邵嘉皓，王 杰，賈先波，陳仕毅，賴松家

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物遺傳育種研究所 禽畜遺傳資源發(fā)掘與創(chuàng)新利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611130)

microRNA(miRNA)是一類廣泛存在于各種生命體中具有調(diào)控作用，由內(nèi)源基因編碼的長度約為22個(gè)核苷酸的非編碼小RNA。成熟體miRNA 5′端的5～8個(gè)核酸序列被稱為“種子序列”，能夠與靶基因的3′-非翻譯區(qū)(3′-untranslated regions，3′-UTR)配對，從而在動(dòng)植物中參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控。在脊椎動(dòng)物中，miRNA的形成經(jīng)歷了從轉(zhuǎn)錄、核加工、核輸出、到細(xì)胞質(zhì)再加工的過程，最后形成含有23個(gè)堿基的單鏈RNA，該過程需要核糖核酸酶Ⅲ、解旋酶、exportin-5蛋白和RNA聚合酶Ⅱ等的參與。研究表明，miRNA大多由自身的單拷貝或多拷貝基因簇轉(zhuǎn)錄而來，具有很高的特異性、保守性和時(shí)序性，與卵泡發(fā)育、性別形成、細(xì)胞周期、宿主—病原體互作和胚胎發(fā)育等生命活動(dòng)密切相關(guān)。目前，miRNA研究主要集中在小鼠、豬和家兔等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物上面。Li等[1]利用高通量測序技術(shù)，在家兔體內(nèi)共識(shí)別464個(gè)miRNA前體和886個(gè)成熟miRNA。有研究者在獺兔背部和腹部皮膚中發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的miRNA 211個(gè)，在安哥拉長毛兔毛囊周期生長階段發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的miRNA 97個(gè)，在日本白兔腸道中發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的miRNA 12個(gè)，在初生幼兔和成年兔視網(wǎng)膜中發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的miRNA 28個(gè)[2-5]。這些miRNA在家兔中可能參與調(diào)控多種機(jī)體生理活動(dòng)。本文將對miRNA在家兔中的最新研究進(jìn)行綜述，主要包括miRNA與肌肉發(fā)育、脂肪代謝和家兔疾病調(diào)控3個(gè)方面，旨在為家兔遺傳育種與繁殖提供理論依據(jù)。

1 miRNA的發(fā)現(xiàn)與功能

1993年，Lee等[6]在秀麗新小桿線蟲(Caenorhabditiselegans)中發(fā)現(xiàn)第一個(gè)可時(shí)序調(diào)控胚胎后期發(fā)育的基因lin-4。線蟲細(xì)胞中l(wèi)in-4基因可反向調(diào)節(jié)lin-14蛋白質(zhì)的形成，通過定位克隆lin-4基因，發(fā)現(xiàn)lin-4基因不編碼蛋白質(zhì)，而是合成2個(gè)小的轉(zhuǎn)錄本，轉(zhuǎn)錄本上包含能與lin-14基因mRNA 3′-UTR互補(bǔ)的序列。2000年，Reinhart等[7]在秀麗新小桿線蟲上發(fā)現(xiàn)第二個(gè)異時(shí)性開關(guān)基因let-7。let-7基因RNA能與一些靶標(biāo)基因mRNA的3′-UTR結(jié)合，從而調(diào)節(jié)線蟲的發(fā)育時(shí)序。隨著let-7基因的發(fā)現(xiàn)，研究者們猜想這種具有調(diào)節(jié)功能的微小RNA可能具有廣泛的功能[8]。2001年10月，《Science》報(bào)道了3個(gè)實(shí)驗(yàn)室分別從線蟲、果蠅和人體中發(fā)現(xiàn)的幾十個(gè)類似于lin-4基因的小RNA基因，將其轉(zhuǎn)錄的小RNA命名為microRNA(簡稱miRNA)，并推斷其在動(dòng)物中可調(diào)控多種基因表達(dá)[9-11]。Lee等[11]運(yùn)用計(jì)算機(jī)程序發(fā)現(xiàn)秀麗新小桿線蟲中miRNA基因數(shù)為88個(gè)，待檢測驗(yàn)證的miRNA基因數(shù)不超過35個(gè)。此后，隨著高通量測序和生物信息技術(shù)的發(fā)展，成千上萬的miRNA在各物種中相繼發(fā)現(xiàn)，宣告miRNA時(shí)代的到來[13-15]。

對于miRNA功能的初步探索源于Lee等[6]發(fā)現(xiàn)lin-4基因RNA能與lin-14基因mRNA不完全互補(bǔ)作用而影響lin-14翻譯。運(yùn)用基因分析方法，lin-4和let-7基因RNA被證實(shí)分別與lin-28和lin-41基因mRNA的3′UTR存在RNA-RNA互補(bǔ)關(guān)系[7，16]。1999年，Olsen等[17]發(fā)現(xiàn)，lin-4 RNA通過種子序列與lin-14基因mRNA的3′-UTR結(jié)合，可以使lin-14基因正常轉(zhuǎn)錄形成mRNA并開始正常的翻譯，但是會(huì)抑制隨后的翻譯或蛋白釋放等。成熟miRNA被組裝到RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC)中，形成非對稱RISC復(fù)合體，發(fā)揮基因調(diào)控功能[18-19]。miRNA調(diào)節(jié)功能由miRNA與其靶標(biāo)基因mRNA之間的配對程度決定[20]。當(dāng)miRNA的種子序列與靶標(biāo)基因mRNA 3′-UTR不完全配對時(shí)會(huì)抑制翻譯；當(dāng)miRNA通過種子序列與靶標(biāo)基因mRNA 3′-UTR進(jìn)行完全互補(bǔ)配對，將導(dǎo)致mRNA切割或降解[21-23]。研究發(fā)現(xiàn)，部分miRNA兼具以上2種配對方式，例如let-7轉(zhuǎn)錄生成的miRNA。

miRNA廣泛存在于動(dòng)物中，在進(jìn)化上具有保守性。據(jù)統(tǒng)計(jì)，線蟲中已確定的miRNA基因超過112個(gè)，黑腹果蠅中超過148個(gè)，而已發(fā)現(xiàn)的miRNA基因僅是蛋白編碼基因總數(shù)的冰山一角[24]。另有研究表明，動(dòng)物體內(nèi)存在20%～30%的基因受不同miRNA的調(diào)控[25-26]。2003年，bantam miRNA被發(fā)現(xiàn)有原癌基因作用[27]。miRNA還可作為觸發(fā)RNA干擾(RNA interference，RNAi)的分子，在生物體內(nèi)參與細(xì)胞發(fā)育等過程。miRNA可廣泛參與動(dòng)物生命活動(dòng)，具有重要的調(diào)節(jié)功能。

2 miRNA在家兔肌肉中的研究

肌肉的生長發(fā)育主要由肌細(xì)胞承擔(dān)，細(xì)胞增殖、分化和凋亡是肌肉發(fā)育中重要的生命過程。雖然有關(guān)肌肉發(fā)育的研究一直是生命科學(xué)的熱點(diǎn)主題，但是對重要功能基因和調(diào)節(jié)因子實(shí)施精確調(diào)控的分子機(jī)制和轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有待進(jìn)一步探究。兔肉中富含必需氨基酸和細(xì)肌纖維，探究家兔肌肉中miRNA調(diào)控機(jī)制，對家兔育種和生產(chǎn)具有重要現(xiàn)實(shí)意義。研究表明，某些miRNA在肌肉中特異性或優(yōu)先表達(dá)，并且在魚類、鳥類、哺乳類和圓口類脊椎動(dòng)物中高度保守，稱其為肌相關(guān)microRNAs(myomiRs)，包括miR-1、miR-206和miR-133家族等[28-30]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-208a、miR-208b、miR-486和miR-499具有肌肉組織特異性，且miR-208a僅在心肌中表達(dá)。此外，一些myomiRs還具有表達(dá)時(shí)序性，miR-1與miR-133只在成年動(dòng)物肌肉組織中高度表達(dá)，而在幼年時(shí)期基本不表達(dá)。在非洲蟾蜍單細(xì)胞時(shí)期轉(zhuǎn)染人工合成的miR-1會(huì)引起胚胎異常發(fā)育和心臟形成受阻；過表達(dá)miR-133會(huì)影響非洲蟾蜍正常發(fā)育，但是其影響程度沒有miR-1過表達(dá)時(shí)嚴(yán)重[31]。這些myomiRs通過作用不同的成肌調(diào)節(jié)因子(myogenic regulatory factors，MRFs)來控制肌肉發(fā)育。配對盒基因7(paired box 7，Pax7)是Pax基因家族的一員，能夠誘導(dǎo)多種干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為生肌細(xì)胞，促進(jìn)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖，同時(shí)抑制肌原細(xì)胞過早分化。miR-1和miR-206可以靶向抑制Pax7，誘導(dǎo)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞由增殖轉(zhuǎn)化為分化狀態(tài)。組蛋白去乙?；?(histone deacetylase 4，HDAC4)是肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2(myocyte enhancer-binding factor 2，MEF2)的轉(zhuǎn)錄抑制因子，miR-1通過靶向抑制HDAC4從而促進(jìn)MEF2表達(dá)，正向調(diào)節(jié)肌細(xì)胞分化[32]。miR-133可以介導(dǎo)血清反應(yīng)因子(serum response factor，SRF)，從而促進(jìn)成肌細(xì)胞的增殖，抑制其分化，而miR-206可通過抑制肌源性轉(zhuǎn)錄因子的抑制劑Id1-3和MyoR的表達(dá)來促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖和分化[33-34]。此外，研究發(fā)現(xiàn)miR-1可以靶向HSP60和HSP70基因，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制蛋白形成，促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡，而miR-133通過抑制靶基因caspase-9的轉(zhuǎn)錄與翻譯過程而抗心肌細(xì)胞凋亡[35]。

隨著研究深入，除了肌肉組織特異性myomiRs功能被進(jìn)一步闡明，一些非肌肉組織特異性miRNA也被發(fā)現(xiàn)對家兔肌肉發(fā)育起關(guān)鍵作用。張翔宇等[36]借助高通量測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)肉兔胚胎期肌肉組織中長度為23 nt的miRNA比例超過17%，長度為22 nt的miRNA比例達(dá)到60%以上，并推測不同禽畜品種及組織間miRNA的作用機(jī)制基本一致。在初生新西蘭白兔肌肉中高度表達(dá)的miRNA比例達(dá)到40%，而在84日齡新西蘭白兔肌肉中有21%的miRNA也處于高表達(dá)狀態(tài)[37]。Liu等[38]發(fā)現(xiàn)，miR-221在84日齡新西蘭白兔肝臟中表達(dá)量最高，在腿肌中中度表達(dá)，并且miR-221在骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化過程中表達(dá)量先急劇升高，之后緩慢下降，miR-221能促進(jìn)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖，抑制骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化。此外，MAPK是參與肌細(xì)胞發(fā)育活動(dòng)的關(guān)鍵信號通路，可以通過MyoD、Myf5和MEF2家族成肌轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)肌細(xì)胞的增殖與分化[39]。劉卜瑋等[40]研究表明，miR-222可能通過這些重要信號通路而促進(jìn)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖。

3 miRNA在家兔脂肪中的研究

在兔肉產(chǎn)品生產(chǎn)過程中，瘦肉率和肉質(zhì)風(fēng)味都與家兔體內(nèi)的脂肪含量有很大的關(guān)系[41]。因此，了解和掌握家兔脂肪的沉積和脂肪細(xì)胞的代謝調(diào)控機(jī)制至關(guān)重要。然而，相關(guān)miRNA在家兔脂肪組織中的研究相對較少。根據(jù)miRNA在物種間具有較高保守性，并且調(diào)控功能大多相似，因此其他脊椎動(dòng)物中miRNA與脂肪代謝相關(guān)研究極具參考性。

磷酸酶張力蛋白同系物(phosphatase and tensin homolog,PTEN)、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白家族(CCAAT/enhancer binding protein family,C/EBPs)、過氧化物酶體增殖物活化受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor-gamma,PPARγ)等轉(zhuǎn)錄因子是脂肪細(xì)胞分化過程中最重要的調(diào)控因子，許多脂肪相關(guān)miRNA都能與這些調(diào)控因子互作來調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化。let-7是最早發(fā)現(xiàn)在物種間高度保守的miRNA。let-7可以通過靶向調(diào)節(jié)HMGA2基因的表達(dá)而控制脂肪細(xì)胞由克隆擴(kuò)增到終末分化的分化過程[42]。miR-146b是脂肪發(fā)育過程中高表達(dá)的miRNA，可以與KLF7基因結(jié)合抑制前體脂肪細(xì)胞增殖，而有效促進(jìn)其分化[43]。miR-24通過正向調(diào)節(jié)BMP-2基因的表達(dá)從而促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化[44]。miR-27家族在脂肪分化過程中表達(dá)下調(diào)，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR-27能夠通過阻斷PPARγ和C/EBPα基因的表達(dá)，從而抑制脂肪細(xì)胞的分化[45]。何洪炳等[46]研究發(fā)現(xiàn)，miR-130b在家兔前體脂肪細(xì)胞分化過程中差異表達(dá)。過表達(dá)miR-130b后，脂肪細(xì)胞分化減慢；抑制表達(dá)miR-130b后，脂肪細(xì)胞分化加快。作者借助生物信息技術(shù)預(yù)測miR-130b的靶基因?yàn)镻PARγ基因，并進(jìn)一步證實(shí)miR-130b靶向PPARγ基因抑制家兔前體脂肪細(xì)胞分化。He等[47]還發(fā)現(xiàn)，miR-148a-3p在白色脂肪組織生長早期、體外培養(yǎng)的前脂肪細(xì)胞分化過程中表達(dá)升高，且過表達(dá)miR-148a-3p會(huì)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的沉積，miR-148a-3p直接靶向PTEN基因的3′-UTR區(qū)域，參與調(diào)控家兔前脂肪細(xì)胞分化。

4 miRNA在家兔疾病中的研究

家兔被廣泛作為實(shí)驗(yàn)材料，在醫(yī)學(xué)、科學(xué)研究領(lǐng)域里做出了重大貢獻(xiàn)。研究miRNA在家兔模型中的調(diào)節(jié)機(jī)理，對人類疾病臨床診斷和治療提供了新的方向和線索。細(xì)胞自主程序性死亡是一個(gè)由多種信號途徑參與的復(fù)雜過程。據(jù)報(bào)道，miR-101可以與靶基因SOX9的mRNA 3′-UTR互補(bǔ)配對來抑制SOX9蛋白質(zhì)表達(dá)，進(jìn)一步加快細(xì)胞凋亡[48]。miR-155是第一個(gè)發(fā)現(xiàn)與炎癥相關(guān)的miRNA，能通過toll樣受體(toll-like receptors，TLR)配體、炎性細(xì)胞因子和特異性抗原在多個(gè)免疫細(xì)胞譜系中有效上調(diào)[49-50]。隨著近年來科學(xué)家的不斷探索，越來越多的miRNA被證明參與機(jī)體炎癥反應(yīng)的調(diào)控。miR-25具有多種功能，可影響炎癥介質(zhì)的表達(dá)。在兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中，WFA可以上調(diào)miR-25的表達(dá)，繼而增加環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)的表達(dá)，引起炎癥疾??；沉默miR-25后，COX-2表達(dá)降低，揭示miR-25可以影響WFA介導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)[51]。Zhang等[52]發(fā)現(xiàn)，miR-27a mimic轉(zhuǎn)染細(xì)胞后可明顯降低炎癥因子IL-6的表達(dá)，基質(zhì)金屬蛋白酶13(matrix metalloprotein 13，MMP13)和核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)蛋白表達(dá)水平顯著降低，同時(shí)miR-27a可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖。以上結(jié)果表明，miR-27a的上調(diào)可通過NF-κB通路有利于骨關(guān)節(jié)炎癥的治療。其他研究還發(fā)現(xiàn)，miR-9通過下調(diào)Notch和Bax的表達(dá)而激活Bcl-2，最終促進(jìn)軟骨細(xì)胞的分化和再生，還通過介導(dǎo)CII表達(dá)促進(jìn)家兔炎癥軟骨細(xì)胞再生[53]。

miR-145過表達(dá)可以改變血管平滑肌細(xì)胞(smooth muscle cells，VSMCs)的活性，使其從增殖狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槭湛s狀態(tài)。Nishio等[54]使用miR-145負(fù)載的聚乳酸-糖基乙酸納米顆粒(PLGA NPs)構(gòu)建一個(gè)簡單的體外microRNA傳遞系統(tǒng)，PLGA NPs局部和持續(xù)釋放miR-145可使VSMCs處于收縮狀態(tài)，從而減輕兔內(nèi)膜增生。He等[55]發(fā)現(xiàn)Smad7下調(diào)會(huì)促進(jìn)心房纖維化，轉(zhuǎn)染miR-21 inhibitor可顯著增加Smad7的表達(dá)，并通過雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證其靶標(biāo)關(guān)系，表明miR-21在心房纖維化中起正向調(diào)節(jié)作用。阿爾茨海默病(alzheimer disease，AD)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。Liu等[56]應(yīng)用Taq-Man qRT-PCR分析的微陣列技術(shù)發(fā)現(xiàn)AD疾病家兔模型中miR-125b、miR-98、miR-107、miR-30，以及l(fā)et-7家族3個(gè)成員的變化與人類AD樣本相似，同時(shí)證實(shí)了miR-26b受瘦素調(diào)控，瘦素和miR-26b可能參與了膽固醇誘導(dǎo)的AD。Wu等[57]研究表明，miR-92a與KLF2在家兔顱內(nèi)動(dòng)脈瘤模型中表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，miR-92a可以通過KLF2 mRNA 3′-UTR區(qū)域的互補(bǔ)序列直接靶向調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞中的KLF2的表達(dá)。

5 展望

miRNA作為一種重要的表觀遺傳物質(zhì)，是當(dāng)今分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)和前沿。miRNA廣泛參與細(xì)胞增殖分化、炎癥調(diào)控、脂肪代謝和疾病發(fā)生等生理過程，在家兔中發(fā)揮著重要的基因調(diào)節(jié)功能。隨著科學(xué)技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展，越來越多的miRNA在家兔中被發(fā)現(xiàn)，其功能也將被驗(yàn)證。但是，目前對miRNA的研究大多處于初級功能驗(yàn)證階段，尚有許多調(diào)節(jié)機(jī)制以及復(fù)雜調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)有待進(jìn)一步探索，仍需要進(jìn)行大量的基礎(chǔ)研究，以期獲得更有價(jià)值的突破，為進(jìn)一步研究家兔遺傳育種的分子調(diào)控機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)，為人類疾病診斷與臨床治療提供新方向。