付鈺 賈瑞瑞 何荷 王良桂 楊秀蓮

（南京林業(yè)大學(xué)風(fēng)景園林學(xué)院，南京 210037）

楸樹（Catalpa bungei C.A.Meyer.），屬紫葳科梓樹屬落葉喬木，是我國特有的優(yōu)質(zhì)用材樹種和觀賞樹種［1-3]。楸樹樹形優(yōu)美、花大色艷，極具觀賞價(jià)值，其材質(zhì)優(yōu)良，素有“木王”美譽(yù)［4-5]。我國造林、園林綠化、道路工程等對(duì)楸樹資源的需求量與日俱增，但因楸樹自花不育，出苗率低等特點(diǎn)，使幼苗繁殖困難，嚴(yán)重阻礙了楸樹的發(fā)展，進(jìn)而導(dǎo)致楸樹資源日益萎縮［6-7]。因此，實(shí)現(xiàn)楸樹的良種擴(kuò)繁是緩解國內(nèi)資源供需矛盾的關(guān)鍵一環(huán)。

嫁接，是將幼苗的枝條或莖（接穗）連接到另一種植物（砧木）的合適部分，彼此協(xié)調(diào)，形成完整的植株［8-9]。嫁接對(duì)于植株的生長具有顯著的促進(jìn)作用。在西瓜砧木種質(zhì)潛力的研究中發(fā)現(xiàn)，所有嫁接植株相比于未嫁接植株在葉子數(shù)量、根干重等生長參數(shù)上都表現(xiàn)出優(yōu)越的性能［10]。正因如此，嫁接逐步成為園藝植物營養(yǎng)繁殖和性狀改良的常見做法以及大規(guī)模繁殖的主要途徑［11-12]。在高等植物嫁接過程中，接穗和砧木之間會(huì)發(fā)生一些遺傳物質(zhì)的長距離運(yùn)輸來參與植株代謝調(diào)控［13]。隨著研究水平的不斷提高，嫁接過程中分子領(lǐng)域的探索也逐步深入。

轉(zhuǎn)錄組，即生物體的全部轉(zhuǎn)錄物集合，而轉(zhuǎn)錄組學(xué)是指在RNA水平上對(duì)基因表達(dá)的研究［14]。對(duì)于植物來說，其生長發(fā)育及其形態(tài)都會(huì)受到相關(guān)基因的嚴(yán)格控制［15]。在轉(zhuǎn)錄組研究中發(fā)現(xiàn),嫁接可以影響相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)整個(gè)植株的生命活動(dòng)［16]。嫁接柿的轉(zhuǎn)錄組研究中發(fā)現(xiàn)，中間砧‘南通小方柿’通過影響莖生長發(fā)育相關(guān)代謝通路中基因表達(dá)量的變化進(jìn)而起到矮化作用［17]；嫁接蘋果的根系生長發(fā)育轉(zhuǎn)錄組研究中，證實(shí)了接穗特性可以通過對(duì)糖代謝和生長素等信號(hào)通路的調(diào)節(jié)來影響砧木表型［18]；另外，在不同柑橘砧木組合的轉(zhuǎn)錄組分析中發(fā)現(xiàn)，不同砧木顯著影響嫁接植物中生長素和赤霉素信號(hào)途徑相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)而影響生長［15]。雖然很多木本植物在嫁接領(lǐng)域中關(guān)于轉(zhuǎn)錄組的研究不斷深入，但是對(duì)于不同砧木楸樹嫁接苗之間生長發(fā)育差異的分子機(jī)制仍不清楚。

以往的研究中，對(duì)于楸樹嫁接苗的生長，更多的是集中于形態(tài)和生理層面上的探索。為進(jìn)一步了解不同砧木楸樹嫁接苗生長差異的分子機(jī)制，選取楸樹良種‘蘇楸1號(hào)’作為接穗，以梓樹和滇楸為砧木，在形態(tài)和生理學(xué)研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)兩種嫁接組合苗進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，從轉(zhuǎn)錄水平上篩選不同砧穗組合嫁接苗生長發(fā)育的差異基因。研究結(jié)果可為進(jìn)一步闡明楸樹梓砧和滇砧嫁接苗生長差異機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試接穗為楸樹良種‘蘇楸1號(hào)’，砧木為1年生梓樹和滇楸的實(shí)生苗，砧木粗度約為1 cm，長度約為18 cm。試驗(yàn)所用砧木和接穗均來自南京林業(yè)大學(xué)白馬科研基地楸樹資源圃。嫁接試驗(yàn)于2020年4月中旬進(jìn)行，采用單芽接，兩個(gè)組合分別嫁接200株，嫁接苗按0.6 m×1.5 m的株間距種植。文中梓砧嫁接組合和滇砧嫁接組合分別簡寫為ZS和DS。于2021年8月上旬取ZS和DS相同部位的頂芽和由上至下第5片大小基本一致的葉片，每組合取4株嫁接苗，做好標(biāo)記立即放入液氮速凍，之后置于-80℃超低溫冰箱保存用于轉(zhuǎn)錄組測序。

1.2 方法

1.2.1 生長相關(guān)指標(biāo)測定 嫁接苗生長6個(gè)月后，統(tǒng)計(jì)兩個(gè)嫁接組合的成活率（成活率=成活株數(shù)/嫁接總數(shù)量×100%）。于當(dāng)年12月初，各嫁接組合隨機(jī)選擇30株，用游標(biāo)卡尺測定新梢基部5 cm處的直徑，為新梢當(dāng)年粗度。用卷尺測定嫁接部位到新梢頂端的長度，為新梢當(dāng)年長度。于2021年4月中旬，同樣方法測定嫁接部位上下粗度（即接穗/砧木粗度比）。

1.2.2 RNA提取和文庫構(gòu)建 用液氮研磨提取ZS、DS的頂芽和葉片的RNA，每組合的葉片和頂芽各有3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，共計(jì)12個(gè)樣品（表1）。使用從美國Invitrogen公司購買的Plant RNA Purification Reagent試劑盒提取RNA。將具有polyA尾巴的真核mRNA用帶有Oligo（dT）的磁珠富集，以用超聲波片段化后的mRNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶體系中以隨機(jī)寡核苷酸為引物將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA第一條鏈，將RNA鏈降解后，合成cDNA第二條鏈。將雙鏈cDNA經(jīng)純化后進(jìn)行末端修復(fù)，加入A尾，鏈接測序接頭，擴(kuò)增連接產(chǎn)物并純化，最終獲得cDNA文庫。

表1 嫁接組合及取樣部位Table1 Grafting combination and sampling part

1.2.3 測序數(shù)據(jù)處理 cDNA文庫質(zhì)檢合格后，使用Illumina HiSeq2500平臺(tái)對(duì)其進(jìn)行測序。為保證測序得到的原始數(shù)據(jù)的質(zhì)量，減少干擾，對(duì)Raw reads進(jìn)行質(zhì)控。進(jìn)一步采用一定的標(biāo)準(zhǔn)低質(zhì)數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，包括去除含Adapter、含N比例大于10%、全部都是A堿基以及低質(zhì)量的Reads。

1.2.4 差異表達(dá)基因分析 使用DESeq2軟件對(duì)ZS和DS嫁接組合葉片和頂芽中的基因表達(dá)水平進(jìn)行分析，得到Reads count數(shù)據(jù)，并將Reads count數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，進(jìn)而得到FDR值，篩選FDR＜0.05且|log2FC|＞1的顯著差異基因。差異表達(dá)基因的GO富集分析由GOseq R軟件進(jìn)行［19]，KEGG富集分析由KOBASs軟件進(jìn)行［20]。

1.2.5 RT-qPCR驗(yàn)證 將轉(zhuǎn)錄組測序后返回樣本的DS和ZS的葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒采用北京全式金生物技術(shù)有限公司的TransScript One-Step試劑盒，嚴(yán)格按照試劑盒內(nèi)說明書進(jìn)行操作，反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA稀釋10倍后置于-20℃冰箱保存。在與光合作用、營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)通路以及相關(guān)基因功能預(yù)測中，挑選出4個(gè)FPKM值高于10的差異表達(dá)基因作為驗(yàn)證基因，利用NCBI Primer-BLAST和Primer Quest設(shè)計(jì)上述差異表達(dá)基因的特異性引物。選擇CfMADH為內(nèi)參基因用于分析基因的表達(dá)［21]。將設(shè)計(jì)好的引物序列委托上海捷瑞生物工程有限公司合成（表2）。使用TaKaRa的TB Green? Premix Ex Taq試劑盒配置好混合液后，在StepOne PlusTM Real-Time PCR Instrument上進(jìn)行RT-qPCR，按以下程序進(jìn)行：95℃，30 s；40個(gè)循環(huán)（95℃，45 s；60℃，30 s；95℃，15 s）。熒光定量數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT相對(duì)定量計(jì)算。

表2 RT-qPCR引物序列Table 2 Primer sequences of RT-qPCR

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析 生長相關(guān)指標(biāo)數(shù)據(jù)利用SPSS 26.0軟件采用樣本獨(dú)立t檢驗(yàn)法對(duì)兩個(gè)楸樹嫁接組合間的差異顯著檢驗(yàn)（P＜0.05）。柱狀圖使用Microsoft Excel 2010繪圖。

2 結(jié)果

2.1 兩種嫁接苗的生長狀況

ZS和DS的嫁接成活率和各生長量之間存在顯著性差異。ZS的成活率為60.95%,約為DS（32.05%）的1.9倍（表3）；ZS的新梢長度、粗度以及接穗粗度/砧木粗度分別為107.51 cm、2.47 cm、0.822，同樣顯著高于DS（表3）；ZS的葉面積是DS的1.37倍（表3）。

表3 兩個(gè)楸樹嫁接苗的成活率和生長量Table 3 Survival rates and growths of grafted seedlings of two Catalpa trees

2.2 測序數(shù)據(jù)及質(zhì)量情況

從表4可以看出，本試驗(yàn)12個(gè)樣品高質(zhì)量數(shù)據(jù)堿基總數(shù)為75612 886298 bp，有效數(shù)據(jù)質(zhì)量高于20的堿基比例（Q20）均高于96%，最大達(dá)到97.36%，有效數(shù)據(jù)質(zhì)量高于30的堿基比例（Q30）在91.16%-92.69%之間。過濾后得到的高質(zhì)量數(shù)據(jù)中含有N堿基的數(shù)據(jù)比例為0，過濾后的序列堿基GC比例在43.79%-44.57%之間。

表4 12個(gè)樣本測序數(shù)據(jù)的匯總結(jié)果Table 4 Summary results of sequencing data for 12 samples

同一嫁接組合相同取樣部位的3個(gè)重復(fù)樣本間的皮爾遜相關(guān)系數(shù)基本均大于0.8，同時(shí)組內(nèi)樣本的皮爾遜相關(guān)系數(shù)均比組間樣本的皮爾遜相關(guān)系數(shù)高（圖1），結(jié)果表明測序樣本的數(shù)據(jù)可靠、生物學(xué)重復(fù)性較好，測序數(shù)據(jù)和序列組裝的質(zhì)量可以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。

圖1 樣本間基因表達(dá)水平相關(guān)性熱圖Fig. 1 Correlation heat map of gene expression levels among samples

2.3 差異表達(dá)基因GO、KEGG分析

差異表達(dá)基因的分析主要是針對(duì)這兩個(gè)嫁接組合之間的研究，包括ZS-L與DS-L、ZS-B與DS-B。由火山圖可知（圖2），越靠近兩端的基因，差異越大；對(duì)顯著水平和差異倍數(shù)進(jìn)行評(píng)估，得出比較組之間差異基因的整體分布判斷標(biāo)準(zhǔn)為FDR＜0.05，且|log2FC|＞1?？傮w而言，兩嫁接組合葉片間的差異基因數(shù)量大于頂芽。ZS-L與DS-L中，差異基因共有372個(gè)，其中，上調(diào)基因?yàn)?0個(gè)，下調(diào)基因?yàn)?82，差異基因多表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)，占總差異基因的75.81%。ZS-B與DS-B中，差異基因共有187個(gè)，其中，102個(gè)基因表現(xiàn)為上調(diào)，85個(gè)基因表現(xiàn)為下調(diào)，差異基因主要為上調(diào)，占總差異基因的54.55%。

圖2 不同嫁接組合差異基因火山圖Fig. 2 Volcano plot of different genes in different grafting combinations

2.3.1 GO分析 在ZS-L與DS-L中，GO分析表明，有22個(gè)途徑顯著富集生物學(xué)分類過程，其中，細(xì)胞過程、代謝過程和單一生物體過程、刺激反應(yīng)、生物調(diào)節(jié)差異表達(dá)基因數(shù)量較多；有13個(gè)途徑顯著富集在細(xì)胞組分分類過程中，其中，細(xì)胞、細(xì)胞組分、細(xì)胞器差異表達(dá)基因數(shù)量較多；在分子功能分類過程中有11個(gè)顯著富集途徑，結(jié)合和催化活性差異表達(dá)基因數(shù)量較多（圖3-A）。在ZS-B與DS-B中，GO分析表明，在生物學(xué)分類過程顯著富集22個(gè)途徑，差異表達(dá)基因數(shù)量較多的為細(xì)胞過程、代謝過程和單一生物體過程、刺激反應(yīng)、生物調(diào)節(jié)；在細(xì)胞組分分類過程顯著富集14個(gè)途徑，細(xì)胞、細(xì)胞組分、膜、膜組分差異表達(dá)基因數(shù)量較多；在分子功能分類過程顯著富集12個(gè)途徑，差異表達(dá)基因數(shù)量較多的為催化活性、結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)活性（圖3-B）。

圖3 不同嫁接組合差異基因的GO注釋富集分析圖Fig. 3 GO annotation enrichment analysis diagram of differential genes in different grafting combinations

2.3.2 KEGG分析 ZS-L與DS-L中，共有213個(gè)顯著基因富集到66條代謝途徑，其中前20條顯著富集通路如圖4-A所示，代謝途徑、淀粉和蔗糖代謝、次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成、苯丙烷生物合成、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、單萜生物合成、類胡蘿卜素生物合成、卟啉與葉綠素代謝為主要富集通路。ZS-B與DS-B中，共有137個(gè)基因顯著富集到45條代謝途徑，其中前20條顯著富集通路如圖4-B所示，ZS-B與DS-B組合差異基因主要顯著富集通路有晝夜節(jié)律、次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成、碳代謝、玉米素生物合成、淀粉和蔗糖代謝、過氧化物酶體、卟啉和葉綠素代謝、光合生物的固碳作用。

圖4 不同嫁接組合顯著差異基因KEGG富集分析圖Fig. 4 KEGG annotation enrichment analysis diagram of differential genes in different grafting combinations

2.4 嫁接生長相關(guān)代謝通路篩選

針對(duì)ZS生長指標(biāo)顯著優(yōu)于DS，參考嫁接柑橘的相關(guān)生長代謝研究［22]，對(duì)ZS和DS葉片與頂芽的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析，初步篩選與嫁接生長相關(guān)的代謝通路。結(jié)果表明葉片與頂芽內(nèi)參與調(diào)控嫁接過程的通路存在差異，在ZS和DS的葉片中篩選得到關(guān)鍵通路有類胡蘿卜素生物合成、淀粉和蔗糖代謝和卟啉與葉綠素代謝；在ZS和DS間的頂芽中篩選得到的關(guān)鍵通路有硫胺素代謝、玉米素生物合成、苯并噁嗪類生物合成和淀粉和蔗糖代謝。其中，光合相關(guān)代謝通路和淀粉和蔗糖代謝通路在調(diào)控嫁接植株生長發(fā)育過程中發(fā)揮顯著作用［15,23]。本研究中，光合相關(guān)代謝通路的關(guān)鍵調(diào)控途徑如圖5，淀粉和蔗糖代謝通路的關(guān)鍵調(diào)控途徑如圖6。

圖5 光合相關(guān)代謝通路Fig. 5 Photosynthesis-related metabolic pathway

圖6 淀粉和蔗糖代謝相關(guān)通路Fig. 6 Pathways related to starch and sucrose metabolism

2.5 與光合作用相關(guān)的差異表達(dá)基因

在ZS和DS的葉片中，從光合作用相關(guān)的卟啉與葉綠素代謝和類胡蘿卜素生物合成通路里共篩選了8個(gè)顯著差異表達(dá)基因（表5）。與ZS相比，DS內(nèi)這8個(gè)差異表達(dá)基因均顯著下調(diào)。卟啉與葉綠素代謝通路中的Unigene0054531（HEMA1）、Unigene0017692（CRD1）、Unigene0005359（CAO）和Unigene0040270（CAO）分別與控制葉片合成乙酰丙酸、二乙烯基原葉綠素內(nèi)酯和葉綠素b的能力相關(guān)。而在類胡蘿卜素生物合成通路中的Unigene0051519（PSY1）、Unigene0046587（LCY1）、Unigene0013377（NCED2）、Unigene0044139（CYP707A2）分別參與葉片內(nèi)番茄紅素、胡蘿卜素、黃質(zhì)醛和菜豆酸的合成。

表5 與光合作用相關(guān)的差異表達(dá)基因統(tǒng)計(jì)Tab.5 Statistics of differentially expressed genes related to photosynthesis

2.6 與淀粉和蔗糖代謝相關(guān)差異表達(dá)基因

不同砧穗組合的葉片和頂芽中的差異表達(dá)基因均顯著富集于淀粉和蔗糖代謝通路中。共計(jì)篩選10個(gè)差異表達(dá)基因，其中7個(gè)在葉片中，4個(gè)在頂芽內(nèi)（表6）。相較于ZS，DS嫁接苗葉片中的Unigene0048299（INV*DC4）、Unigene0038167（SPS2）、Unigene0006320（WAXY）、Unigene0017971（TPPJ）均下調(diào)表達(dá)，使得蔗糖、淀粉合成受阻；而Unigene0000390（GLU3）、Unigene0022047（GLU1）則表達(dá)顯著上調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)纖維素大量分解。在頂芽中，Unigene0022047（GLU1）、Unigene0043824（BACOVA-02659）表達(dá)顯著上調(diào)。同時(shí)還篩選得到關(guān)鍵基因Unigene0048994（STP-1）和Unigene0047773（BAM1），相比于ZS，DS嫁接苗的頂芽中STP-1的表達(dá)量高而BAM1的表達(dá)量低，進(jìn)而導(dǎo)致淀粉糖原轉(zhuǎn)化生成葡糖的途徑被阻礙，頂芽生長發(fā)育所需的D型葡萄糖合成被促進(jìn)。

表6 與淀粉和蔗糖代謝相關(guān)的差異表達(dá)基因統(tǒng)計(jì)Tab.6 Statistics of differentially expressed genes related to starch and sucrose metabolism

2.7 差異表達(dá)基因驗(yàn)證

根據(jù)上述轉(zhuǎn)錄組的分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在ZS-L和DS-L之間差異更為顯著。因此分別從卟啉與葉綠素代謝、淀粉和蔗糖代謝兩個(gè)通路中挑選出Unigene0040270（CAO）和Unigene0006320（WAXY），以及根據(jù)基因功能預(yù)測挑選出同光合作用、葉綠素合成相關(guān)的Unigene0036149（RCA1）和Unigene0007805（GGAT2），共計(jì)4個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證。驗(yàn)證結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果中基因的表達(dá)變化趨勢一致（圖7），DS中4個(gè)基因表達(dá)量均顯著低于ZS。

圖7 四個(gè)基因在兩個(gè)嫁接組合中的相對(duì)表達(dá)量Fig. 7 Relative expressions of four genes in two grafting combinations

3 討論

嫁接可以促進(jìn)植物的生長發(fā)育，根據(jù)現(xiàn)有研究可知，通過嫁接成活率、嫁接苗生長狀況等方面可以對(duì)嫁接苗生長差異進(jìn)行初步判斷。本研究中，梓樹為砧木的嫁接苗成活率顯著大于滇砧嫁接苗，滇砧苗的成活率僅為32.05%。原因可能與接穗的品種有關(guān)，同一接穗品種與不同砧木之間的親和性有差異，會(huì)影響嫁接成活率，這與黑核桃嫁接結(jié)果一致［24]。有研究認(rèn)為，嫁接口上下徑的粗度比在一定程度上可以判斷嫁接砧穗的親和性，新梢和砧木粗度比值大于0.8且越接近1，親和性越高［25]。本研究結(jié)果顯示梓砧苗的砧穗比顯著大于滇砧苗，且比值更接近于1，說明其親和性更好。

砧木負(fù)責(zé)嫁接植物的礦物質(zhì)營養(yǎng)吸收，不同的砧木可能導(dǎo)致嫁接植物生長量的差異［26]。本研究中，梓砧苗的新梢長度、粗度均顯著大于滇砧苗，說明兩種砧木對(duì)楸樹嫁接苗的生長量也是有影響的，該結(jié)果與芒果嫁接一致［27]。對(duì)于梓砧苗更為優(yōu)越的生長參數(shù)，可能是因?yàn)殍鳂湓缙诟禂?shù)量和生長量較大，吸收水分和礦質(zhì)營養(yǎng)的能力更強(qiáng)，從而促進(jìn)了新梢的生長。

葉片是植物體的光合引擎，光合速率的增強(qiáng)可以通過葉面積增大和葉片數(shù)增多實(shí)現(xiàn)，進(jìn)一步促使植株干物質(zhì)累積量升高，因此葉面積在某種條件下可以反映嫁接苗的發(fā)育情況［28]。本研究中，梓砧苗的葉面積顯著大于滇砧苗，說明適宜的砧木可通過增大葉面積促進(jìn)植株生長，西瓜嫁接苗葉片研究也證實(shí)了此說法［29]。

同一品種接穗嫁接不同砧木，嫁接苗的表型、生長狀況甚至基因表達(dá)都會(huì)有所改變［30]。本研究對(duì)兩個(gè)嫁接組合的葉片和頂芽進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，試圖從分子層面分析造成這種生長差異的原因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在ZS與DS葉片內(nèi)篩選得到的關(guān)鍵通路主要與光合作用相關(guān)，頂芽內(nèi)篩選得到的關(guān)鍵通路主要與植株的抗逆性和生長分化相關(guān)［31-32]，而與碳水化合物相關(guān)的淀粉和蔗糖代謝通路在葉片和頂芽內(nèi)均發(fā)揮重要作用，這也表明嫁接親和組合能夠通過增強(qiáng)光合相關(guān)的差異表達(dá)基因的表達(dá)以及碳水化合物代謝來提高細(xì)胞增殖能力，從而促進(jìn)嫁接苗的生長，與黃瓜（Cucumis sativus）嫁接親和性的研究結(jié)果相似［33]。

相關(guān)代謝通路中基因的差異表達(dá)可能是ZS與DS之間生長差異的原因。在篩選得到的與光合作用密切相關(guān)的類胡蘿卜素生物合成中發(fā)現(xiàn)，編碼類胡蘿卜素合成途徑的第一個(gè)限制酶八氫番茄紅素合成酶的基因PSY1和編碼番茄紅素環(huán)化酶的LCY1在嫁接組合ZS中的表達(dá)量顯著高于DS。Kim等［34]認(rèn)為LCY基因的過表達(dá)能夠提高ABA含量，以及促進(jìn)PSY基因的表達(dá)進(jìn)而提高類胡蘿卜素的含量，增強(qiáng)植株的抗逆性。在課題組同期生理指標(biāo)測定結(jié)果中，ZS嫁接苗葉片內(nèi)源ABA的含量更高，可以推測ZS能夠通過提高LCY1和PSY1基因的表達(dá)，提高葉片內(nèi)源ABA的含量，增強(qiáng)植株的抗逆性。同樣，在另一條光合相關(guān)的卟啉與葉綠素代謝通路中，相比于DS，ZS嫁接苗葉片內(nèi)葉綠素合成關(guān)鍵酶基因CRD1和CAO基因表達(dá)量均更高，同期的生理指標(biāo)測定結(jié)果顯示，ZS嫁接苗葉片內(nèi)葉綠素a、b含量及凈光合速率、蒸騰速率等指標(biāo)均顯著優(yōu)于DS。因此，可以推測ZS能夠通過提高CRD1和CAO基因的表達(dá)，提高葉綠素的合成，促進(jìn)其積累，從而增強(qiáng)其葉片的光合作用，進(jìn)而促進(jìn)植株的生長。

本研究結(jié)果表明，淀粉和蔗糖代謝在楸樹嫁接苗生長過程中發(fā)揮重要作用。在ZS嫁接苗的葉片組織中，淀粉和蔗糖代謝通路內(nèi)的差異表達(dá)基因大多高表達(dá)，包括SPS2、SS2、TPPJ和WAXY，這意味著該組合葉片中的淀粉和蔗糖代謝更為活躍，與同期生理指標(biāo)測定結(jié)果顯示的ZS葉片的可溶性糖和淀粉含量均大于DS的結(jié)果一致，且與柑橘、甘蔗蔗糖結(jié)果一致［35-36]。同時(shí)，在DS嫁接苗葉片中，編碼內(nèi)切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的基因的GLU3和GLU1均高表達(dá)，且在其頂芽組織中同樣發(fā)現(xiàn)GLU1基因表達(dá)量較高，而纖維素的分解與內(nèi)切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶密切相關(guān)，可以推測DS嫁接苗內(nèi)的纖維素被大量消耗。已有研究表明，纖維素是構(gòu)成植物細(xì)胞壁的主要成分之一［37]，對(duì)維持植物細(xì)胞的形態(tài)和穩(wěn)態(tài)具有突出的作用。據(jù)此，可以進(jìn)一步推測，GLU3和GLU1的高表達(dá)導(dǎo)致DS組織內(nèi)的纖維素被大量分解，是阻礙嫁接苗的正常生長的原因之一。

4 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)梓砧苗的各生長參數(shù)均優(yōu)于滇砧苗，轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析表明光合相關(guān)通路及淀粉和蔗糖代謝通路的相關(guān)基因在ZS中高度表達(dá)，篩選出的差異表達(dá)基因可能促進(jìn)ZS嫁接苗的生長發(fā)育。