纖維素為碳源，經(jīng)過分離、擴(kuò)增、馴化培育出來的混合菌劑，包含芽孢桿菌、放線菌、酵母菌和絲狀真菌，1 g菌劑中約含有活菌5×1010，以CMC-Na液體培養(yǎng)基測試該菌劑的纖維素酶活性為43.02 U·g-1，表明該菌劑具有較高的纖維素降解能力。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)置

采用1 L敞口錐形瓶作為非密閉水解酸化裝置。與傳統(tǒng)的密閉發(fā)酵反應(yīng)器相比，該裝置上蓋不密封，允許空氣自由進(jìn)出。實(shí)驗(yàn)共設(shè)置1個對照組(CK)和4個接種組(Run 1～4)，每組投加100 g 蘆筍老莖(顆粒粒徑約1 cm)、500 mL去離子水，各補(bǔ)充1 g尿素作為氮源。對照組未接種微生物；Run 1～3中依次添加0.1、0.3、0.5 g的菌劑；Run 4 在Run 2基礎(chǔ)上曝氣，曝氣速率設(shè)置為2 L·min-1，保持水解液DO在0.5～2 mg·L-1。每處理設(shè)置2個平行，水解反應(yīng)在35 ℃持續(xù)12 d。實(shí)驗(yàn)過程中，每2 d取10 mL的混合物樣品，10 000 r·min-1離心6 min，然后用0.45 μm針式過濾器過濾，濾得上清液儲存待測。

1.3 分析方法

所采集的液體樣品采用總有機(jī)碳(TOC)分析儀(Jena/3100)檢測總凱氏氮(TKN)和TOC含量。在消化結(jié)束時收集殘留物，分別確定TS降解率和纖維素降解率(DRC)。固體纖維素含量和官能團(tuán)變化采用紅外光譜分析儀(FITR，ThermoFisher Nicolet iS10，美國)進(jìn)行分析，光譜范圍為4 000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1，取波數(shù)1 425 cm-1為纖維素特征峰，參考峰2 133 cm-1為硫氰酸鉀的特征峰，計(jì)算D1425/D2133，與纖維素標(biāo)準(zhǔn)曲線定量比較得到樣品的纖維素含量[10]。

水解液中溶解性有機(jī)物組分采用三維熒光光譜儀(3D-EEM，日本日立F-7000FL)表征：在標(biāo)準(zhǔn)溶液中配置不同濃度的腐植酸和黃腐酸，利用3D-EEM進(jìn)行分析，以區(qū)域單位熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，在橫坐標(biāo)上繪制相應(yīng)的腐植酸和黃腐酸含量，繪制校準(zhǔn)曲線，對熒光數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)算腐殖化指數(shù)(HIX)和熒光指數(shù)(FI)[11]。

利用發(fā)芽指數(shù)(GI)對水解中間產(chǎn)物的生物毒性隨水解時間的動態(tài)變化進(jìn)行評價。取10 mL水解液和20粒水芹種子置于玻璃培養(yǎng)皿，放入25 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5 d后對發(fā)芽種子數(shù)量和發(fā)芽種子的根莖長度進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 固體分解和消化產(chǎn)物的表征

圖1所示為各實(shí)驗(yàn)組的TS降解率和DRC。經(jīng)過12 d的水解，各實(shí)驗(yàn)組的TS降解率從低到高依次為CK(35.05%)

圖1 不同處理下蘆筍老莖的TS降解率和DRCFig.1 TS degradation rate and DRC of asparagus old stem

圖2 各實(shí)驗(yàn)組未處理樣品和水解后殘留物的紅外光譜Fig.2 FTIR spectra of raw material and residues after hydrolysis in each group

2.2 水解產(chǎn)物中有機(jī)物的變化

水解過程中pH、TOC、TKN的變化如圖3所示。各實(shí)驗(yàn)組的初始TOC在1 800～1 900 mg·L-1，在水解過程中，從開始到第2天，Run 1～4的TOC分解效率高于CK，可能是由于易分解的有機(jī)物成為供微生物呼吸生長的能量和物質(zhì)來源。在相同的接種率下，Run 4的分解效率高于Run 2，2 d水解后，其TOC值從1 890 mg·L-1的初始值下降到413 mg·L-1；到12 d水解結(jié)束時，Run 4的TOC降至282 mg·L-1，說明較為充足的氧氣可以促進(jìn)水中好氧微生物的分解代謝和合成代謝過程，從而提高水解效果。

各實(shí)驗(yàn)組TKN的含量隨水解過程先升高后降低。其中，Run 1～3在0～6 d的水解過程中快速增加，分別達(dá)到147、173、169 mg·L-1。這可能與底物含氮物質(zhì)如蛋白質(zhì)的水解有關(guān)。與此同時，微生物在水解初期利用外加氮源合成分泌大量的胞外水解酶進(jìn)入到液相，對TKN也有一部分貢獻(xiàn)。經(jīng)過6 d的水解，各實(shí)驗(yàn)組的TKN下降，說明蛋白質(zhì)等物質(zhì)逐漸分解、氨氮逐漸轉(zhuǎn)化為硝態(tài)氮[13]。Run 4的TKN含量從一開始就處于較低水平，這可能與好氧微生物的高活性和同化作用對氮的利用有關(guān)[14]。

圖3 水解液中pH、TOC和TKN的變化Fig.3 Changes of pH， TOC and TKN in hydrolysate

2.3 水解液熒光特性的變化

HS是在有機(jī)物的衰變和轉(zhuǎn)化過程中形成的復(fù)雜的非均相有機(jī)化合物[10]。不同來源的溶解有機(jī)物或HS具有不同的熒光團(tuán)，熒光峰的位置和熒光強(qiáng)度也不同[15]。一般來說，腐植酸類物質(zhì)(HA)熒光區(qū)為350～440 nm和430～510 nm，而黃腐酸類物質(zhì)(FA)熒光區(qū)為310～360 nm和370～450 nm[16]。水解過程中，HA和FA質(zhì)量濃度的變化如圖4所示。隨著蘆筍老莖的分解，HA和FA都增加，且增加幅度高于CK。HA和FA質(zhì)量濃度的增加可能與活性微生物和酶作用下纖維素材料轉(zhuǎn)化為HS有關(guān)。Run 1～4中FA的質(zhì)量濃度高于CK，但增加幅度小于HA。水解第2天，Run 4中的FA質(zhì)量濃度上升到最大值1.37 g·L-1，之后持續(xù)下降直至水解結(jié)束，最終Run 1～4中的FA質(zhì)量濃度達(dá)到了類似的水平。Run 4中后期FA的降低與HA的增加相對應(yīng)，HA的結(jié)構(gòu)比FA更復(fù)雜、更穩(wěn)定，同時FA可以被微生物分解轉(zhuǎn)化為HA[17]。水解結(jié)束時，接種組的HA質(zhì)量濃度高于對照組，而FA的質(zhì)量濃度低于對照組，說明菌種接種和曝氣操作加速了TOC和纖維素的降解，同時增加了HS含量。關(guān)于HS的形成機(jī)制有多種假設(shè)，其中一種廣為接受的假設(shè)是糖胺縮合理論，即糖和胺通過一系列復(fù)雜的糖胺縮合反應(yīng)合成HS的關(guān)鍵成分[18]。通過對HS含量和DRC的觀察，Run 4中分解的纖維素越多，HS的含量越高，間接說明接種菌劑和曝氣均可以促進(jìn)纖維素和多糖向HS的轉(zhuǎn)化。

考查HIX和FI的變化規(guī)律，結(jié)果如圖5所示。HIX表征腐殖化程度，通常而言，HIX值越高，腐殖化程度越高[19]。在水解的第6天后，Run1～3的HIX指數(shù)上升較快，表明在水解的中后期階段，接種菌劑有利于低腐殖度組分轉(zhuǎn)化為高腐殖度組分。水解結(jié)束時，Run 1～4的HIX值均高于CK，說明接種可以加速腐殖化進(jìn)程，縮短腐殖時間。本研究中各實(shí)驗(yàn)組的HIX值均低于4。有研究表明，當(dāng)HIX值小于4時，溶解有機(jī)質(zhì)(DOM)主要由自發(fā)來源引起，即主要由微生物活性引起[20]。FI指數(shù)用于表征熒光DOM中腐殖成分的來源，當(dāng)FI>1.9時，表明類腐殖質(zhì)主要源于微生物代謝活動[21]。在水解的第2天，各實(shí)驗(yàn)組的FI指數(shù)均有大幅度增加，說明實(shí)驗(yàn)組中接種微生物與土著微生物都得到了活化并作用于水解反應(yīng)，Run 1～3和CK組的FI值在2.5～2.8，Run 4的FI指數(shù)在3.5～3.7，說明Run 4的自生源特性更加強(qiáng)烈，這可能是由于Run 4接入曝氣后，充分刺激了接種微生物的活性。

圖4 HA和FA在水解過程中的變化Fig.4 Changes of HA and FA during hydrolysis

圖5 HIX和FI在水解過程中的變化Fig.5 Changes of HIX and FI during hydrolysis

圖6 水解過程中GI的變化Fig.6 Changes of GI during hydrolysis

2.4 發(fā)芽指數(shù)分析

如圖6所示，各實(shí)驗(yàn)組的發(fā)芽指數(shù)隨水解時間延長而逐漸增加，比較而言，接種組的GI較對照組增加更快。在水解結(jié)束時，各組的GI從高到低依次為Run 4(93.2%)>Run 2(79.5%)>Run 3(74.6%)>Run 1(68.2%)>CK(60.2%)。這表明在水解過程中接種菌劑對蘆筍老莖中有害物質(zhì)的分解是有效的。在本研究中，Run 4的GI值比其他處理組增加得更快，這可能是由于在曝氣條件下氨和有機(jī)酸等植物毒性物質(zhì)加速分解，水解液中有毒物質(zhì)減少[22]。將GI指數(shù)、FI和HIX進(jìn)行雙變量Pearson相關(guān)性分析(SPSS Statistics V25軟件)，發(fā)現(xiàn)GI指數(shù)與HIX相關(guān)性達(dá)極顯著水平(P<0.01)，說明腐殖化程度越高，生物毒性越低。從水解液的各項(xiàng)指標(biāo)來看，水解液亦可作為植物灌溉水回用于蔬菜種植。

3 結(jié)論

本研究使用不同劑量的纖維素菌劑來促進(jìn)蘆筍老莖的水解。與CK相比，接種可顯著加速纖維素的分解并增加腐殖化程度。綜合比較水解液各項(xiàng)指標(biāo)，當(dāng)菌劑接種比為0.3%時，水解效果較好，處理12 d后蘆筍老莖總固體的最大分解率為75.43%。適當(dāng)增加曝氣提供微好氧環(huán)境，可提高水解產(chǎn)物的腐殖化程度。HIX與GI呈極顯著正相關(guān)，第12天時Run 4水解液的HIX接近3.0，GI指數(shù)為93.2%。該結(jié)果表明，非密閉系統(tǒng)的兼性水解可以獨(dú)立應(yīng)用于蔬菜廢棄物的分散式減量化和穩(wěn)定化處理。