王書琦 綜述 武衛(wèi)東 審校

急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)一直是世界范圍內(nèi)嚴(yán)重危害健康的疾病,也是臨床研究的焦點(diǎn)。近年來,AKI的發(fā)病率和病死率呈上升趨勢[1]。AKI增加了慢性腎臟疾病( kidney disease,KD)、心血管疾病和終末期腎臟病(end stage renal disease, ESRD)的潛在風(fēng)險[2]。AKI的治療方法主要包括糾正電解質(zhì)紊亂、避免腎毒性藥物和腎臟替代治療[3]。然而,AKI發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制尚不清楚。目前還沒有有效的治療方法來預(yù)防AKI的發(fā)生。因此,有必要深入研究AKI的具體發(fā)病機(jī)制,為臨床治療開發(fā)新的治療方法。

細(xì)胞死亡是每一個細(xì)胞的終點(diǎn),是無法逆轉(zhuǎn)的功能終結(jié),研究認(rèn)為,細(xì)胞凋亡是急性腎損傷(AKI)和腎移植中大多數(shù)死亡細(xì)胞的罪魁禍?zhǔn)譡4]。在多細(xì)胞生物體中,程序性細(xì)胞死亡在調(diào)節(jié)個體細(xì)胞發(fā)育和成體生活中起著重要作用。已發(fā)現(xiàn)多種機(jī)制的程序性細(xì)胞死亡以不同方式發(fā)揮作用。細(xì)胞凋亡是由半胱氨酸蛋白酶(caspase)介導(dǎo)的一種程序性細(xì)胞死亡。如果細(xì)胞凋亡是AKI的驅(qū)動機(jī)制,caspase的藥物抑制將防止腎小管細(xì)胞死亡,但這一點(diǎn)尚未得到驗(yàn)證。細(xì)胞凋亡的干預(yù)對AKI的預(yù)后并無改善,因此,在過去的十年里,人們提出了其他細(xì)胞死亡途徑?，F(xiàn)有研究表明,壞死性凋亡與鐵死亡等都參與AKI的發(fā)生和發(fā)展[5]。本文對壞死性凋亡及鐵死亡途徑在AKI中的作用機(jī)制研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 壞死性凋亡

當(dāng)細(xì)胞受到過多的應(yīng)激,如熱、缺血和感染時通常會發(fā)生壞死。傳統(tǒng)上,壞死被認(rèn)為是被動和無規(guī)則的,與傳統(tǒng)觀念相反,所謂壞死性凋亡,是一種受控制的細(xì)胞死亡形式,形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為細(xì)胞膜穿孔,胞漿腫脹,線粒體功能障礙,核染色質(zhì)缺失,質(zhì)膜發(fā)生破裂,胞內(nèi)內(nèi)容物外溢[6]。由于在細(xì)胞死亡過程中,形態(tài)與壞死極為相似,被稱為壞死性凋亡。壞死性凋亡可被死亡受體的配體激活,并在細(xì)胞凋亡不足的情況下誘導(dǎo)死亡受體配體的表達(dá)。死亡受體配體激活壞死性凋亡需要受體相互作用蛋白1(RIP1)的激酶活性,RIP1介導(dǎo)受體相互作用蛋白3(RIP3)和混合譜系激酶域樣蛋白(mixed lineage kinase domain-like,MLKL)的激活,RIP3和MLKL是壞死性凋亡的2個關(guān)鍵下游介質(zhì)。核黃素是RIP1的小分子抑制劑,其抑制RIP1的作用可以阻止壞死性凋亡的發(fā)生和細(xì)胞的存活。

1.1 壞死性凋亡的傳導(dǎo)通路 過去10年,壞死性凋亡途徑的復(fù)雜機(jī)制細(xì)節(jié)已被闡明[7],腫瘤壞死因子(TNF)家族成員、Toll樣受體激活(TLRs)及其他病原微生物等因素都可能觸發(fā)壞死性凋亡,目前TNF與其受體結(jié)合所介導(dǎo)的激活途徑研究較多。這種死亡通過腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor-1,TNFRI)發(fā)出信號死亡,形成腫瘤壞死因子受體相關(guān)死亡域蛋白(tumor necrosis factor receptor associated death domain protein,TRADD),TRADD 募集受體相互作用蛋白激酶(RIPK),當(dāng)RIPK1被去泛素化酶(cylindromatosis,CYLD)去泛素化,同時TRADD解離,結(jié)合Caspase-8和Fas相關(guān)死亡域蛋白(FADD),若Caspase-8活化,啟動細(xì)胞凋亡。若Caspase-8被抑制,RIPK1募集RIPK3通過磷酸化形成被稱為“壞死小體”的復(fù)合物[8],移位至細(xì)胞膜,導(dǎo)致其破裂,進(jìn)而觸發(fā)凋亡性壞死。因此,Caspase-8似乎既可以作為細(xì)胞凋亡的起始者,也可以作為壞死性凋亡的抑制者。

ESCRT-Ⅲ復(fù)合體是一種膜修復(fù)機(jī)制,通過從細(xì)胞表面萌發(fā)含有磷酸MLKL(PMLKL)的囊泡來對抗壞死性凋亡的執(zhí)行,從而保持質(zhì)膜的完整性。 研究表明,MLKL是唯一已知的壞死性凋亡的下游效應(yīng)因子[9],近年來通過越來越多的證據(jù)表明,PMLKL是執(zhí)行壞死性凋亡所必需的,RIPK3可能不僅可以作為壞死性凋亡的調(diào)節(jié)靶點(diǎn),還可以作為由壞死性凋亡引起的疾病的生物標(biāo)志物。有關(guān)研究表明AKI或敗血癥危重患者血漿中的RIPK3水平與疾病活動呈正相關(guān)[10-11]。

1.2 壞死性凋亡與AKI Linkermann等[12]在缺血/再灌注損傷(ischemia/reperfusion injury,IRI)模型中觀察到RIPK1、RIPK3表達(dá)升高,在RIPK3二聚化后20 min內(nèi)應(yīng)用壞死性凋亡抑制劑necrostatin-1(Nec-1)可以明顯改善腎功能,RIPK1抑制劑如索拉非尼和苯妥英鈉[13],均可通過抑制RIPK1活性而緩解IRI所致的AKI。

順鉑的毒性長期以來一直被認(rèn)為是一種腎毒性和DNA損傷的化合物。最近,由Rob-ERT Safirstein團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn),在最初應(yīng)用順鉑后,腎臟中RIPK3和MLKL蛋白上調(diào),增加了對反復(fù)損傷的敏感性,從而增加了對壞死性凋亡的敏感性。TNFR超家族成員Fas也被證明在離體腎小管中介導(dǎo)順鉑毒性[14]。研究發(fā)現(xiàn)使用Nec-1可以延緩腎小管上皮細(xì)胞的死亡,一定劑量的漢黃芩素可延緩順鉑誘導(dǎo)的AKI。在結(jié)石所導(dǎo)致AKI的樣本中,研究者通過免疫熒光法檢測到了磷酸化的MLKL。當(dāng)晶體引起的壞死最初被認(rèn)為是壞死性凋亡的結(jié)果時,研究者發(fā)現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞中RIPK1 和RIPK3蛋白的表達(dá)可被晶體誘導(dǎo)[15],但尚不清楚多大劑量的葉酸(FA)可能會誘導(dǎo)腎腔內(nèi)的結(jié)晶,而高劑量的FA可能會進(jìn)一步破壞腎小管上皮。在FA-AKI小鼠模型中觀察到高水平的腎臟脂質(zhì)過氧化。給予Fer-1后腎臟的功能和結(jié)構(gòu)較對照組有明顯緩解的趨勢。進(jìn)一步證實(shí),在晶體誘導(dǎo)的AKI過程中,依賴RIPK3的中性粒細(xì)胞胞外陷阱(Nets)的釋放可以成為壞死性凋亡抑制劑的靶點(diǎn)[16]。另有研究發(fā)現(xiàn),依賴RIPK3-MLKL的Nets也促進(jìn)了小鼠和人類ANCA相關(guān)性血管炎(AAV)的發(fā)生[17]。在膿毒癥所致的AKI模型中,通過使用Nec-1可緩解腎小管上皮細(xì)胞的自噬[15]。在慶大霉素誘導(dǎo)的AKI模型中,MLKL表達(dá)升高,提示出現(xiàn)壞死性凋亡?？傊?在多種因素造成AKI的模型中,都可以觀察到有壞死性凋亡發(fā)生,如果可以從上游抑制壞死性凋亡,將是阻止各種疾病導(dǎo)致AKI的重大進(jìn)展,但目前尚無針對壞死性凋亡靶向治療AKI的藥物。

2 鐵死亡

鐵死亡是一種由過度脂質(zhì)過氧化介導(dǎo)的鐵依賴細(xì)胞死亡方式[18],Ferrostatin-1是首個被發(fā)現(xiàn)的鐵死亡抑制劑。谷胱甘肽過氧化物酶4(Gpx4)、FPN1、SLC7A11以及Nrf2等基因已被證明在鐵死亡中發(fā)揮重要作用。然而鐵死亡從基因到蛋白質(zhì)再到細(xì)胞的完整途徑仍不清楚。其特征可以概括為一個中心、兩個特征和四個方面。其中一個中心是指脂質(zhì)活性氧(ROS)的積累;兩個特征是指細(xì)胞抗氧化劑的破壞和細(xì)胞內(nèi)鐵水平的提高,從而導(dǎo)致有害的脂質(zhì)ROS的沉積;四個方面是鐵的代謝紊亂,脂質(zhì)過氧化物的積累,以及Gpx4和System-Xc的消耗(半胱氨酸/谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng))。鐵死亡的特征不同于其他細(xì)胞死亡類型,嗜鐵細(xì)胞的形態(tài)主要表現(xiàn)為線粒體改變,包括體積減小,膜密度增加,線粒體嵴減少,大量鐵離子分布在線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,但細(xì)胞膜保持其完整性,細(xì)胞核大小保持正常[19]。

2.1 鐵死亡機(jī)制與調(diào)控

2.1.1 Gpx4:Gpx4是谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)家族成員,它的主要生物學(xué)作用是保護(hù)生物體免受氧化損傷。Gpx4被發(fā)現(xiàn)在鐵死亡中起關(guān)鍵作用。作為一種高效的還原酶,Gpx4通過谷胱甘肽(GSH)將有毒的過氧化脂質(zhì)(L-OHO)轉(zhuǎn)化為無毒的脂醇(L-OH),從而抑制脂質(zhì)過氧化的擴(kuò)散和過氧化脂質(zhì)的積累[20-21]。此外,細(xì)胞內(nèi)GSH的消耗顯著降低了Gpx4的活性,導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化和細(xì)胞鐵死亡。Gpx4催化脂質(zhì)過氧化還原并間接干擾Fenton反應(yīng)[22],Fenton反應(yīng)是維持細(xì)胞內(nèi)過氧化氫(H2O2)含量的重要因素。高濃度的H2O2會產(chǎn)生ROS,并迅速氧化脂肪酸(FAs)和花生四烯酸(AA)產(chǎn)生脂毒性物質(zhì)。許多研究表明,Gpx4的抗氧化功能是死亡的中心環(huán)節(jié)[23]。因此,影響Gpx4功能和活性可能會顯著影響鐵死亡的發(fā)生。

鐵死亡抑制蛋白1(FSP1),也被稱為凋亡誘導(dǎo)因子線粒體2,通過肉豆蔻酸結(jié)合基序被募集到質(zhì)膜上[24]。它是一種不依賴Gpx4預(yù)防鐵死亡的物質(zhì)。它作為一種氧化還原酶來預(yù)防鐵死亡,產(chǎn)生捕捉自由基的抗氧化劑,從而抵消脂質(zhì)過氧化。然而,目前尚不清楚該系統(tǒng)在多大程度上與腎小管細(xì)胞中的Gpx4系統(tǒng)相關(guān)。

2.1.2 System-Xc途徑:System-Xc是一種廣泛表達(dá)于細(xì)胞膜上的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體,其活性亞基為SLC7A11。Cys通過System-Xc交換進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),促進(jìn)GSH的合成[25]。因此,促進(jìn)System-Xc的功能可抑制鐵死亡。研究顯示,SLC7A11調(diào)節(jié)的半胱氨酸攝取促進(jìn)GSH和Gpx4蛋白的合成,最終抑制鐵死亡[26]。此外,虎杖苷可以劑量依賴性地減輕System-Xc抑制劑誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡[27]。另一項(xiàng)研究表明,下調(diào)連接蛋白43(Cx43)可以通過恢復(fù)SLC7A11水平來抑制鐵死亡,從而減輕順鉑誘導(dǎo)的AKI[28]。一些藥物,如柳氮磺胺吡啶和鐵死亡誘導(dǎo)劑 Erastin可以通過阻斷System Xc- 來誘發(fā)鐵死亡[29]。

2.1.3 鐵代謝、脂質(zhì)過氧化:鐵是人體內(nèi)最重要的微量元素之一,其動態(tài)平衡對細(xì)胞的正常生理功能非常重要[30]。人體內(nèi)吸收和紅細(xì)胞降解產(chǎn)生的鐵離子主要被氧化成Fe3+與轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合,通過Tf受體1(TFR1)形成“Tf-Fe3+-TFR1”的復(fù)合體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),在細(xì)胞內(nèi)的Fe3+進(jìn)一步被還原酶STEAP3還原為二價鐵并儲存在鐵池中[31]。當(dāng)細(xì)胞中二價鐵過載時,將通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生過量ROS,進(jìn)而啟動鐵死亡發(fā)生[32]。而鐵蛋白可以將Fe2+轉(zhuǎn)化為Fe3+儲存在鐵蛋白殼中,從而減少因?yàn)殍F過載所導(dǎo)致的鐵死亡。鐵蛋白可分為鐵蛋白輕鏈(FTL)和鐵蛋白重鏈(FTH),在某些生理和病理?xiàng)l件下,易患鐵死亡的細(xì)胞表現(xiàn)為TFR表達(dá)上調(diào),鐵蛋白(包括FTH1和FTL)表達(dá)下調(diào),表明增加鐵攝取或減少鐵的儲存形式可導(dǎo)致鐵死亡[33]。研究表明涉及?；o酶a合成酶長鏈家族成員4(ACSL4)的脂氧合酶依賴性酶途徑的激活在脂質(zhì)過氧化中起關(guān)鍵作用,其可通過促進(jìn)氧化的細(xì)胞膜磷脂的積累來驅(qū)動鐵死亡。有學(xué)者通過使用CRISPR/Cas9技術(shù),發(fā)現(xiàn)在鐵死亡敏感的小鼠細(xì)胞中ACSL4對Erastin誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡具有保護(hù)作用,認(rèn)為ACSL4既是急性腎功能衰竭中體內(nèi)調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡方式的預(yù)測生物標(biāo)志物,也是藥效學(xué)標(biāo)志物,從而為臨床監(jiān)測和診斷鐵死亡介導(dǎo)性疾病提供了重要的研究價值[20]。許多親脂性抗氧化劑(如FER-1、β-胡蘿卜素、Liproxstatin-1、和α-生育酚)以及某些酶系統(tǒng),包括超氧化物歧化酶、輔酶Q和GPX,可以清除多余的ROS以防止組織損傷[34]。但是目前對于鐵死亡抑制劑的應(yīng)用大多是動物研究,缺少臨床數(shù)據(jù),因此未來在臨床上對于鐵死亡相關(guān)AKI的防治仍需要進(jìn)一步探討。

2.2 鐵死亡與AKI 最初,細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是AKI的主要細(xì)胞死亡類型。然而最近的研究表明,鐵死亡可能是各種類型所致AKI的主要死亡途徑[35],體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)表明鐵死亡抑制劑對緩解腎臟損傷有效。當(dāng)FTH基因敲除小鼠發(fā)生橫紋肌溶解(RM)誘導(dǎo)的AKI時,病死率增加,表明FTH在AKI腎損傷中起重要作用。RM大鼠腎細(xì)胞胞漿和線粒體中的血紅素和游離鐵水平以及腎組織中的脂質(zhì)過氧化水平顯著增加[36]。姜黃素被發(fā)現(xiàn)可抑制鐵死亡和有效改善RM導(dǎo)致的腎功能下降[37]。研究表明,缺鐵可通過增加催化血紅素鐵來加重RM誘導(dǎo)的AKI,糾正缺鐵可減少所有類型的AKI[38]。

IRI所致的AKI相關(guān)性鐵死亡是由線粒體細(xì)胞因子肝再生增強(qiáng)因子(ALR)介導(dǎo)的,而ALR與Gpx4系統(tǒng)有關(guān)。沉默ALR基因會降低Gpx4活性,并促進(jìn)鐵死亡[39]。褪黑素和恩他卡朋被證實(shí)可上調(diào)Nrf2的核轉(zhuǎn)位,導(dǎo)致下游SLC7A11的表達(dá)增加,并顯著抑制氧化應(yīng)激和鐵死亡[40]。最近的研究表明,右旋糖苷可以通過抑制ACSL4減輕鐵死亡誘導(dǎo)的AKI[41]。有關(guān)研究表明,通過抑制肌醇需要酶1(IRE1)/c-Jun NH2末端激酶(JNK)通路,可以通過抑制鐵死亡來保護(hù)IRI所致的腎臟損傷[42]。Michael等發(fā)現(xiàn)藥物抑制鐵死亡可以改善嚴(yán)重IRI后的不良適應(yīng)性腎臟反應(yīng)和纖維化[43]。各種研究表明,鐵絡(luò)合劑和其他鐵蛋白抑制劑可以減輕IRI引起的腎臟損傷,與鐵死亡相關(guān)的調(diào)節(jié)因子的失活會導(dǎo)致或加重AKI。

高劑量的FA被廣泛用于誘導(dǎo)動物腎臟疾病。腎臟中的高水平FA可嚴(yán)重?fù)p害細(xì)胞抗氧化系統(tǒng),導(dǎo)致氧化還原失衡和氧化應(yīng)激加劇。給予Fer-1可預(yù)防AKI,減輕炎性反應(yīng),表明鐵死亡是FA誘導(dǎo)的AKI損傷的主要途徑[44]。

Fer-1可顯著減輕敗血癥導(dǎo)致的AKI[45]。最近的一項(xiàng)研究還表明,鳶尾素可增加GSH水平以及改變腎組織中Gpx4和ACSL4的表達(dá)來抑制膿毒癥小鼠的鐵死亡和改善腎功能[46]。褪黑素治療已被證明通過上調(diào)Nrf2/HO-1途徑抑制鐵死亡和減輕膿毒癥引起的AKI[47]。在慶大霉素、甘油和環(huán)孢素等藥物誘導(dǎo)的急性腎損傷中,活性氧和過氧化氫的生成增加。同時,GSH和血紅素加氧酶(HO-1)等抗氧化防御機(jī)制也發(fā)生了變化。重癥急性胰腺炎(SAP)誘導(dǎo)的AKI后,鐵蓄積,脂質(zhì)過氧化增加,鐵死亡相關(guān)蛋白和基因上調(diào)。Liproxstatin-1治療可減輕SAP大鼠的胰腺和腎臟組織病理學(xué)損傷[48]。

3 結(jié) 論

目前研究已證實(shí)AKI中涉及多種形式的調(diào)控性細(xì)胞死亡,抑制其中一種細(xì)胞死亡形式可能延緩或逆轉(zhuǎn)腎功能的衰竭,但這種保護(hù)作用并不全面。研究表明,對一種途徑敏感的細(xì)胞可以通過另一種途徑抵抗死亡,一條受調(diào)控的壞死通路可以補(bǔ)償另一條途徑不同的細(xì)胞死亡形式。在某些AKI病例中,鐵死亡與壞死性凋亡這2條受調(diào)控的壞死途徑似乎獨(dú)立且平行地起作用。理想情況下,對這2條通路都有內(nèi)源性抑制潛力的化合物,如NEC-1,可能是最利于治療受這2條途徑調(diào)控的AKI。同樣,這樣的策略也適用于其他實(shí)質(zhì)臟器,如肝臟和肺。未來的研究將集中在壞死性凋亡和鐵死亡的具體途徑,每條途徑之間的相互作用,以及其他形式的細(xì)胞死亡之間的內(nèi)在聯(lián)系。盡管許多動物實(shí)驗(yàn)表明靶向是有效的,但動物模型和人類是不同的,還需要更多的研究來證實(shí)這種策略在體內(nèi)也是有效的。此外,壞死性凋亡與鐵死亡能在多大程度上作為恢復(fù)AKI的治療靶點(diǎn)是未來研究的重點(diǎn)。