張馨月，李友發(fā)，劉江寧，富昊偉

(嘉興市農業(yè)科學研究院，浙江 嘉興 314016)

秈稻(OryzasativaL. ssp.indica)和粳稻(OryzasativaL. ssp.japonica)是栽培稻(OryzasativaL.)的兩個亞種，且亞種間雜種具有很強的雜種優(yōu)勢。但長期以來，秈粳亞種間雜種中存在的育性障礙導致雜種結實率很低，限制了雜種優(yōu)勢的利用。IKehashi等[1-2]首次提出廣親和理論，認為廣親和性基因與秈粳稻的雜種不育基因互為復等位基因，遺傳符合單位點孢子體-配子體互作模式，并將廣親和基因定位。楊杰等[3]根據水稻復等位基因S5-n、S5-i和S5-j的DNA序列的差異設計了功能標記S5136，對有廣親和基因S5-n的品種DNA，能夠擴增出441 bp的片段，而沒有S5-n的品種DNA擴增出577 bp片段，能快速有效地檢測廣親和基因的存在(純合、雜合均有標準性條帶)，可以快速高效地區(qū)分雜種一代和不育系，從而達到純度鑒定的目的，為分子標記輔助選擇育種和資源篩選鑒定提供了便利。

浙江省秈粳亞種雜交稻選育的配組方式，是將廣親和基因導入純秈型恢復系，然后與不帶廣親和基因的純粳不育系配組。該配組方式應用廣泛，寧波市農業(yè)科學研究院的“甬優(yōu)”組合為代表，浙江省農業(yè)科學院的“浙優(yōu)”系列、浙江大學的“江兩優(yōu)”系列、嘉興市農業(yè)科學研究院的“嘉優(yōu)中科”系列均采用此種配組方式。據不完全統(tǒng)計，2018年此類“粳不育系/廣親和恢復系”配成組合的推廣面積已達15萬hm2以上。這種配組方式雜種一代的基因型是S5-j/S5-n，不育系的基因型是S5-j/S5-j。我們育種過程中安排生產長粳1A和6個恢復系的制種時，在制種田實地觀察到長粳1A在田間有散粉現象，為驗證F1后代是否存在純度問題，以及比較廣親和基因分子標記在“粳不育系/廣親和恢復系”配成組合雜交種中的鑒定效果。種子收獲后我們同時進行廣親和基因分子標記和大田統(tǒng)計鑒定純度，并將兩種鑒定效果進行比較分析。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗所用種子為2018年夏秋季在浙江制種收獲的長粳1A和6個恢復系雜交所得的雜交種。不育系為“三系”BT胞質的粳稻不育系，恢復系均為嘉興市農業(yè)科學研究院和浙江大學團隊選育的帶廣親和基因的秈型恢復系。試驗雜交水稻F1共6個，分別依次編號為鑒1、鑒2、鑒3、鑒4、鑒5、鑒6。

1.2 試驗設計

大田試驗安排在海南陵水進行。取各組合種子20 g，正常浸種催芽后，于12月5日播種，12月30日移栽。

1.3 測定內容與方法

1.3.1 大田水稻組合純度鑒定

各組合于2月20日左右齊穗。我們于3月5日對雜株總數及各類型雜株的數量進行調查。

純度(%)=(種植總株數-雜株總數)/種植總株數×100%。

1.3.2 分子標記純度鑒定

將供試種子在50 ℃熱水中浸泡36 h，然后置于紙床上放在28 ℃光照條件下培養(yǎng)，生長7 d(葉片長度約5 cm)剪取葉片備用。

等位基因特異PCR引物設計：廣親和基因功能基序(function motif)已經非常明確。S5-n與S5-i和S5-j的序列差異是在翻譯起始點即ATG上游缺失69 bp，下游缺失67 bp，導致基因功能喪失，不能與S5-i和S5-j互作，雜種胚囊發(fā)育正常。根據其缺失位置兩側序列，利用軟件Primer Premier 5設計引物序列，S5136-For為5′-ATCAACCCATTTCCTTTCCT-3′，S5136-Rev為5′-ATACGCTCGATCGGATTAAC-3′。引物由Invitrogen中國公司合成。

水稻基因組DNA快速提取，PCR擴增、電泳及結果記錄參照趙國珍等[4]的方法，具體步驟為：剪取約0.5 cm長的葉片，置96孔PCR板中，每孔加入70 μL溶液A(包含100 mmol·L-1NaOH和2% Tween 20，現配現用)；將96孔板在-70 ℃冰柜中冷凍10 min，轉至PCR儀上95 ℃加熱10 min；每孔加70 μL緩沖液B(包含100 mmol·L-1Tris-HCl和2 mmol·L-1EDTA)，充分混勻后1 500 r·min-1離心1 min，取上清液用于PCR。采用超微量分光光度計Nano-Drop 2000(Thermo Scientific， 美國)測定DNA的濃度及質量。PCR擴增以總DNA為模板，PCR反應體系(15 μL)，上、下游引物各1.0 μL，10×PCR buffer 1.7 μL(含Mg2+)，TaqDNA聚合酶0.2 μL，2.5 mmol·L-1的dNTP 0.2 μL，ddH2O 7.9 μL，模板3 μL。PCR反應程序：預變性94 ℃ 5 min；變性94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，退火72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；延伸72 ℃ 10 min。PCR產物在含有溴化乙錠(EB)的1.0%瓊脂糖凝膠中110 V電泳30 min，放入凝膠成像系統(tǒng)拍照。分子標記雜合條帶為真實F1代雜交種，單條帶的為雜株，空白條帶為無效擴增結果，其中計算純度時需減去空白的條帶數。即：純度(%)=雜合條帶/(擴增條帶總數-空白條帶)×100。

2 結果與分析

2.1 大田統(tǒng)計鑒定“粳不育系/廣親和恢復系”水稻配組F1代雜交種純度

6個組合純度的田間統(tǒng)計鑒定結果見表1。不育系、保持系、異形株的判定均根據農藝特性由經驗判定。

2.2 分子標記鑒定“粳不育系/廣親和恢復系”水稻配組F1代雜交種純度

圖1是各F1代純度分子標記鑒定的凝膠電泳圖像。雜合條帶為真實F1，單條帶為雜株，空白條帶為無效擴增結果，計算純度時應排除。對比表1和表2純度結果，除鑒6分子標記鑒定較大田統(tǒng)計鑒定的純度低13.4百分點外，其他F1代的分子標記鑒定結果均高于大田統(tǒng)計鑒定結果。

雜株總株數=不育系+保持系+異形株。
The number of false-hybrid = The number of male-sterile line + The number of maintainer line + The number of plant with different agronomic traits.

3 討論

廣親和基因S5-n的功能標記檢測可快速測種子純度[5-6]。但廣親和基因分子標記檢測種子純度也存在一些局限，如該方法僅能檢測特定的秈粳交組合，即只有父本或母本一方有廣親和基因的配組方式，此種方式的F1代種子的擴增條帶結果表現為：雜合條帶為真實F1，而單條帶為自交不育系。當父母本均具有廣親和基因或父母本均不具有廣親和基因的配組方式時，廣親和基因S5-n的功能標記進行檢測純度的方法失效，因為該兩類配組方式的F1代種子、自交不育系的擴增條帶結果均為單條帶，不能達到有效區(qū)分真實F1和自交不育系的目的。廣親和基因S5-n的功能標記分子標記檢測能精確區(qū)分的假雜種主要是：自交不育系、混雜的保持系、制種中田間自生苗(不具有廣親和基因)及收獲環(huán)節(jié)的混雜種子(不具有廣親和基因)。此外，本試驗發(fā)現，分子標記檢測的種子純度較田間經驗檢測的純度高1.0～2.0百分點，這可能是如下原因所致：不育系不具有廣親和基因，這6個試驗組合是嘉興市農業(yè)科學研究院試驗基地采用薄膜隔離的小制種，制種區(qū)外存在較多的廣親和恢復系，較易發(fā)生由于周圍廣親和恢復系串粉導致的F1代雜交種，這種F1代雜交種農藝特性與真實F1表現不一致，為異形株，大田鑒定將其列為雜株，但廣親和基因S5-n的功能標記檢測該F1代雜交種時卻表現為雙條帶，不能與真實F1進行準確地區(qū)分，因此導致分子標記鑒定結果高于大田統(tǒng)計結果。除此之外，若一個配組中不育系具有廣親和基因，那么大田容易出現由于非廣親和恢復系串粉而導致的F1代雜交種，也會導致廣親和基因S5-n的功能標記檢測的結果偏高。目前這兩種配組的F1代雜交種在實際生產實踐中還需要采用傳統(tǒng)的大田種植條件下通過觀察植株的大田農藝性狀來鑒定。因此，在實際應用廣親和基因S5-n的功能標記檢測雜交種純度時可考慮對結果稍加修正。未來還需要進一步優(yōu)化廣親和基因分子檢測技術的特異性，進一步提高分子檢測的準確性，這將對雜交稻的安全生產具有重要的實踐意義。