沈 璐，李勤超，田中貴，稻村達(dá)也，伊日布斯，*

(1.昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明650504； 2.日本京都大學(xué) 農(nóng)學(xué)研究科，日本 京都 606-8502)

根腫病是由蕓薹屬根腫菌(Plasmodiophorabrassicae)侵染十字花科蔬菜引起的一種世界性土傳疾病[1]，該病原菌傳染性強(qiáng)，傳播速度快，一經(jīng)感染可以誘導(dǎo)植物根部細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞分裂素和吲哚乙酸，導(dǎo)致感病植株根部膨大，形成大小不一、形狀各異的根瘤，幾乎沒(méi)有側(cè)根，嚴(yán)重阻礙植物根部對(duì)土壤養(yǎng)分和水分的吸收，使植物地上部分生長(zhǎng)緩慢，植株矮小，甚至死亡[2-3]。研究表明，當(dāng)植物形成根瘤后，其他的微生物更容易破壞植物根部，造成植物根部腐爛，同時(shí)將大量具有活性的根腫菌休眠孢子釋放到土壤中引起傳播[4]。根腫菌休眠孢子在自然條件下可在泥土中存活7～8年，因此田間地塊一旦感病將長(zhǎng)期不再適合種植十字花科作物[5-6]。

目前針對(duì)根腫病的防治措施主要有：(1)農(nóng)業(yè)防治：在感病田間施用生石灰以提高土壤pH是防治根腫病的有效方法。然而近年來(lái)因施用生石灰所造成的土壤板結(jié)、石灰殘留等問(wèn)題也日益嚴(yán)重，長(zhǎng)期施用生石灰使土壤pH處于堿性環(huán)境，容易導(dǎo)致根腫菌產(chǎn)生抗堿性，Donald等[7]發(fā)現(xiàn)土壤pH在7.2及以上時(shí)仍有根腫病發(fā)生。(2)化學(xué)防治：使用化學(xué)藥劑防治十字花科蔬菜根腫病是目前市場(chǎng)上最常用的方法[8]。但是藥劑防治花費(fèi)大、費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且藥劑防治一般是在發(fā)現(xiàn)根腫病后才進(jìn)行防治，一旦根腫菌完成了侵染植物的第一階段，藥劑防治將不會(huì)產(chǎn)生任何效果。不僅如此，近年來(lái)由于過(guò)多地使用化學(xué)藥劑，使土壤中的農(nóng)殘積累日益嚴(yán)重，威脅著蔬菜的品質(zhì)和人體的健康。(3)生物防治：隨著科學(xué)的進(jìn)步以及微生物制劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的推廣應(yīng)用，越來(lái)越多的研究顯示，生物制劑對(duì)根腫菌休眠孢子的萌發(fā)及侵染有明顯的抑制作用，尤其是枯草芽孢桿菌[9]和解淀粉芽孢桿菌[10]在防治根腫病方面表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景，但是目前仍然處于研究階段。(4)抗病育種[11-12]：理論上抗病育種是防治根腫病最直接有效的方法，然而根腫菌生理小種較多，不同的抗病品種對(duì)不同的根腫菌生理小種變種表現(xiàn)出不同的抗性，而且不能針對(duì)性地應(yīng)用抗病品種，這是限制抗病品種種植的主要因素。因此，尋找經(jīng)濟(jì)環(huán)保且能有效防治根腫病的方法是目前十字花科蔬菜最急需解決的問(wèn)題之一。

土壤太陽(yáng)熱處理是一種環(huán)保、有效的土壤消毒方法，使用后無(wú)土壤板結(jié)及農(nóng)殘積累等問(wèn)題。在早期的研究過(guò)程中，人們常認(rèn)為太陽(yáng)熱處理主要通過(guò)提高土壤的溫度，抑制或殺死了土壤中的病原菌，有利于植物的健康生長(zhǎng)[13-14]。2012年Marahatta等[15]發(fā)現(xiàn)太陽(yáng)熱不僅能夠通過(guò)提高溫度以殺死土壤中的病原菌、抑制雜草種子的萌發(fā)，還可以明顯提高土壤微生物活性，增加植株產(chǎn)量。由于操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用低且環(huán)保無(wú)污染，因此太陽(yáng)熱處理具有廣闊的應(yīng)用前景[16-17]。本研究以小白菜為供試材料，測(cè)定太陽(yáng)熱處理前后的土壤理化性質(zhì)、根腫菌休眠孢子數(shù)量、土壤微生物多樣性及發(fā)病率等變化情況，對(duì)太陽(yáng)熱處理于小白菜根腫病的影響作出評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地設(shè)置在云南省嵩明縣小街鎮(zhèn)，試驗(yàn)地土壤為沙壤土，中等肥力，微生物群落豐富，是小白菜根腫病的高發(fā)區(qū)。

1.2 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用小白菜品種為超級(jí)小黃白。

1.3 試驗(yàn)試劑

熒光增白劑(M2R)：由Sigma公司提供；溴化乙錠(EB)、氫氧化鈉(NaOH)和六偏磷酸鈉(SHMP)：均購(gòu)自上海生工生物技術(shù)有限公司。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將試驗(yàn)地大棚平均分為2個(gè)處理區(qū)，包括非太陽(yáng)熱處理區(qū)A和太陽(yáng)熱處理區(qū)B。按照?qǐng)D1采樣點(diǎn)的分布形式使用土壤采樣器分別采集深度為0～10 cm和10～20 cm處的土壤層樣品，每種樣品采集約2 kg。完成樣品采集后，對(duì)大棚進(jìn)行深耕，并在每個(gè)處理區(qū)選擇適當(dāng)?shù)脑囼?yàn)點(diǎn)放置溫度計(jì)以測(cè)量在太陽(yáng)熱處理期間土壤溫度的變化情況，隨后對(duì)大棚進(jìn)行灌水處理，使土壤水分充分飽和，時(shí)間約30 min。最后在太陽(yáng)熱處理區(qū)B覆蓋一層普通農(nóng)用聚乙烯薄膜，封閉大棚30 d。太陽(yáng)熱處理結(jié)束后再次采集土壤樣品(采樣點(diǎn)同第一次)，用于pH值和根腫菌休眠孢子數(shù)量的測(cè)定。

圖1 采樣點(diǎn)分布圖Fig.1 Sampling point distribution

第一次采樣時(shí)間：2015年5月1日(處理前的土壤樣品)；第二次采樣時(shí)間：2015年6月2日(處理后的土壤樣品)；太陽(yáng)熱處理時(shí)間：2015年5月1日—2015年6月2日。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 土壤溫度和pH值的測(cè)定

使用溫度計(jì)(Thermo Recorder TR-52)實(shí)時(shí)記錄溫度值。將溫度計(jì)從1開(kāi)始編號(hào)，按編號(hào)順序?qū)⒚?個(gè)溫度計(jì)分為1組，將每組奇數(shù)編號(hào)溫度計(jì)的一端埋入土壤10 cm處進(jìn)行測(cè)量，偶數(shù)編號(hào)溫度計(jì)的一端埋入土壤20 cm處進(jìn)行測(cè)量，在距地面1 m處放置3個(gè)溫度計(jì)，測(cè)大棚內(nèi)溫度。太陽(yáng)熱處理結(jié)束后使用T&D for Windows T-51/T-52讀取溫度計(jì)溫度并分析。

稱(chēng)量10 g土壤樣品，加25 mL去離子水溶解，靜置25 min，使用pH計(jì)測(cè)土壤的pH值。

1.5.2 土壤根腫菌休眠孢子數(shù)量的測(cè)定

參照Shinoda等[18]的方法檢測(cè)土壤中根腫菌休眠孢子的數(shù)量。稱(chēng)取20 g風(fēng)干的土壤樣品與400 mL六偏磷酸鈉溶液混合均勻，并將pH調(diào)整到10，然后在180 W功率下對(duì)土壤泥漿溶液進(jìn)行超聲波破碎，時(shí)間為10 min。將破碎過(guò)的土壤泥漿溶液pH調(diào)整到9，充分混勻后吸取40 mL混合液通過(guò)8層125 μm的篩網(wǎng)過(guò)濾，定容至100 mL。吸取300 μL混合液與等量的熒光增白劑和溴化乙錠充分混勻。在血球計(jì)數(shù)板兩側(cè)各加入10 μL染色的休眠孢子溶液，于400倍熒光顯微鏡下鏡檢。

1.5.3 太陽(yáng)熱處理對(duì)小白菜根腫病防治效果

將采集的土壤樣品與腐殖土(121 ℃滅菌30 min)按體積比為1∶9的比例混合(采集的土壤樣品5 mL∶腐殖土45 mL)，每個(gè)土壤樣品3次重復(fù)。在每個(gè)培養(yǎng)盤(pán)穴中播8～10粒白菜種子，出苗后6～8 d內(nèi)長(zhǎng)出2～4片子葉時(shí)，剪去生長(zhǎng)不良的白菜幼苗，只留一株健康的白菜幼苗，種植周期約32 d。

參考司軍等[19]的方法判斷小白菜根腫病的發(fā)病等級(jí)(圖2)。0級(jí)，根部無(wú)腫瘤，根系發(fā)育正常；1級(jí)，根系主根不發(fā)病或不明顯，側(cè)根有小腫瘤；2級(jí)，側(cè)根腫瘤大，且主根有小腫瘤；3級(jí)，主根明顯腫大，無(wú)須根。

發(fā)病率=感病植株/統(tǒng)計(jì)的總株數(shù)×100%。

病情指數(shù)=∑(各級(jí)發(fā)病株數(shù)×各級(jí)代表數(shù)值)/(調(diào)查總株樹(shù)×最高病情級(jí)數(shù))。

1.5.4 太陽(yáng)熱處理對(duì)土壤細(xì)菌微生物多樣性影響

(1)土壤總DNA的提取

稱(chēng)取0.25 g土壤樣品，3個(gè)重復(fù)。用PowerSoil DNA Isolation Kit試劑盒提取土壤總DNA，詳細(xì)操作步驟參考試劑盒說(shuō)明書(shū)，隨后用0.8%瓊脂糖凝膠檢測(cè)DNA條帶。土壤DNA保存于-20 ℃冰箱待用。

(2)土壤微生物的PCR擴(kuò)增

將提取的土壤總DNA稀釋10倍作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的模板，使用細(xì)菌通用引物擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA V3～V5區(qū)[20-21]，引物1為341F 5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′，引物2為907R 5′-CCGTCAATTCCTTTRAGTTT-3′。

反應(yīng)體系：10×TaqBuffer 2 μL、dNTP(10 mmol·L-1)1.6 μL、引物1為0.4 μL、引物2為0.4 μL、TaqDNA polymerase 0.2 μL、模板1 μL、加入去離子水14.4 μL至20 μL反應(yīng)體系，每次PCR反應(yīng)均設(shè)置無(wú)菌水的陰性對(duì)照。

擴(kuò)增條件：預(yù)變性94 ℃；94 ℃ 30 s；58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。擴(kuò)增結(jié)束后使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)土壤細(xì)菌PCR產(chǎn)物。

(3)變性梯度凝膠電泳(DGGE)

DGGE膠的濃度范圍為45%～60%，在電壓60 V的條件下電泳13 h。電泳結(jié)束后進(jìn)行照膠分析。

圖2 根腫病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)Fig.2 Different-grade symptom of clubroot

(4)DGGE圖譜顯著性條帶的割膠、克隆和測(cè)序

利用北京百泰克生物技術(shù)有限公司多功能DNA純化回收試劑盒對(duì)優(yōu)勢(shì)菌進(jìn)行割膠回收，取優(yōu)勢(shì)條帶過(guò)夜溶解離心的上清液為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件均與PCR-DGGE相同。然后交由昆明碩擎生物科技有限公司測(cè)序，測(cè)得的序列通過(guò)BLAST進(jìn)行比對(duì)分析。

1.5.5 數(shù)據(jù)處理與分析

通過(guò)Microsoft Excel整理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用SPSS11.0和R軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并計(jì)算土壤微生物的香濃維納指數(shù)。利用Image Lab軟件(Bio-Rad)將不同位置和不同灰度的DGGE條帶進(jìn)行數(shù)字化處理，隨后對(duì)得到的DGGE條帶數(shù)據(jù)信息進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 太陽(yáng)熱處理對(duì)土壤溫度的影響

在太陽(yáng)熱處理期間，大棚內(nèi)最高溫度56.2 ℃，最低溫度10.4 ℃，平均溫度27.8 ℃，30 ℃以上累計(jì)時(shí)間245.3 h，35 ℃以上累計(jì)時(shí)間189.8 h，40 ℃以上累計(jì)時(shí)間134 h。在非太陽(yáng)熱處理區(qū)A，土壤10 cm處的最高溫度41.3 ℃，最低溫度18.1 ℃，平均溫度為29.1 ℃，30 ℃以上累計(jì)時(shí)間259.2 h，35 ℃以上累計(jì)時(shí)間108.7 h，40 ℃以上累計(jì)時(shí)間5.3 h，在土壤 20 cm處的最高溫度32.8 ℃，最低溫度20.3 ℃，平均溫度為27.3 ℃，30 ℃以上累計(jì)時(shí)間69.7 h。在太陽(yáng)熱處理區(qū)B，土壤10 cm處的最高溫度可達(dá)46.1 ℃，最低溫度20.5 ℃，平均溫度為33.2 ℃，30 ℃以上累計(jì)時(shí)間451.5 h，35 ℃以上累計(jì)時(shí)間222.5 h，40 ℃以上累計(jì)時(shí)間73.2 h，在土壤20 cm處的最高溫度39 ℃，最低溫度20.8℃，平均溫度為31 ℃，30 ℃以上累計(jì)時(shí)間399.3 h，35 ℃以上累計(jì)時(shí)間62.2 h(圖3)。

分析結(jié)果表明，在太陽(yáng)熱處理區(qū)B 10 cm和20 cm處土壤的最高溫度、最低溫度、平均溫度及>30 ℃、>35 ℃、>40 ℃的累計(jì)時(shí)間(h)均明顯高于非太陽(yáng)熱處理區(qū)A，且在太陽(yáng)熱處理區(qū)土壤10 cm處>40 ℃累計(jì)時(shí)間和溫度的提高幅度明顯高于土壤20 cm處。其中太陽(yáng)熱處理區(qū)10～20 cm處>30 ℃累計(jì)時(shí)間(399.3 h)較非處理區(qū)(69.7 h)增加了330.6 h，累計(jì)時(shí)間明顯增加。大棚土壤溫差變化明顯小于大棚內(nèi)的溫度變化，而且0～10 cm處溫差(25.6 ℃)高于10～20 cm處溫差(12.5 ℃)，表明土層越深，溫差變化越小(表1)。

2.2 太陽(yáng)熱處理對(duì)土壤pH的影響

試驗(yàn)前，對(duì)照區(qū)A的0～10 cm和10～20 cm處土壤的pH分別為4.76、4.88，太陽(yáng)熱處理區(qū)B的0～10 cm和10～20 cm處土壤的pH分別為4.96、5.02。試驗(yàn)后，A區(qū)的0～10 cm和10～20 cm處土壤的pH分別為4.97、5.07，B區(qū)的0～10 cm和10～20 cm處土壤的pH分別為5.60、5.78，結(jié)果表明太陽(yáng)熱處理明顯提高了土壤的pH值(P<0.05)，在0～10 cm處土壤的pH值提高了0.64，而10～20 cm處土壤的pH提高了0.76(圖4)。

2.3 太陽(yáng)熱處理對(duì)土壤根腫菌休眠孢子數(shù)量的影響

圖3 太陽(yáng)熱處理期間土壤溫度的變化Fig.3 Changes of temperature during soil solarization

表1 太陽(yáng)熱處理對(duì)溫度的影響Table 1 Effect of solarization on temperature

圖4 太陽(yáng)熱處理對(duì)土壤pH的影響Fig.4 Effects of solarization on soil pH

試驗(yàn)前，太陽(yáng)熱處理區(qū)B土壤0～10 cm處樣品中有活性的根腫菌休眠孢子數(shù)量為1.09×106g-1，10～20 cm處風(fēng)干土壤中有活性的根腫菌休眠孢子數(shù)量為1.13×106g-1。太陽(yáng)熱處理后，0～10 cm處的根腫菌休眠孢子數(shù)量減少至5.74×105g-1，而10～20 cm的根腫菌休眠孢子數(shù)量為9.74×105g-1，結(jié)果表明，太陽(yáng)熱處理使土壤0～10 cm處根腫菌休眠孢子的數(shù)量明顯降低(P<0.05)，而對(duì)10～20 cm處的根腫菌休眠孢子幾乎無(wú)影響(圖5)。

圖5 太陽(yáng)熱處理對(duì)根腫菌休眠孢子的數(shù)量的影響Fig.5 Effects of solarization on resting spores of Plasmodiophora brassicae

2.4 太陽(yáng)熱處理白菜根腫病防治效果

分別使用試驗(yàn)前在對(duì)照區(qū)A采集的0～10 cm和10～20 cm處的土壤栽培白菜，根腫病的發(fā)病率和病情指數(shù)分別為84.62%、56.2以及87.1%、49.68，太陽(yáng)熱處理區(qū)B發(fā)病率和病情指數(shù)分別為87.1%、45.24以及82.78%、49.89。太陽(yáng)熱處理后，分別使用在A區(qū)采集的0～10 cm和10～20 cm處的土壤栽培白菜，根腫病的發(fā)病率和病情指數(shù)分別為88.68%、52.83以及82.69%、46.80，而B(niǎo)區(qū)發(fā)病率和病情指數(shù)分別為49.12%、16.96以及73.68%、36.25。經(jīng)過(guò)太陽(yáng)熱處理的B區(qū)植物根腫病的發(fā)病率和病情指數(shù)均降低，其中在0～10 cm和10～20 cm處土壤栽培的白菜根腫病的發(fā)病率和病情指數(shù)分別降低了37.98百分點(diǎn)、62.51%以及9.10百分點(diǎn)、27.34%。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，太陽(yáng)熱處理對(duì)0～10 cm處根腫病發(fā)病率和病情指數(shù)影響顯著，而對(duì)10～20 cm處根腫病的發(fā)病率和病情指數(shù)無(wú)明顯的影響(圖6)。

2.5 太陽(yáng)熱處理對(duì)土壤細(xì)菌微生物多樣性的影響

2.5.1 16SrDNA片段PCR產(chǎn)物檢測(cè)

土壤細(xì)菌PCR產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果如圖7。結(jié)果表明PCR產(chǎn)物條帶清晰，且無(wú)散帶現(xiàn)象。片段大小約680 bp，與預(yù)計(jì)大小一致。

2.5.2 土壤細(xì)菌DGGE圖譜指紋分析

圖6 太陽(yáng)熱處理對(duì)根腫病發(fā)病率和病情指數(shù)的影響Fig.6 Effects of solarization on clubroot incidence rate and disease index

由圖8-A可知，在土壤0～10 cm處，土壤細(xì)菌的條帶數(shù)目較少，不同泳道條帶均含有條帶1、2、3(除條帶16)，但這些條帶在不同泳道中的強(qiáng)弱并不相同，如條帶3在12～16泳道亮度明顯降低，表明在試驗(yàn)后條帶3所代表的細(xì)菌微生物的數(shù)量明顯減少。條帶4只在13～16泳道中檢測(cè)到，表明在試驗(yàn)后條帶4所代表的微生物種群富集，13～16泳道的條帶數(shù)目>9～12泳道的條帶數(shù)目>1～8泳道的條帶數(shù)目，說(shuō)明太陽(yáng)熱處理使土壤0～10 cm微生物群落結(jié)構(gòu)更加多樣化，且試驗(yàn)后細(xì)菌群落的多樣化程度大于試驗(yàn)前。土壤10～20 cm處的DGGE圖譜如圖8-B，不同泳道均含有共同條帶1、2、4，條帶3只在7～13泳道檢測(cè)到，說(shuō)明在試驗(yàn)后對(duì)照的條帶3代表了微生物富集，而太陽(yáng)熱處理使該微生物的數(shù)量減少，條帶4在13～16泳道亮度明顯增加，說(shuō)明太陽(yáng)熱處理使條帶4所代表的物種數(shù)量明顯增加。

A，0～10 cm處的土壤樣品；B，10～20 cm處的土壤樣品；1～4，試驗(yàn)前對(duì)照的土壤樣品；5～8，試驗(yàn)前太陽(yáng)熱處理區(qū)的土壤樣品；9～12，試驗(yàn)后對(duì)照的土壤樣品；13～16，試驗(yàn)后太陽(yáng)熱處理區(qū)的土壤樣品；M，2 000 DNA marker。A， Soil samples at 0-10 cm; B， Soil samples at 10-20 cm; 1-4， Soil samples in the control zone before experiment; 5-8， Soil samples in the treatment zone before experiment; 9-12， Soil samples in the control zone after experiment; 13-16， Soil samples in the treatment zone after experiment; M， 2 000 DNA marker.圖7 細(xì)菌16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.7 The agarose gel electrophoresis of the PCR amplification product of bacteria 16S rDNA

1～4，試驗(yàn)前對(duì)照的土壤樣品；5～8，試驗(yàn)前太陽(yáng)熱處理區(qū)的土壤樣品；9～12，試驗(yàn)后對(duì)照的土壤樣品；13～16，試驗(yàn)后太陽(yáng)熱處理區(qū)的土壤樣品；A，土壤0～10 cm處細(xì)菌微生物DGGE圖譜；B，使用Image-Lab對(duì)A圖進(jìn)行數(shù)字化處理；C，土壤10～20 cm處細(xì)菌微生物DGGE圖譜；D，使用Image-Lab對(duì)C圖進(jìn)行數(shù)字化處理。1-4， Soil samples in the control zone before experiment; 5-8， Soil samples in the treatment zone before experiment; 9-12， Soil samples in the control zone after experiment; 13-16， Soil samples in the treatment zone after experiment; A， DGGE profiles of bacterial at 0-10 cm; B， Digitized Fig. A with the Image-Lab; C， DGGE profiles of bacterial at 10-20 cm; D， Digitized Fig. C with the Image-Lab.圖8 土壤細(xì)菌DGGE圖譜Fig.8 DGGE profiles of soil bacteria

2.5.3 土壤細(xì)菌微生物多樣性的影響

土壤細(xì)菌微生物的香濃維納指數(shù)如表2。試驗(yàn)前，太陽(yáng)熱處理區(qū)B和非太陽(yáng)熱處理區(qū)A 0～10 cm處土壤細(xì)菌群落的香濃維納指數(shù)分別為1.55、1.51，10～20 cm處土壤細(xì)菌微生物群落的香濃指數(shù)為0.83、0.91。試驗(yàn)后，土壤0～10 cm處A區(qū)和B區(qū)細(xì)菌微生物的香濃維納指數(shù)分別為1.61、1.98，10～20 cm處A區(qū)和B區(qū)細(xì)菌微生物的香濃維納指數(shù)分別為1.19、1.53。結(jié)果表明，試驗(yàn)前后A區(qū)不同深度的土壤細(xì)菌微生物多樣性無(wú)明顯變化；而在B區(qū)，不同深度的土壤微生物多樣性均明顯提高，其中0～10 cm處和10～20 cm處土壤微生物多樣性分別提高了31%和68%。

表2 土壤細(xì)菌香濃維納多樣性指數(shù)Table 2 Shannon-Wiener index of soil bacteria

同列數(shù)據(jù)后沒(méi)有相同字母表示具有顯著性差異(P<0.05)。
The values with different letters in the same column represented significant differences (P<0.05).

2.5.4 DGGE條帶回收測(cè)序結(jié)果

優(yōu)勢(shì)條帶序列及與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的比較結(jié)果如表3，結(jié)果表明，土壤中所檢測(cè)的條帶大部分為未培養(yǎng)的細(xì)菌，且測(cè)序的條帶與已發(fā)表的序列相似度均達(dá)到95%以上。

表3 DGGE膠中回收條帶序列分析結(jié)果Table 3 The comparative results of DGGE bands recovered with the sequence from GenBank

3 結(jié)論與討論

Matheron等[22]研究發(fā)現(xiàn)，太陽(yáng)熱處理可以通過(guò)改變土壤理化環(huán)境以影響活性根腫菌休眠孢子的數(shù)量并降低根腫病發(fā)病率。本研究結(jié)果表明，太陽(yáng)熱處理使土壤在10 cm和20 cm處的溫度升高4.1 ℃和3.7 ℃，雖然不同深度土壤的溫度均得到提高，但幅度較小，不過(guò)溫度累計(jì)時(shí)間卻明顯不同：在土壤10 cm處，太陽(yáng)熱處理區(qū)B的高于30 ℃、35 ℃和40 ℃累計(jì)時(shí)間與非太陽(yáng)熱處理區(qū)A相比明顯增加。推測(cè)太陽(yáng)熱處理區(qū)B溫度提高幅度較小是由于研究期間試驗(yàn)區(qū)平均氣溫低于往年(僅27 ℃)，且半月以上為多云天氣而導(dǎo)致(數(shù)據(jù)來(lái)自天氣預(yù)報(bào))。

研究表明[23]，低pH土壤更容易發(fā)生根腫病，其最適發(fā)病率的pH值為4.5～5.5，將土壤pH值調(diào)節(jié)至6.5以上可有效減輕根腫病的發(fā)生情況。本研究供試土壤試驗(yàn)前的pH值為4.76～5.02，呈弱酸性，太陽(yáng)熱處理使0～10 cm處土壤的pH值比試驗(yàn)前提高了0.64，在10～20 cm處提高了0.76。

根腫病的發(fā)病率和病情指數(shù)與根腫菌休眠孢子的濃度和活性呈明顯正相關(guān)，Gilardi等[24]認(rèn)為，土壤太陽(yáng)熱處理主要通過(guò)提高土壤溫度，直接殺死土壤中的病原菌或降低土壤微生物的活性，性，從而達(dá)到抑制土壤染病的目的。龍同等[25]認(rèn)為，根腫菌休眠孢子在1×103mL-1以上時(shí)均能侵染白菜，而且隨著休眠孢子數(shù)量的增加感染率逐漸升高。本研究結(jié)果顯示，太陽(yáng)熱處理使土壤中根腫菌休眠孢子的數(shù)量明顯降低，但風(fēng)干的土壤中根腫菌休眠孢子的數(shù)量仍達(dá)到5×105g-1以上，該濃度依舊會(huì)導(dǎo)致根腫病的發(fā)生。因此，如何將根腫菌休眠孢子的濃度降低至不可使植物受到侵染還有待進(jìn)一步研究。

目前，土壤微生物多樣性已成為評(píng)價(jià)土壤健康的重要指標(biāo)之一[26]，苗則彥等[27]研究表明，病原菌侵染植物后通過(guò)改變其生理代謝導(dǎo)致分泌物成分和含量的變化，從而造成健康植株和非健康植株根際微生物種類(lèi)及數(shù)量的區(qū)別；劉琴等[28]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，受侵染土壤微生物功能的多樣性明顯低于健康土壤。目前普遍認(rèn)為太陽(yáng)熱處理主要通過(guò)提高土壤的溫度而改變土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)[29-31]。PCR-DGGE技術(shù)是研究土壤中可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)微生物的重要方法[32]，本文利用PCR-DGGE技術(shù)研究太陽(yáng)熱處理對(duì)土壤細(xì)菌微生物多樣性的影響，結(jié)果顯示：在太陽(yáng)熱處理區(qū)B不同深度土壤的細(xì)菌微生物多樣性均明顯提高，其中0～10 cm處和10～20 cm處土壤微生物多樣性分別提高了31%和68%，該結(jié)論與Smalla等[33]和Rumberger等[34]研究結(jié)果相似，提高土壤細(xì)菌微生物的多樣性能夠緩解土壤根腫病發(fā)病情況。

云南省嵩明縣是十字花科蔬菜根腫病的高發(fā)區(qū)，本研究對(duì)該地區(qū)根腫病發(fā)病嚴(yán)重的菜地進(jìn)行太陽(yáng)熱處理，提高土壤的溫度，升高土壤的pH值，提高土壤細(xì)菌微生物的多樣性，使根腫病的發(fā)病率和病情指數(shù)均得到降低。后續(xù)可將太陽(yáng)熱處理與有機(jī)改良土壤或生物防治等技術(shù)相結(jié)合，對(duì)土壤理化性質(zhì)、根際土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)、土壤氮磷含量、EC值及土壤酶類(lèi)有所調(diào)節(jié)，以效果明顯且綠色環(huán)保的方式降低根腫病發(fā)病率及病情指數(shù)。因此，太陽(yáng)熱處理在根腫病的防治方面具有廣闊的研究前景和應(yīng)用價(jià)值。