岳炳霖,楊友抓拉母,冉宏標,王 會,蔡 欣,王嘉博,柴志欣,彭 巍,舒 適,付長其,王國文,鐘金城

(1.西南民族大學 青藏高原動物遺傳資源保護與利用四川省、教育部重點實驗室,四川 成都 610041;2.青海大學 青海省畜牧獸醫(yī)科學院,青海 西寧 810016)

骨骼肌是哺乳動物最大的組織,約占總體質量的40%,維持著機體新陳代謝、呼吸和運動等基本功能[1-3]。脊椎動物的骨骼肌主要來源于中胚層生皮肌節(jié),由生肌祖細胞經增殖分化形成梭形單核成肌細胞,而后向肌肉形成部位遷移,經過一系列的增殖、分化和融合過程最終形成成熟肌纖維,另有一部分成肌細胞不發(fā)生融合形成衛(wèi)星細胞用于損傷肌肉的再生[4]。脊椎動物骨骼肌纖維在胎兒期就已保持數(shù)目恒定,出生后主要通過肌纖維的肥大增加肌肉量[5]。牛骨骼肌原代細胞是從出生前牛背最長肌組織中分離的,作為一種體外模型細胞,可用于研究早期牛骨骼肌的增殖過程。

骨骼肌的生長發(fā)育是一個極其復雜的過程,對其轉錄調控機制的研究一直是分子遺傳領域的熱點。隨著轉錄組測序技術的飛速發(fā)展,圍繞骨骼肌生長發(fā)育相關基因的功能鑒定及轉錄調控機制研究已取得大量的成果[6]。近年來,非編碼RNA研究逐漸興起,其對骨骼肌發(fā)育的調控也成為研究熱點。環(huán)狀RNA是由一類不具有5′末端帽子和3′末端poly(A)尾,以共價鍵形成環(huán)狀閉合結構的非編碼RNA,與線性mRNA相比,環(huán)狀RNA共價閉合的結構使其不易被核酸外切酶RNase R降解,具有更高的穩(wěn)定性[7]。根據環(huán)狀RNA的起源,其主要被分為四類:外顯子環(huán)狀RNA、外顯子-內含子環(huán)狀RNA、內含子環(huán)狀RNA以及基因間環(huán)狀RNA[8]。環(huán)狀RNA是一種反向剪接的產物,具有時空特異性及組織細胞特異性。大量的研究證實環(huán)狀RNA廣泛參與調控動物機體生長發(fā)育過程,其中涉及最為廣泛的是環(huán)狀RNA作為miRNA的分子海綿的ceRNA調控,此外,環(huán)狀RNA可以和功能蛋白結合參與剪接調控、轉錄調控、表觀遺傳修飾以及蛋白翻譯調控[9]。circMYH8位于秦川牛19號染色體上,是由MYH8基因的29—33外顯子環(huán)化形成,秦川牛不同發(fā)育時期背最長肌環(huán)狀RNA測序結果顯示,circMYH8在胎牛背最長肌的表達水平很高,可能參與牛骨骼肌早期發(fā)育。本研究首先利用生物學手段鑒定circMYH8為環(huán)狀RNA,接著以牛肌原代細胞為細胞模型,探究circMYH8對牛肌原代細胞增殖的調控作用,為高產率肉牛的培育提供新的分子靶標。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本試驗所使用的試驗動物是我國五大良種黃牛品種之首的秦川牛,為了防止或減少RNA的降解,將所采集的組織樣用無酶離心管裝,保存在-80 ℃冰箱。牛肌原代細胞從胎牛背最長肌樣品中分離,并在20%胎牛血清和1%青霉素鏈霉素中培養(yǎng)。本試驗所用的主要試劑如下:TRIzol 試劑(TaKaRa;中國)、反轉錄試劑盒(TaKaRa;日本)、熒光定量試劑盒(TaKaRa;日本)、瓊脂糖(Hydragene;美國)、核質提取試劑盒(Life Technologies;美國)、RIPA裂解液(Solarbio;中國)、DMEM高糖培養(yǎng)基(Thermo Scientific;美國)、EdU細胞增殖試劑盒(RiboBio;中國)、PCD 2.1載體(吉賽;中國)、inhibitor(通用生物;中國)。

1.2 主要儀器

PCR儀(ALD1244;美國Bio-Rad)、熒光定量PCR儀(Bio-Rad CFX96;美國Bio-Rad)、凝膠成像儀(UNIVERSAL HOOD Ⅱ;美國Bio-Rad)、高速冷凍離心機(BIOFUGE PRIMO R;美國Thermo)、多功能酶標儀(BioTek Synergy2;美國BioTek)、多功能成像分析系統(tǒng)(FluorChem M system;美國ProteinSimple)、細胞培養(yǎng)箱(3111;美國Thermo)。

1.3 試驗方法

1.3.1 牛肌原代細胞分離及培養(yǎng) 首先,將胎牛放入滅菌大培養(yǎng)皿內,用酒精棉球全面擦拭皮膚,利用手術刀剝離皮膚與筋膜,取適量肌肉組織并用無菌PBS沖洗3次。接著,將沖洗好的肌肉組織放入已加少量PBS的培養(yǎng)皿中,用滅菌剪刀將肌肉組織剪碎后轉至10 mL離心管,去上清后加入組織4倍體積的0.2%Ⅱ型膠原酶,37 ℃水浴搖床消化3 h。利用孔徑38 μm濾網過濾消化后的細胞,并將過濾得到的細胞用無菌PBS清洗3次(1 500 r/min),最后用含有20%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的完全培養(yǎng)基懸浮細胞并繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.2 RNA提取及RT-qPCR 利用TRIzol試劑(TaKaRa;日本)和核質提取試劑盒分別提取總RNA以及細胞核和細胞質RNA;利用反轉錄試劑盒合成cDNA;使用熒光定量試劑盒在熒光定量PCR儀上進行RT-qPCR。其中將反轉錄得到的cDNA稀釋10倍作為模板,GAPDH為內參,表達量用2-ΔΔCt值進行校正。熒光定量反應體系(15 μL)為:SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ(2×)7.5 μL、上下游引物各1 μL、cDNA 1 μL、去離子水4.5 μL。所使用PCR的反應程序包括以下步驟:95 ℃,240 s 預變性;95 ℃,20 s變性;55 ℃,20 s 退火;72 ℃,20 s延伸;共40個循環(huán),整個試驗過程保持避光。本試驗所有引物信息如表1所示。

表1 引物信息

1.3.3 RNase R處理及核質分離 RNase R是一種可以切割降解RNA的核糖核酸外切酶,來源于大腸桿菌,能夠消化幾乎所有的線性RNA分子,但不易消化環(huán)狀RNA以及套索結構,因此,可以用于環(huán)狀RNA的鑒定。用20 U/μL的 RNase R處理牛背最長肌總RNA 4 h,再進行反轉錄后即可通過PCR檢測circMYH8的穩(wěn)定性。參考核質提取試劑盒說明書進行牛肌原代細胞核質RNA的分離。

1.3.4 circMYH8的鑒定 設計合成circMYH8的divergent primer及convergent primer 2組引物分別用來擴增circMYH8及其線性轉錄物。使用NCBI中的primer design tool軟件設計相關引物,由于環(huán)狀RNA與mRNA不同,它不具有5′和3′末端,而是RNA剪切過程中反向拼接產生的閉合的環(huán)狀結構,因此,設計divergent primer與convergent primer也不相同,設計convergent primer時要考慮產物應包含環(huán)化位點。設計引物時:Tm值應不低于40 ℃;GC含量最好在40%～60%;上下游引物的Tm值和GC含量均應相差不大;引物的長度最好在18～25 nt;擴增產物長度最好在100～250 bp,不宜太長。引物合成成功后,分別以牛背最長肌cDNA、RNase R處理的牛背最長肌cDNA以及牛背最長肌gDNA為模板進行PCR擴增,通過測序及瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。所述的PCR的擴增體系(20 μL)為:50 ng/μL模板DNA 1 μL、10 pmol/L的引物divergent primer或convergent primer對應的上下游引物各1 μL、PCR Mix 10 μL、去離子水7 μL。所使用PCR的反應程序包括以下步驟:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性30 s,65 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共15個循環(huán);95 ℃變性30 s,50 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共20個循環(huán);72 ℃延伸10 min。

1.3.5 載體構建及干擾片段合成 設計circMYH8全長引物,以牛背最長肌cDNA為模板PCR擴增circMYH8全長片段后,和PCD 2.1載體同時進行KpnⅠ和BamH Ⅰ雙酶切,回收酶切片段后利用T4DNA Ligase進行酶連反應,酶連產物轉化至DH5α感受態(tài)細胞并進行涂板,最后挑單克隆菌進行菌液PCR,選取陽性菌液送測序,將測序正確的菌液純化試劑盒抽提circMYH8過表達載體。為了合成circMYH8干擾片段,設計了circMYH8環(huán)化位點為靶點的siRNAs并由通用生物公司合成,circMYH8-si的序列為:5′-GGAAGCAGAGGTGAATATT-3′。siRNA設計原則:片段長度19～21 nt;GC含量40%～60%;避免出現(xiàn)超過4個連續(xù)A/T;首位盡量避免重復;序列位置應在環(huán)化位點兩側分布均勻;一般會在干擾片段的3′末端加TT懸垂。

1.3.6 細胞轉染 首先培養(yǎng)肌原代細胞,并將細胞接種到12孔板中。轉染前,將孔板里的培養(yǎng)基換為OPTI-MEM培養(yǎng)基。以12孔板規(guī)格為例:根據載體或RNA寡核苷酸的濃度,將50 pmol的RNA寡核苷酸溶解于100 μL OPTI-MEM培養(yǎng)基中(A),同時用100 μL OPTI-MEM培養(yǎng)基溶解1.5 μL R0531,室溫靜置5 min(B)。將(A)緩緩加入(B)中,輕輕混勻,室溫孵育15 min。最后將(A)(B)混合液加入相應的孔板中,“十字法”將培養(yǎng)基搖勻,放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.7 Western Blot 使用RIPA裂解液裂解細胞提取總蛋白,并通過BCA分析試劑盒(Solarbio;中國)進行蛋白定量,并在SDS中等量煮沸變性蛋白;SDS-PAGE凝膠每孔上樣20 mg蛋白質,并在120 V,2 h條件下進行電泳,接著將蛋白質轉移到PVDF膜(Millipore;德國)上并在200 mA條件下轉膜3 h;TBST洗滌10 min,5%脫脂奶粉封閉膜2 h后,4 ℃與一抗孵育過夜;TBST洗滌膜3次后與HRP二抗常溫孵育2 h,TBST洗滌3次后使用ECL試劑(TransGen Biotech;中國)通過化學發(fā)光系統(tǒng)(Bio-Rad;美國)檢測蛋白信號。

1.3.8 EdU檢測細胞增殖及流式細胞術 參考EdU細胞增殖試劑盒說明書,根據試劑盒說明書處理96孔板細胞,并采用熒光顯微鏡(DM5000B;德國)獲取EdU圖像。流式細胞術檢測細胞周期:待細胞匯合度為80%左右時胰酶消化細胞,收集至2 mL離心管中,PBS清洗細胞2次;PBS清洗細胞后離心棄上清,加入預冷70%乙醇于4 ℃固定過夜;離心收集細胞,以1 mL的PBS洗細胞2次,加入500 μL PI染液(含50 μg/mL碘化丙啶(PI)的PBS,100 μg/mL RNase A,0.2% Triton X-100),4 ℃避光孵育30 min;利用流式細胞儀進行檢測,計數(shù)2～3萬個細胞,使用細胞周期擬和軟件分析數(shù)據。

1.3.9 數(shù)據分析 使用GraphPad Prism 8.0和SPSS 22.0軟件進行數(shù)據分析。2組分析采用獨立樣本t檢驗,3組或更多組采用單因素方差分析(ANOVA)。所有試驗數(shù)據均以平均值±標準誤差(s)表示。

2 結果與分析

2.1 circMYH8的篩選

用于篩選的測序數(shù)據來自秦川牛胎兒90 d和成年24月齡2個不同發(fā)育時期背最長肌的環(huán)狀RNA測序結果,其中,每個發(fā)育階段有3個牛骨骼肌樣本,總共包含6個通過質量控制的牛骨骼肌RNA樣品,并基于Illumina HiSeq 2500平臺進行環(huán)狀RNA高通量測序。根據|log2FC|>1及P<0.01的閾值對高通量測序數(shù)據進行過濾,篩選出牛背最長肌2個發(fā)育階段差異表達的環(huán)狀RNA(圖1-A),然后對其中顯著差異的環(huán)狀RNA進行不同發(fā)育階段骨骼肌表達水平驗證,RT-qPCR結果表明,circMYH8在胎牛骨骼肌的表達高于在成年牛骨骼肌中的表達,這與RNA-seq數(shù)據一致(圖1-B),暗示circMYH8在骨骼肌增殖中的調控作用。

2.2 circMYH8的鑒定

circMYH8來源于牛19號染色體上MYH8基因的29—33外顯子,使用circMYH8的divergent primer進行PCR擴增,產物Sanger測序結果證實circMYH8具有反向拼接位點(圖2-A)。接著瓊脂糖凝膠電泳結果顯示:以牛背最長肌cDNA或RNase R處理的牛背最長肌cDNA作為模板,circMYH8 divergent primer能夠成功擴增出產物,但以牛背最長肌gDNA作為模板時,circMYH8 divergent primer不能擴增出產物;以牛背最長肌cDNA或牛背最長肌gDNA作為模板,circMYH8 convergent primer能夠成功擴增出產物,但當使用RNase R處理的牛背最長肌cDNA作為模板時,circMYH8 convergent primer不能擴增出產物,該結果證實了circMYH8的真實性(圖2-B)。對circMYH8進行了細胞核質定位試驗,發(fā)現(xiàn)circMYH8在細胞核和細胞質中都存在(圖2-C)。circMYH8 的RNase R抗性檢測結果顯示RNase R極顯著降低了線性MYH8和β-actin的表達水平,而對circMYH8無顯著影響(圖2-D)。以上結果確證circMYH8是環(huán)狀RNA。

A.circMYH8在牛基因組上的定位,以及Sanger測序證實了circMYH8環(huán)化位點的存在;B.PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳結果確證了circMYH8的真實性;C.細胞核質定位試驗顯示circMYH8定位于細胞核和細胞質;D.RNase R的抗性試驗結果顯示circMYH8比線性MYH8更穩(wěn)定。

2.3 circMYH8抑制牛肌原代細胞增殖

為了探究circMYH8對牛骨骼肌增殖表型的影響,使用circMYH8過表達載體和干擾片段在培養(yǎng)24 h的牛肌原代細胞中成功過表達及抑制circMYH8(圖3-A、B)。首先收集細胞,利用qRT-PCR及Western Blot手段檢測增殖標志基因CDK2、CyclinD1、CDK4及P21的表達水平,結果表明:circMYH8過表達顯著抑制了CyclinD1和CDK4的轉錄水平,對CDK2和P21的轉錄水平無顯著影響(圖3-C),而干擾circMYH8極顯著抑制了P21的轉錄水平(圖3-D)。circMYH8過表達顯著抑制了CDK2、CyclinD1和CDK4的翻譯水平,促進了P21的翻譯水平,而干擾circMYH8對這些增殖標志基因的翻譯水平幾乎沒有影響(圖3-E)。隨后,EdU檢測結果顯示,circMYH8過表達顯著抑制了牛肌原代細胞的增殖,而干擾circMYH8對牛肌原代細胞增殖有促進作用(圖4-A)。此外,通過流式細胞術檢測試驗進一步評估circMYH8對牛肌原代細胞周期分布的影響。結果表明,circMYH8過表達不影響細胞周期分布,而干擾circMYH8促進了S期細胞比例的增加(圖4-B)?？傊?這些試驗結果表明,circMYH8能夠抑制牛肌原代細胞增殖。

A,B.circMYH8在培養(yǎng)24 h的牛肌原代細胞中被成功過表達(A)及抑制(B);C、D.過表達(C)及干擾(D)circMYH8后CDK2、CyclinD1、CDK4及P21的mRNA水平;E.過表達及干擾circMYH8后CDK2、CyclinD1、CDK4及P21的蛋白水平。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

A.EdU檢測用于評估細胞增殖能力,刻度尺,200 mm;B.流式細胞術檢測細胞周期分布。提供的數(shù)據來自3個獨立的試驗。

3 結論與討論

近年來,隨著高通量測序技術不斷的升級優(yōu)化,動物細胞中的各類非編碼RNA被廣泛發(fā)掘鑒定,其中研究最多的是miRNA和長鏈非編碼RNA,而環(huán)狀RNA因其環(huán)化閉合的結構,相較于其他非編碼RNA穩(wěn)定性更高,在動物生命活動中可能發(fā)揮重要的作用,從而受到廣泛的重視[10-12]。研究發(fā)現(xiàn),盡管環(huán)狀RNA的物種間保守性不高,但其以組織和發(fā)育階段特異性方式發(fā)揮基因調控功能[13]。環(huán)狀RNA通常含有豐富的miRNA結合位點,可以充當miRNA的分子海綿發(fā)揮ceRNA調控作用,間接調控miRNA的靶基因,例如Hansen等[14]發(fā)現(xiàn),環(huán)狀RNA ciRS-7及Sry分別擁有73個miR-7靶位點以及16個miR-138靶位點,通過吸附miRNA,ciRS-7和Sry能夠間接調控其靶基因。最近,也有研究顯示,環(huán)狀RNA可以通過介導蛋白-RNA相互作用調控動物各種生理病理過程,例如,circAmotl1被發(fā)現(xiàn)通過招募STAT3啟動Dnmt3a轉錄從而促進NIH3T3細胞增殖和傷口愈合[15],Du等[16]證實circFoxo3通過與p53及E3泛素連接酶MDM2相互作用,導致MDM2對p53的泛素化和降解,從而影響癌細胞的凋亡。此外,環(huán)狀RNA還被證實通過編碼微肽參與蛋白翻譯調控[17]。

本研究的數(shù)據來源于牛的2個不同發(fā)育階段骨骼肌環(huán)狀RNA測序,用以篩選出差異表達的環(huán)狀RNA[18]。骨骼肌的發(fā)育過程極其復雜,涉及產前及產后2個階段,包括肌纖維的形成、增加以及再生[19]。其中胎兒90 d為產前階段,此時存在著大量肌肉祖細胞的增殖發(fā)生,而24月齡為產后階段,這期間肌纖維已經完全形成[20]。這些具有發(fā)育階段特異性表達模式的環(huán)狀RNA可能參與調控骨骼肌發(fā)育。作為反向剪接產物的環(huán)狀RNA,在套索、順式作用元件以及反式作用因子的驅動下反向剪接環(huán)化促使其形成[21],因此,證實反向剪接環(huán)化位點的存在是環(huán)狀RNA鑒定的關鍵。在這里,設計出能擴增出環(huán)化位點的divergent primer用以環(huán)狀RNA的鑒定。此外,線性產物和環(huán)化產物的轉錄存在競爭[22-23],同時設計出能擴增出線性產物的convergent primer用以對照,通過PCR擴增測序及膠圖鑒定,本研究證實了circMYH8是環(huán)狀RNA。

在骨骼肌發(fā)育研究領域,骨骼肌細胞的增殖表型是評估骨骼肌細胞發(fā)育的重要指標。由于脊椎動物骨骼肌纖維在胎兒期就已保持數(shù)目恒定,出生后主要通過肌纖維的肥大增加肌肉量,因此,早期骨骼肌細胞的增殖調控決定著骨骼肌纖維的數(shù)目,也直接決定著畜禽動物的產肉性能[5]。越來越多的研究表明,非編碼RNA參與骨骼肌細胞增殖調控,尤其是miRNA,其中miR-1、miR-133和miR-206已被證實特異性地調控成肌細胞的增殖[24-25]。目前,關于環(huán)狀RNA調控畜禽骨骼肌增殖研究也逐漸增多,例如,牛circLMO7、circRILPL1和circCPE分別通過吸附miR-378a-3p、miR-145和miR-138促進牛成肌細胞增殖[18,26-27];牛circFUT10通過吸附miR-133a抑制牛成肌細胞增殖[28];雞circRBFOX2和circPTPN4分別通過競爭性結合miR-206和miR-499-3p促進雞成肌細胞增殖[29-30];牛circSVIL通過抑制STAT1的磷酸化促進牛成肌細胞的增殖等[31]。本研究從牛不同發(fā)育時期背最長肌環(huán)狀RNA測序結果中篩選出顯著差異表達的環(huán)狀RNA circMYH8,通過一系列生物學手段鑒定其為環(huán)狀RNA;成功構建合成了circMYH8的過表達載體及干擾片段,以牛肌原代細胞為細胞模型,轉染細胞后,利用分子試驗技術證實circMYH8可以顯著抑制牛肌原代細胞的增殖,circMYH8可作為肉牛轉基因育種的重要候選分子。