龍海梅，張楠卿， 李宗艷，*，王 琴，付 超

(1.西南林業(yè)大學(xué) 國(guó)家林業(yè)和草原局西南風(fēng)景園林工程中心，云南 昆明 650224; 2.西南林業(yè)大學(xué) 功能花卉研究中心，云南 昆明 650224)

染色體數(shù)目和核型在物種系統(tǒng)分類、起源與鑒定、親緣關(guān)系分析等方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值，高質(zhì)量的染色體制片是進(jìn)行核型分析和原位雜交的保障[1]。染色體制片技術(shù)主要有壓片法、涂片法和滴片法等。壓片法對(duì)去壁要求較低且材料不易丟失，該法適用于大量材料的倍性鑒定、染色體計(jì)數(shù)、初步的染色體形態(tài)觀察[2-3]。菊科植物體細(xì)胞小、細(xì)胞質(zhì)較濃，染色體數(shù)目多，多數(shù)栽培菊花染色體數(shù)為54～71。由于菊屬植物種間遠(yuǎn)緣雜交較易成功，導(dǎo)致染色體倍性復(fù)雜，有二倍體、四倍體、六倍體等[4]，因而，菊科植物染色體制片難度較大。圍繞菊科植物起源與品種演化的問(wèn)題，目前的研究主要從野生種質(zhì)材料的染色體結(jié)構(gòu)、數(shù)量、核型帶型的角度，開(kāi)展了菊屬植物染色體倍性、形成演化、分類和種間親緣關(guān)系等研究[5-7]。園林園藝生產(chǎn)中應(yīng)用的菊科植物豐富，廣泛地應(yīng)用于花壇、花境、盆花、切花等。目前僅對(duì)百日草(Zinniaelegans)、蛇目菊(Sanvitaliaprocumbens)、向日葵(Helianthumannuals)、孔雀草(Tagetespatula)等少數(shù)植物的染色體制片技術(shù)進(jìn)行過(guò)探索[8-11]，尚未見(jiàn)有關(guān)金盞菊染色體制備技術(shù)相關(guān)的報(bào)道。菊科栽培植物起源較復(fù)雜，染色體組信息對(duì)揭示其起源具有重要意義。本研究以我國(guó)園林中廣泛引種栽培的2年生草本植物金盞菊(Calendulaofficinalis)為材料，探索菊科植物根尖染色體壓片制片的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和其染色體數(shù)目，為其染色體制片技術(shù)和核型分析提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

供實(shí)驗(yàn)用的金盞菊種子由云南碧青園藝有限公司提供。將種子用2 g·L-1高錳酸鉀溶液浸泡20 min，用清水洗凈后播種于墊有濾紙的培養(yǎng)皿中，置于22 ℃光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行催芽。

1.2 方法

1.2.1 取材與有絲分裂活動(dòng)

分別從08：00至11：30和14：00至17:00，每隔30 min取樣，用對(duì)二氯苯飽和溶液、500 mg·L-1秋水仙素和0.004 mol·L-18-羥基喹啉溶液處理根尖，尋找有絲分裂活動(dòng)旺盛的時(shí)段；在根尖長(zhǎng)至0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 cm時(shí)取頂端幼嫩部分根，用0.004 mol·L-18-羥基喹啉溶液處理。從10個(gè)不同植株上取樣，每個(gè)樣本取3次。所有材料在6 ℃預(yù)處理6 h，清洗后用福爾馬林-乙醇-醋酸(FAA)固定。

1.2.2 試劑預(yù)處理

選用對(duì)二氯苯飽和溶液、500 mg·L-1秋水仙素、0.004 mol·L-18-羥基喹啉預(yù)處理根尖，置于6 ℃恒溫箱中，分別處理4、6、8、10、12、14 h。比較試劑種類與處理時(shí)間對(duì)有絲分裂中期相染色體固定效果的影響。

將固定材料用清水清洗3次后，放入1 mol·L-1的鹽酸中，于60 ℃水浴處理9～10 min，清洗根尖并將其搗碎，加入卡寶品紅試劑染色8～12 min，進(jìn)行壓片。在生物攝像顯微鏡下鏡檢計(jì)數(shù)和拍照，3次重復(fù)。觀察30個(gè)清晰可辨的分裂相細(xì)胞。

1.3 制片效果評(píng)價(jià)與核型分析

在Olympus生物顯微鏡10倍鏡下進(jìn)行初步鏡檢，有絲分裂活動(dòng)能力以分裂相比例作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以1個(gè)視野中有絲分裂相細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)比例≥4/5為分裂相極多，比例在3/5≤～4/5為分裂相多，2/5≤～3/5為分裂相較多，1/5≤～2/5為分裂相較少，<1/5為少，<1/10為極少。染色體形態(tài)評(píng)價(jià)指標(biāo)為染色體分散性好，收縮適中，形態(tài)良好，著絲粒清晰可見(jiàn)，細(xì)胞背景干凈。

染色體計(jì)數(shù)方法如下：從每個(gè)處理中選出中期相細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，共計(jì)30個(gè)細(xì)胞，且有80%以上的細(xì)胞具有相同數(shù)量的染色體。在40倍鏡下對(duì)圖像比較清晰、染色體相對(duì)分散、收縮比較好的分裂相拍照，測(cè)量染色體的短臂、長(zhǎng)臂，計(jì)算相對(duì)長(zhǎng)度和染色體相對(duì)長(zhǎng)度系數(shù)，統(tǒng)計(jì)染色體臂比、相對(duì)長(zhǎng)度系數(shù)，然后依據(jù)著絲點(diǎn)位置和形態(tài)進(jìn)行同源染色體配對(duì)，并繪制染色體核型模式圖。計(jì)算公式[11]：相對(duì)長(zhǎng)度=(染色體長(zhǎng)度/染色體組總長(zhǎng)度)×100；染色體相對(duì)長(zhǎng)度系數(shù)=染色體長(zhǎng)/全組染色體平均長(zhǎng)度。

染色體命名使用Levan法則[12]，分為正中部著絲點(diǎn)(M)、中部著絲點(diǎn)(m)、近中部著絲點(diǎn)(sm)、端部著絲點(diǎn)(t)、近端部著絲點(diǎn)(st)類型。按李懋學(xué)等[13]的核型標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析，核型不對(duì)稱性按照Stebbins[14]的分類標(biāo)準(zhǔn)，依據(jù)最長(zhǎng)與最短染色體比值和臂比值占有比例劃分類型。核型不對(duì)稱系數(shù)=染色體長(zhǎng)臂總長(zhǎng)/全組染色體總長(zhǎng)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 取材時(shí)間對(duì)染色體制片的影響

方差分析結(jié)果表明，有絲分裂中期相的細(xì)胞數(shù)量差異顯著，上午08：30—09：30取材效果較好，能獲得較多的處于有絲分裂中期相細(xì)胞，可固定的有絲分裂中期相的細(xì)胞數(shù)約3.3～9.0個(gè)(表1)。在相同時(shí)段，不同試劑的預(yù)處理效果有差異。上午08：30—09：30，0.004 mol·L-18-羥基喹啉溶液處理效果優(yōu)于對(duì)二氯苯處理，固定的有絲分裂中期相的細(xì)胞數(shù)為7.3～9.0，500 mg·L-1秋水仙素處理僅能固定3.3～5.0個(gè)中期相細(xì)胞?？傮w來(lái)說(shuō)，金盞菊細(xì)胞在上午08：30—09：30有絲分裂活動(dòng)旺盛。

2.2 根長(zhǎng)對(duì)制片效果的影響

在有絲分裂旺盛期取材，統(tǒng)計(jì)不同根長(zhǎng)的金盞菊有絲分裂細(xì)胞比例，結(jié)果(表2)表明，在根長(zhǎng)為1.0～1.5 cm時(shí)取材，能固定獲得較多的有絲分裂中期相細(xì)胞，細(xì)胞大小和細(xì)胞成熟度適宜，后期解離和壓片效果較好。但隨著根的不斷生長(zhǎng)，根長(zhǎng)超過(guò)1.5 cm后，雖然可以得到一定數(shù)量的有絲分裂中期相細(xì)胞，但由于根尖細(xì)胞成熟度的增加，細(xì)胞壁較厚，對(duì)固定、后期細(xì)胞解離和壓片過(guò)程有一定影響，染色體較難分離在同一平面上。根長(zhǎng)超過(guò)2.5 cm，固定的有絲分裂中期相細(xì)胞少，且根毛發(fā)育旺盛，影響制片效果。根長(zhǎng)為0.5 cm時(shí)，根尖細(xì)胞排列緊密，有較多的有絲分裂的細(xì)胞，但細(xì)胞太小，染色體難分開(kāi)，制片效果亦不理想。

2.3 預(yù)處理試劑與處理時(shí)間對(duì)染色體制片的影響

由圖1可知：對(duì)二氯苯飽和溶液處理金盞菊6 h，染色體形態(tài)較清晰，濃縮程度適宜，易于觀察著絲點(diǎn)。從染色體形態(tài)結(jié)構(gòu)的清晰度考慮，采用500 mg·L-1秋水仙素處理效果最差，因?yàn)榻鸨K菊染色體較長(zhǎng)，濃縮程度不足，較難顯示染色體著絲點(diǎn)的位置。對(duì)不同預(yù)處理時(shí)間的效果進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，0.004 mol·L-18-羥基喹啉處理8 h，可獲得濃縮程度良好、清晰度較高的染色體。總體來(lái)說(shuō)，使用對(duì)二氯苯飽和溶液處理6 h可達(dá)到較好的效果。

表1 不同時(shí)段取材對(duì)金盞菊有絲分裂活動(dòng)的影響Table 1 Effects of sampling time on mitotic activity of Calendula officinalis

A為飽和對(duì)二氯苯；B為500 mg· L-1秋水仙素；C為0.004 mol·L-18-羥基喹啉溶液。同行數(shù)據(jù)后無(wú)相同字母表示在0.05水平差異顯著。
A represented the treatment of saturated solution of P-dichlorobenzene; B represented the treatment of 500 mg·L-1colchicine; C represented the treatment of 0.004 mol·L-18-Hydroxyquinoline. Data marked without the same lowercase letter in each row indicated significant differences atP<0.05.

表2 根長(zhǎng)對(duì)有絲分裂相細(xì)胞比例和染色體制片的影響Table 2 Effects of root length on percentage of mitotic cells and chromosome technique

A，對(duì)二氯苯飽和溶液處理金盞菊6 h(×400)；B，500 mg·L-1秋水仙素處理金盞菊6 h(×400)；C，0.004 mol·L-1 8-羥基喹啉溶液處理8 h(×400)。A， Chromosomes treated by saturated solution of p-dichlorobenzene for 6 h (×400) ; B， Chromosomes treated by 500 mg·L-1 colchicine for 6 h (×400); C， Chromosomes treated by 0.004 mol·L-1 8-hydroxyquinoline for 8 h (×400)圖1 不同預(yù)處理?xiàng)l件下金盞菊的染色體制片效果Fig.1 Effect of different pretreatments on chromosome morphology of Calendula officinalis

2.4 染色體數(shù)目和核型分析

隨機(jī)選取形態(tài)清晰、分散良好的染色體圖像拍照，從中選擇5個(gè)測(cè)量金盞菊根尖細(xì)胞染色體的相關(guān)參數(shù)，分析染色體數(shù)量、著絲點(diǎn)類型，結(jié)果見(jiàn)表3。依據(jù)染色體形態(tài)、長(zhǎng)度和著絲點(diǎn)進(jìn)行同源染色體配對(duì)，金盞菊體細(xì)胞染色體數(shù)目為39～46，其中28條正常染色體，染色體相對(duì)長(zhǎng)度為5.93%～8.46%(圖2)，相對(duì)長(zhǎng)度系數(shù)為0.83～1.18；臂比最大為2.34，位于第8號(hào)染色體，臂比最小為1.01，位于第10號(hào)染色體。中部著絲點(diǎn)染色體數(shù)目為9對(duì)18條，近中部著絲點(diǎn)染色體數(shù)目為5對(duì)10條。金盞菊體細(xì)胞中有多達(dá)18條染色體的長(zhǎng)度不到最小常染色體的1/2，屬于B染色體，按形態(tài)分有短棒狀和點(diǎn)狀2種類型。其中，短棒狀B染色體數(shù)量較多，在觀察的細(xì)胞中有多達(dá)18條；點(diǎn)狀染色體一般為1～3條。金盞菊最長(zhǎng)常染色體與最短B染色體比值為4.05。臂比值大于2的常染色體在染色體組的比例為14.29%。依據(jù)Stebbins標(biāo)準(zhǔn)，金盞菊核型為2B類型，其核型公式2n=18m+10sm，核型不對(duì)稱系數(shù)為60.24%(圖2)。

表3 金盞菊根尖細(xì)胞染色體參數(shù)Table 3 Parameters of tip cells chromosome of Calendula officinalis

m，中部著絲點(diǎn)；sm，近中部著絲點(diǎn)。
m， Median region; sm， Submedian region.

圖2 金盞菊染色體核型模式圖Fig.2 Chromosome karyotype of Calendula officinalis

3 討論

染色體的細(xì)胞制片技術(shù)研究主要集中于細(xì)胞有絲分裂旺盛期確定、有效材料選擇、預(yù)處理試劑和方法等，從不同角度探討對(duì)制片效果的影響。百日草、萬(wàn)壽菊(Tageteserecta)的根尖在上午08:00—09:00，花藥在上午09:00—10:00取材，染色體制片效果較佳[15-16]；在材料的成熟度方面，孔雀草根尖長(zhǎng)約0.5 cm時(shí)，滁菊根尖長(zhǎng)度為1 cm左右，均可獲得較好的中期固定相和解離效果[10，17]。在預(yù)處理試劑種類和濃度的選擇上，百日草、孔雀草以飽和對(duì)二氯苯溶液或0.002 mol·L-1的8-羥基喹啉液預(yù)處理4～8 h效果較好；風(fēng)毛菊屬(Saussurea)、帚菊屬(Pertya)、針苞菊屬(Tricholepis)植物和甜菜(Betavulgarisvar. cicla)較佳的預(yù)處理試劑為0.002 mol·L-18-羥基喹啉；使用0.002 mol·L-18-羥基喹啉和0.1 mol·L-1秋水仙素混合處理滁菊效果較好，采用飽和對(duì)二氯苯處理栽培菊效果也較佳[6，10，15，17-19]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，金盞菊在早上08：30—09：30、根長(zhǎng)為1.0～1.5 cm時(shí)取材，采用飽和對(duì)二氯苯處理，染色體制片效果較佳。

栽培菊花品種大多為六倍體至八倍體或非整倍體，染色體數(shù)目變幅極大，從2n=36、45、51～75+B到85，以2n=54為分布高峰。李懋學(xué)等[4]對(duì)我國(guó)21個(gè)菊花栽培品種進(jìn)行染色體觀察發(fā)現(xiàn)，栽培菊花從小菊、中菊到大菊品種，染色體數(shù)目與花徑存在一定正相關(guān)。日本野生菊有染色體基數(shù)為9的二倍體、四倍體、六倍體、八倍體、十倍體，以及少數(shù)異數(shù)體[20]。全球矢車(chē)菊屬(Centaurea)植物包括500～600個(gè)自然種，染色體基數(shù)為7～16，已發(fā)現(xiàn)有二倍體、三倍體、四倍體和六倍體，二倍體染色體數(shù)目從16至66不等[21]。Fedorov[22]統(tǒng)計(jì)了93種廣義菊屬植物的染色體數(shù)目，發(fā)現(xiàn)多倍體(包括種內(nèi)多倍體)有56種，占60%，多倍化顯然是該屬植物的一個(gè)重要的進(jìn)化途徑。其他常見(jiàn)的菊科栽培植物的染色體數(shù)目不多，萬(wàn)壽菊2n=24，向日葵2n=34，蛇目菊2n=24，大花金雞菊(Coreopsisgrandflora)2n=26，孔雀草2n=4x=48，栽培雛菊(Bellisperennis)品種2n=18。除孔雀草為四倍體外，向日葵倍性不詳，其他都為二倍體，雛菊染色體類型為M和m，其他種的染色體類型有m和sm型，所有種的核型屬于1B或2B，這些栽培植物的染色體形態(tài)均正常[8-11，15，23]。本次研究的金盞菊染色體數(shù)目為39～46，常染色體數(shù)目為28，首次發(fā)現(xiàn)染色體組中除了正常染色體外，還有11～18條B染色體，且B染色體的類型多樣，呈短棒狀的且有著絲點(diǎn)的B染色體數(shù)量不穩(wěn)定，呈點(diǎn)狀無(wú)明顯著絲點(diǎn)的B染色體一般為1～3條。

B染色體在生物界廣泛分布，大小約為最小常染色體的一半，其存在對(duì)物種的意義一直是學(xué)術(shù)界爭(zhēng)論的問(wèn)題。一般研究認(rèn)為，B染色體的存在對(duì)物種的影響通常表現(xiàn)為中性，在特定環(huán)境中B染色體出現(xiàn)頻率的增加能顯著提高個(gè)體的適應(yīng)性[24-25]。在有選擇壓力的環(huán)境中，具有B染色體的黑麥草屬(Lolium)植物個(gè)體常表現(xiàn)出更強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)力和適應(yīng)能力[26]。大部分生物體的B染色體數(shù)量往往不穩(wěn)定，如菊屬植物廣泛存在B染色體，但在栽培品種中出現(xiàn)B染色體的概率要高于野生種。B染色體在不同類型菊花品種中出現(xiàn)的概率約為10.9%，非整倍體出現(xiàn)的概率高于整倍體，絕大多數(shù)品種有1條B染色體，少數(shù)有2條[7]。中甸風(fēng)毛菊(Saussureadschungdienensis)有1條B染色體[18]?；⒀廴f(wàn)年青(Ornithogalumcaudatum)的常染色體有18條，B染色體的數(shù)量變異較大，有22～28條，超出常染色體數(shù)量[27]。玉米(Zeamays)地方品種B染色體的數(shù)量為0～2[28]。在玉米地方品種研究中發(fā)現(xiàn)，短桿狀B染色體有明顯的著絲粒和姐妹染色單體，能進(jìn)行正常的有絲分裂，而點(diǎn)狀的B染色體呈高度染色質(zhì)化，無(wú)明顯的著絲粒和姐妹染色單體，不能進(jìn)行正常的有絲分裂，造成在不同細(xì)胞中數(shù)量不同[29]。目前尚無(wú)這2類B染色體存在的生物學(xué)意義的相關(guān)研究。本研究中金盞菊常染色體數(shù)量為28，B染色體數(shù)量為18條，在當(dāng)前栽培的菊科植物中，是發(fā)現(xiàn)B染色體數(shù)量最多的種，尚不清楚B染色體數(shù)量與其抗性和適應(yīng)性變異有無(wú)相關(guān)性。