邱谷豐, 任廷丹, 王 強, 張傳清

(1.浙江農(nóng)林大學 現(xiàn)代農(nóng)學院，杭州 311300；2.建德市三都西紅花專業(yè)合作社，浙江 建德 311605)

西紅花Crocus sativusL.是鳶尾科番紅花屬的一種多年生草本植物，是浙江省“新浙八味”之一[1]，具有活血化瘀、涼血解毒、解郁安神、預(yù)防心血管疾病等效果[2]。西紅花起源于伊朗、西班牙、希臘等地中海國家[3]。在中國，杭州建德是西紅花種植栽培的發(fā)源地，被稱為“西紅花之鄉(xiāng)”。西紅花球莖腐爛病是由尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum引起的真菌病害，也是西紅花上最重要的病害[4]。在球莖儲存期和種植期，病球率高達30%～70%，嚴重降低了西紅花產(chǎn)量和花絲品質(zhì)，造成巨大的經(jīng)濟損失[5]。目前尚未見有關(guān)藥劑可以有效防治西紅花球莖腐爛病的系統(tǒng)研究報道。

氯氟醚菌唑 (mefentrifluconazole) 是巴斯夫公司于2016 年上市的第1 個新型脫甲基抑制劑(demethylation inhibitors, DMIs)[6]。DMIs 的作用靶點為病原菌細胞膜甾醇生物合成過程中的C14-脫甲基酶[6]，氯氟醚菌唑分子結(jié)構(gòu)中的異丙醇基團，能夠與該作用位點更加緊密地結(jié)合[7]。據(jù)報道，氯氟醚菌唑能有效防治多種真菌病害，如：香蕉葉斑病[8]、小麥銹病以及由殼針孢菌引起的病害、由柱隔孢菌引起的大麥病害、水稻紋枯病、稻瘟病、蘋果黑星病、核果樹和杏樹花腐病以及褐腐病[9-10]、葡萄白粉病、馬鈴薯早疫病等[7]。另外，相比于傳統(tǒng)的三唑類殺菌劑，氯氟醚菌唑?qū)τ谏鷳B(tài)環(huán)境的風險更低[11-12]。

目前有關(guān)氯氟醚菌唑防治鐮刀菌病害的研究甚少。僅劉亞慧等報道，氯氟醚菌唑?qū)Σ煌牭毒z生長、孢子萌發(fā)及細胞膜通透性表現(xiàn)出不同的生物活性[13]，但對于西紅花尖孢鐮刀菌的生物活性尚不清楚。因此，本研究建立了西紅花尖孢鐮刀菌對氯氟醚菌唑的敏感性基線，并分析了氯氟醚菌唑?qū)υ摬【z生長、孢子萌發(fā)及產(chǎn)孢量的影響；同時測定了氯氟醚菌唑?qū)怄哏牭毒募毎ねㄍ感缘挠绊?，評估了氯氟醚菌唑?qū)ξ骷t花球莖的保護和治療作用，以期為氯氟醚菌唑的科學使用及合理應(yīng)用于西紅花球莖腐爛病的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.2 供試藥劑 97%氯氟醚菌唑原藥和400 g/L氯氟醚菌唑懸浮劑(mefentrifluconazole 400 g/L SC)，由巴斯夫股份公司提供。原藥用甲醇溶解，配制成 40 mg/mL 的母液，于4 ℃保存，備用。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂 (PDA) 培養(yǎng)基：稱取去皮馬鈴薯200 g，煮沸后過濾，加入20 g 葡萄糖和20 g 瓊脂，加水定容至1 L，121 ℃高壓滅菌鍋滅菌，備用。水瓊脂培養(yǎng)基 (WA) 培養(yǎng)基：20 g 瓊脂，無菌水定容至1 L。馬鈴薯葡萄糖 (PDB) 液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，20 g 葡萄糖，加水定容至1 L。

1.2 儀器設(shè)備

BJ-2CD 超凈工作臺，上海博訊實業(yè)有限公司；XT5107-IM250 霉菌培養(yǎng)箱，杭州雪中炭恒溫技術(shù)有限公司；MLS-3781L-PC 高壓蒸汽滅菌鍋，松下健康醫(yī)療器械株式會社；Scope.A1 型光學顯微鏡，德國 Carl Zeiss 公司；ZWY-2102C 恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；DDS-307A 電導率儀，上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 尖孢鐮刀菌對氯氟醚菌唑的敏感性測定

采用菌絲生長速率法[16-18]測定。在滅菌的PDA培養(yǎng)基中加入氯氟醚菌唑藥液，使其質(zhì)量濃度分別為 0、0.125、0.25、0.5、1 和2 μg/mL[13]。將尖孢鐮刀菌菌株在PDA 平板上預(yù)培養(yǎng)5 d 后，從菌落邊緣制取直徑為5 mm 的菌餅，轉(zhuǎn)接至上述含不同質(zhì)量濃度氯氟醚菌唑的PDA 平板中央。以不含藥劑的PDA 板作為對照。每處理重復3 次。在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)6 d 后，采用十字交叉法測量各處理的菌落直徑，按公式 (1) 計算各藥劑處理對菌絲生長的抑制率 (Im)。

式中：DC為對照組菌絲生長直徑，cm；DT為處理組菌絲生長直徑，cm；D0為菌餅直徑，cm。

利用SPSS 22.0 軟件，通過藥劑質(zhì)量濃度的對數(shù)值 (x) 與抑制率的幾率值 (y) 之間的線性回歸關(guān)系，求出毒力回歸方程、EC50值及相關(guān)系數(shù)r。

1.3.2 氯氟醚菌唑?qū)怄哏牭毒z生長及產(chǎn)孢量影響的評價 隨機選取10 株尖孢鐮刀菌分別在PDA 平板上進行黑暗培養(yǎng)。5 d 后從菌落邊緣取直徑為5 mm 的菌餅，轉(zhuǎn)移至含0.125、0.5 和2 μg/mL氯氟醚菌唑的PDA 平板上[19]，以不含藥劑的PDA平板作為對照，每處理3 個重復。培養(yǎng)6 d 后，采用十字交叉法測量菌落直徑，按公式 (1) 計算菌絲生長抑制率 (Im)。

參照宋化穩(wěn)等[20]的方法制備孢子懸浮液。將供試菌株在PDA 平板上活化，5 d 后從菌落邊緣打取直徑為5 mm 的菌餅，放置在藥劑質(zhì)量濃度為0.125、0.5 和2 μg/mL 氯氟醚菌唑的PDA 平板上培養(yǎng)，以不含藥劑的PDA 平板作為對照。培養(yǎng)6 d 后，加入5 mL ddH2O，用涂棒將菌絲表面的孢子刮下，用滅菌紗布過濾到三角錐形瓶中，加ddH2O 定容至10 mL，充分混勻用血球計數(shù)板采用五點取樣法統(tǒng)計孢子數(shù)量，每處理重復3 次。按公式 (2)和 (3) 計算各藥劑處理下的產(chǎn)孢量 (S)及產(chǎn)孢量抑制率 (Is)。

李小樹凝視著遠方，后來他收回視線平靜地對我說：“我很嚴肅。哥們兒，昨晚我考慮了整整一夜，我決定——去尋找許春花?！?/p>

式中：n為80 個小方格中孢子個數(shù)；d為稀釋倍數(shù)。

式中：Sc為對照組菌株的產(chǎn)孢量；Ss為處理組菌株的產(chǎn)孢量。

1.3.3 氯氟醚菌唑?qū)怄哏牭毒咦用劝l(fā)影響的測定 隨機選取2 株尖孢鐮刀菌在PDA 平板上活化，5 d 后從菌落邊緣打取直徑為5 mm 的菌餅，分別置于藥劑質(zhì)量濃度為0.125、0.5 和2 μg/mL氯氟醚菌唑的PDA 平板上培養(yǎng)，以不含藥劑的PDA 平板作為對照[21]。培養(yǎng)6 d 后，用無菌水分別洗下供試菌株的分生孢子，用滅菌紗布過濾，充分混勻，制得孢子懸浮液，用血球計數(shù)板計數(shù)觀察，將孢子懸浮液濃度調(diào)至106個/mL。取100 μL孢子懸浮液均勻涂布于含0.125、0.5 和2 μg/mL氯氟醚菌唑的WA 培養(yǎng)基平板上，于25 ℃下黑暗培養(yǎng)。分別于2、4、6、8、10 h 鏡檢觀察孢子萌發(fā)情況，每重復檢查孢子總數(shù)不少于200 個，以芽管長度達到孢子短直徑的1/2 視為萌發(fā)，記錄孢子總數(shù)及孢子萌發(fā)數(shù)。每處理重復3 次，以不含藥劑的WA 板為空白對照[20-21]。孢子萌發(fā)率(RG)按公式 (4) 計算。

式中：NG為孢子萌發(fā)數(shù)；NT為孢子總數(shù)。

1.3.4 氯氟醚菌唑?qū)怄哏牭毒毎ねㄍ感杂绊懙臏y定 隨機選取4 株尖孢鐮刀菌在PDA 上黑暗培養(yǎng)5 d 后，在菌落邊緣打取直徑為5 mm 的菌餅，接種至滅菌的250 mL PDB 培養(yǎng)基中，每瓶接種5 個菌餅，搖培5 d (28 ℃、175 r/min) 后，經(jīng)滅菌濾紙過濾沖洗，收集菌絲。稱取1.0 g 洗凈的菌絲，放入盛有40 mL 無菌水的離心管中，懸浮，用氯氟醚菌唑處理，設(shè)置質(zhì)量濃度梯度為0.125、0.25、0.5、1、2 μg/mL，以滴加等體積的無菌水作為對照[20-21]，每處理重復3 次。繼續(xù)搖培0、2、4、6、8、16 h 后，收集菌液，在25 ℃、5000 r/min 下高速離心10 min，取上清液測定電導率。

1.3.5 氯氟醚菌唑?qū)ξ骷t花球莖腐爛病的保護治療作用評價 隨機選取2 株尖孢鐮刀菌，用1.3.3 節(jié)方法制備，獲得各菌株濃度為106個/mL的孢子懸浮液，備用。400 g/L 氯氟醚菌唑懸浮劑用無菌水配制成有效成分質(zhì)量濃度梯度為0.125、0.5、2 μg/mL，備用。挑選健康的西紅花球莖，去皮后用無菌水洗凈后，晾干，分有傷和無傷處理。

治療作用測定：在西紅花球莖左右兩側(cè)均滴加20 μL 孢子懸浮液，以滴加等體積的無菌水作為對照，置于25 ℃ 12 h 光暗交替的光照培養(yǎng)箱中保濕 (相對濕度80%)培養(yǎng)，24 h 后每個球莖表面分別噴灑0、0.125、0.5、2 μg/mL 的氯氟醚菌唑200 μL[22]。

保護作用測定：在每個西紅花球莖表面分別噴灑0、0.125、0.5、2 μg/mL 的氯氟醚菌唑200 μL，置于25 ℃光暗12 h 交替的光照培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)，24 h 后每個球莖表面均滴加20 μL孢子懸浮液，以滴加等體積的無菌水作為對照[23]。

每處理3 個重復。7 d 后根據(jù)分級標準[24]調(diào)查發(fā)病情況：0 級，無病斑；1 級，病斑面積占整個球莖面積的5%以下；3 級，病斑面積占整個球莖面積的5%～20%；5 級，病斑面積占整個球莖面積的21%～50%；7 級，病斑面積占整個球莖面積的50%以上。按公式 (5)和(6) 計算各處理病情指數(shù)(ID) 及防治效果 (E)。

式中：NL為各級病球莖數(shù)；L為相對級數(shù)值；N為調(diào)查總球莖數(shù)；LMax最高病級。

式中：IDc為對照組病情指數(shù)；IDt為處理組病情指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 尖孢鐮刀菌對氯氟醚菌唑的敏感性

測定結(jié)果 (圖1) 顯示，氯氟醚菌唑?qū)┰嚨?2 株尖孢鐮刀菌的EC50值分布在0.182～2.491 μg/mL之間，平均EC50值為 (0.838 ± 0.438) μg/mL，敏感系數(shù)Rf(最高EC50值/最低EC50值) 為13.69。對EC50值進行正態(tài)性分布Kolmogorov-Smirnov 檢驗，顯著性P= 0.19 ＞ 0.05，表明82 株供試菌株對氯氟醚菌唑的敏感性分布符合正態(tài)分布。同時，供試菌株對氯氟醚菌唑的敏感性頻率分布呈現(xiàn)出一條連續(xù)的曲線。

圖1 尖孢鐮刀菌對氯氟醚菌唑的敏感性分布Fig.1 Distribution of sensitivity of F.oxysporum to mefentrifluconazole

2.2 氯氟醚菌唑?qū)ξ骷t花尖孢鐮刀菌菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響

結(jié)果 (表1) 表明，氯氟醚菌唑?qū)λ鶞y定菌株的菌絲生長有明顯的抑制作用。0.125 μg/mL 氯氟醚菌唑?qū)z生長的抑制率較低，隨著藥劑質(zhì)量濃度的增加，抑制率逐漸增強。對于產(chǎn)孢量，菌株XHH14 在0.125 μg/mL 下的抑制率僅為1.58%，2 μg/mL 時抑制率也僅為13.45%。對于其他菌株產(chǎn)孢量的抑制率也較低。表明氯氟醚菌唑?qū)怄哏牭毒木z生長的抑制作用較強。

表1 氯氟醚菌唑?qū)怄哏牭毒木z生長及產(chǎn)孢量的抑制作用Table 1 The inhibiting effect of mefentrifluconazole on mycelial growth and sporulation quantity of F.oxysporum

2.3 氯氟醚菌唑?qū)ξ骷t花尖孢鐮刀菌的孢子萌發(fā)的影響

測定結(jié)果 (圖2) 表明：2 h 時，各處理組的菌株孢子基本上均未萌發(fā)，與CK 處理相比，孢子萌發(fā)率被顯著抑制；隨著時間的推移，各處理組的孢子逐漸萌發(fā)，且漸與CK 無顯著性差異；到10 h 時各濃度處理的孢子萌發(fā)率均達80%以上，無顯著性差異。當CK 組孢子萌發(fā)率達95%時，0.5 μg/mL 氯氟醚菌唑處理組的孢子萌發(fā)率達93.03%，2 μg/mL 處理組的也達85.16%。結(jié)果表明，氯氟醚菌唑會推遲尖孢鐮刀菌孢子萌發(fā)的時間。

圖2 氯氟醚菌唑?qū)怄哏牭毒煌赕咦用劝l(fā)率的影響Fig.2 The effect of mefentrifluconazole on the germination rate of different F.oxysporum conidia

2.4 氯氟醚菌唑?qū)ξ骷t花尖孢鐮刀菌細胞膜通透性的影響

氯氟醚菌唑?qū)┰嚲旮髋囵B(yǎng)液的電導率測定結(jié)果如圖3 所示：0 h 時，CK 組與各處理組的電導率基本一致，隨著時間的延長，CK 組與各處理組培養(yǎng)液的電導率均表現(xiàn)出上升趨勢，且各處理組的電導率上升速率顯著高于CK 組。16 h 時各處理組電導率達到了最高值。此外，菌絲培養(yǎng)液的電導率會隨著藥劑處理濃度的升高而顯著增加。說明氯氟醚菌唑?qū)怄哏牭毒毎ぞ哂酗@著的破壞作用，能夠引起鐮刀菌電解質(zhì)的滲漏，從而導致菌絲培養(yǎng)液電導率的顯著增加。

2.5 氯氟醚菌唑?qū)ξ骷t花球莖腐爛病的保護治療作用

結(jié)果如表2 所示：在保護作用試驗中，施藥24 h 后接種孢子液，氯氟醚菌唑?qū)ξ骷t花球莖腐爛病有較好的保護作用，且隨著氯氟醚菌唑質(zhì)量濃度的升高，防治效果增加，2 μg/mL 氯氟醚菌唑處理的保護作用防治效果達83.87%。在治療作用試驗中，接種病菌后24 h 施藥，氯氟醚菌唑?qū)ξ骷t花球莖腐爛病的防治效果較差，0.125 μg/mL 氯氟醚菌唑的防治效果僅為18.18%～19.35%，2 μg/mL時治療效果最高，達到51.61%。表明氯氟醚菌唑?qū)ξ骷t花球莖腐爛病的保護作用防治效果優(yōu)于治療作用(圖4)。

表2 氯氟醚菌唑?qū)ξ骷t花球莖腐爛病的保護作用及治療作用防治效果Table 2 The control efficacy of protective and curative effect of mefentrifluconazole on saffron corm rot

圖4 氯氟醚菌唑?qū)ξ骷t花球莖腐爛病的保護治療作用Fig.4 Protective and curative effect of mefentrifluconazole on saffron corm rot

3 結(jié)論與討論

球莖腐爛病是西紅花種植栽培過程中發(fā)生較為嚴重的病害，但有關(guān)其防治方法的研究報道很少[24]，所用的農(nóng)藥品種也比較單一，基本以多菌靈、甲基硫菌靈、百菌清為主，但田間防治效果一般[25]。有研究表明，克菌丹、福美雙等老殺菌劑對西紅花球莖腐爛病菌菌絲生長和孢子萌發(fā)均有一定的抑制作用[26-27]。本文探究了新型DMIs 殺菌劑氯氟醚菌唑?qū)ξ骷t花球莖腐爛病菌的抑菌活性及作用方式，同時評估了其對西紅花球莖腐爛病的保護和治療效果。

氯氟醚菌唑目前已經(jīng)在馬鈴薯、黃瓜、蘋果、番茄等少數(shù)幾種作物上用于早疫病、白粉病、炭疽病等病害的防治，但尚未登記用于中藥材植物病害的防治。本研究測定了82 株西紅花球莖腐爛病菌對氯氟醚菌唑的敏感性，發(fā)現(xiàn)氯氟醚菌唑的EC50值分布在0.182～2.491 μg/mL 之間，平均EC50值為 (0.838 ± 0.438) μg/mL，敏感性頻率分布曲線符合正態(tài)分布。同時，氯氟醚菌唑可以有效抑制病原菌F.oxysporum的菌絲生長，且對菌絲生長的抑制作用優(yōu)于對產(chǎn)孢量的抑制。Li 等[21]研究表明，氯氟醚菌唑?qū)移咸焰呔鶥otrytis cinerea的平均EC50值為 (0.124 ± 0.025) μg/mL，對分生孢子芽管伸長的平均EC50值為 (0.015 ±0.008) μg/mL。崔一平等[28]研究發(fā)現(xiàn)，氯氟醚菌唑?qū)ο憬度~斑病、人參黑斑病等也具有良好的防治效果。表明氯氟醚菌唑具有廣譜的殺菌活性。

本研究發(fā)現(xiàn)，雖然氯氟醚菌唑不能抑制尖孢鐮刀菌的孢子萌發(fā)，但是會延遲孢子萌發(fā)的時間。另外，氯氟醚菌唑能夠通過破壞病原真菌的細胞膜，引起細胞電解質(zhì)的流失，從而導致細胞死亡。Li 等[21]發(fā)現(xiàn)，氯氟醚菌唑并不抑制B.cinerea分生孢子萌發(fā)，但能抑制芽管伸長，同時，氯氟醚菌唑能夠降低細胞中麥角甾醇含量并引起細胞膜通透性的改變。這一點在本研究中得到了證實，說明氯氟醚菌唑?qū)Σ煌参锊≡婢淖饔梅绞骄哂幸恢滦裕赐ㄟ^抑制14α-脫甲基酶活性，破壞病原菌細胞膜的形成，達到抑制病原菌芽管伸長與菌絲生長的作用，從而發(fā)揮其防治植物病害的作用。

通過在西紅花球莖上進行保護與治療作用的分析，發(fā)現(xiàn)提前24 h 噴施氯氟醚菌唑能夠更好地抑制F.oxysporum所引起的球莖腐爛病的發(fā)生。相同濃度下，氯氟醚菌唑?qū)颐共?、炭疽病和惡苗病等的保護作用同樣優(yōu)于治療作用[7,13,21]，本研究結(jié)果與其相一致。同時Gao 等[7]通過田間試驗發(fā)現(xiàn)，氯氟醚菌唑?qū)苯诽烤也∫灿休^好的保護作用。以上試驗表明，氯氟醚菌唑?qū).oxysporum引起的西紅花球莖腐爛病的保護活性顯著優(yōu)于治療活性，因此在氯氟醚菌唑的使用過程中，應(yīng)注意使用時機的把握，使其發(fā)揮出最優(yōu)的防治效果。

研究表明，西紅花球莖腐爛病化學防治最關(guān)鍵的是防治適期，田間種植期處理效果不佳，種植前處理種球是關(guān)鍵[29]。綜上所述，氯氟醚菌唑?qū)ξ骷t花球莖腐爛病的發(fā)生具有較好的活性，氯氟醚菌唑?qū)τ谟社牭毒鸬奈骷t花球莖腐爛具有良好的應(yīng)用前景，但后續(xù)還需要進一步開展田間防治試驗進一步確認防病效果及對西紅花球莖萌發(fā)、生長的安全性等。