◎ 吳 瓊，汪文俊，朱 林，徐小雷，宗 凱，韓 芳，葉 菁，余曉峰

（1.合肥海關(guān)技術(shù)中心，食品安全分析與檢測安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230022；2.黃山市茶產(chǎn)業(yè)促進(jìn)中心，安徽 黃山 245000）

百草枯是一種快速滅生性除草劑，能夠迅速被植物綠色組織吸收，可有效殺死一年或多年生雜草，在土壤中迅速與土壤結(jié)合而使其鈍化[1-3]。因此，它們曾長期被認(rèn)為是對環(huán)境無害類農(nóng)藥而在全球推廣使用，但百草枯對人和動物毒性極大，一旦誤服無藥可解，口服中毒死亡率在90%以上，我國是百草枯生產(chǎn)使用大國，也是中毒者數(shù)量最多的國家[4]?！妒称钒踩珖覙?biāo)準(zhǔn) 食品中百草枯等43 種農(nóng)藥最大殘留限量》（GB 2763.1 2018）發(fā)布后，食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)增加了百草枯在谷物和茶葉中的最大殘留限量要求，目前現(xiàn)行的《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》（GB 2763 2021）延續(xù)了百草枯在茶葉中的最大殘留限量要求（0.2 mg·kg-1）。國外標(biāo)準(zhǔn)中，歐盟對輸歐茶葉中百草枯殘留量作了規(guī)定，不得大于0.05mg·kg-1。

目前現(xiàn)行的百草枯檢測標(biāo)準(zhǔn)有《出口植物源性食品中百草枯和敵草快殘留量的測定 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》（SN/T 0293 2014）、《出口果蔬中百草枯檢測拉曼光譜法》（SN/T 4698 2016）和《稻米中百草枯殘留量的測定 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》（DB22/T 1622 2012），檢測方法主要包含液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法和拉曼光譜法等，檢測對象涉及水果蔬菜、玉米、稻米等植物源性食品。SN/T 0293 2014作為GB 2763 2021 指定的百草枯檢測方法，其適用范圍僅為大米、大豆、玉米、小麥、棉籽、干木耳、甘藍(lán)、蘋果、香蕉和草莓，未包含茶葉。直接使用該方法對茶葉中百草枯殘留量進(jìn)行檢測時存在溶劑用量大且回收率偏低的情況。覃重陽等[5]利用表面增強(qiáng)拉曼光譜法對茶葉中百草枯農(nóng)藥殘留進(jìn)行快速檢測，但該方法在分析不同茶葉中農(nóng)藥含量時存在基質(zhì)影響大的問題，普適性較差。目前主流的百草枯殘留量檢測方法仍為高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[6-15]。色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)具有選擇性好、定性能力強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，近年來較少有該方法對茶葉中百草枯殘留量的檢測研究報(bào)道。

本研究以茶葉為檢測對象，在《出口植物源性食品中百草枯和敵草快殘留量的測定 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》（SN/T 0293 2014）方法基礎(chǔ)上，采用固相萃取結(jié)合高效液相色譜三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，通過優(yōu)化前處理過程及儀器條件等，建立了一種準(zhǔn)確、高效測定茶葉中百草枯殘留量的方法。本方法定量限為5 μg·kg-1，可滿足國標(biāo)和歐盟對茶葉的限量要求，為完善百草枯檢測標(biāo)準(zhǔn)、監(jiān)控茶葉質(zhì)量安全和國家食品安全抽檢提供了技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實(shí)驗(yàn)中所用綠茶、紅茶、黑茶等茶葉樣品均購自黃山茶城。

甲醇、乙腈（色譜純，西隴科學(xué)）；甲酸（色譜純，阿拉?。话彼ǚ治黾?，阿拉?。怀兯杉兯畠x制得（Milli-Q，美國Millipore）；WCX 固相萃取柱（60 mg，3 mL，美國Waters）；百草枯二氯酸鹽（CAS：1910-42-5，100 mg·L-1，天津阿爾塔）。

1.2 儀器與設(shè)備

樣品磨（KN295，丹麥FOSS）；渦旋振蕩儀（Vortex-Genie 2，美國Scientific Industries）；分析天平（萬分之一，上海梅特勒）；固相萃取裝置（美國Waters）；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（1290II-6470，美國安捷倫）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液：移取1 mL 質(zhì)量濃度為100 mg·L-1的百草枯二氯鹽有證標(biāo)準(zhǔn)儲備液于100 mL 容量瓶中，用乙腈定容至刻度，得到1 mg·L-1百草枯二氯鹽標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：移取相應(yīng)體積的標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1 mg·L-1）用空白樣品基質(zhì)溶液稀釋，分別配制成質(zhì)量濃度為5.0 μg·L-1、10.0 μg·L-1、20.0 μg·L-1、50.0 μg·L-1、100.0 μg·L-1和200.0 μg·L-1的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.2 樣品前處理

取代表性的茶葉樣品500 g 經(jīng)樣品磨粉碎后充分混勻。稱取2.0 g 樣品于50 mL 具塞離心管中，加入20 mL 含5% FA 的甲醇水溶液，渦旋混勻3 min 后均質(zhì)提取2 min，4 000 r·min-1離心5 min，取上層提取液10 mL 到15 mL 聚乙烯離心管中，用5% NH4OH 水溶液調(diào)節(jié)pH 值至7.0 0.5，將上清液轉(zhuǎn)移至已經(jīng)過活化的固相萃取柱內(nèi)，控制流速，棄去流出液。依次用2 mL 水和2 mL 甲醇淋洗萃取柱，最后用4 mL 含10% FA 的乙腈溶液洗脫，控制流速，收集洗脫液于刻度離心管中，洗脫液經(jīng)45 ℃氮吹至干，取1 mL 乙腈-0.1% FA 水溶液溶解殘?jiān)^0.22 μm 濾膜后，供液相色譜三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀測定。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Thermo Syncronis HILIC（長度為100 mm，直徑為2.1 mm， 粒徑為1.7 μm）； 流動相A：0.1% FA 水溶液；流動相B：乙腈；梯度洗脫程序：0 ～3.0 min，5% A，3.0 ～5.0 min，5% ～90%A；5.0 ～8.0 min，90% A；8.0 ～8.1 min，90%～5%A；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：2 μL；流速：0.3 mL·min-1。

1.3.4 質(zhì)譜條件

離子化模式：電噴霧電離正離子模式（ESI+）；質(zhì)譜掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；干燥氣：氮?dú)?；鞘氣流速?0 L·min-1；輔助氣流速：3 L·min-1；離子傳輸管溫度：350 ℃；噴霧氣電壓：4 000 V；碰撞氣：氬氣，1.0 mTorr，質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 百草枯的質(zhì)譜條件表

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀自帶軟件工作站[Agilent Mass Hunter Quantitative Analysis（for QQQ）]進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制和樣液質(zhì)量濃度計(jì)算。采用Microsoft Office Excel 2013 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及統(tǒng)計(jì)圖表繪制，采用Win 10 自帶畫圖軟件進(jìn)行圖像輔助處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜與質(zhì)譜條件的優(yōu)化

接雙通注入質(zhì)量濃度為1 mg·L-1的百草枯標(biāo)準(zhǔn)溶液以優(yōu)化質(zhì)譜條件，通過全掃描模式（Q3 SCAN）優(yōu)化噴霧氣電壓、源內(nèi)碎裂電壓、干燥氣流速和離子傳輸管溫度等參數(shù)，得到對應(yīng)母離子186；再通過產(chǎn)物離子掃描模式（Product ion SCAN）找到對應(yīng)子離子；分別選擇響應(yīng)較優(yōu)的兩個產(chǎn)物離子作為定量和定性離子，分別為171 和155；最后在多反應(yīng)監(jiān)測（Multiple Reaction Monitoring，MRM）模式下根據(jù)響應(yīng)優(yōu)化碰撞能等參數(shù)[4]，具體參數(shù)見表1。

百草枯為親水強(qiáng)極性化合物，參考SN/T 0293 2014 方法采用親水性Syncronis HILIC 色譜柱進(jìn)行分離。流動相采用0.1% FA 水—乙腈流動相體系優(yōu)化峰形減少拖尾，同時提高離子化效率，利用優(yōu)化好的質(zhì)譜參數(shù)和色譜條件進(jìn)行MRM 分析，百草枯（0.2 mg·L-1）的總離子流圖與MRM 質(zhì)譜圖見圖1。

圖1 百草枯（0.2 mg·L-1）總離子流圖與MRM 質(zhì)譜圖

2.2 提取溶劑的優(yōu)化

百草枯呈堿性，易溶于水，在中性和酸性條件下穩(wěn)定。調(diào)研文獻(xiàn)[6-7,11]發(fā)現(xiàn)，大部分采用有機(jī)溶劑與稀酸混合溶液進(jìn)行提取，分別選擇相同體積甲醇/0.1 mol·L-1鹽酸溶液（1 ∶9）、乙腈/0.1 mol·L-1鹽酸溶液（1 ∶9）、含5% FA 的甲醇/水（1 ∶1）、含5% FA 的乙腈/水（1 ∶1）進(jìn)行溶劑萃取，考察實(shí)際茶葉樣品加標(biāo)的萃取效率。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，選擇含5%FA 的甲醇/水（1 ∶1）溶液萃取效率最佳，百草枯歸一化萃取效率見圖2。

圖2 不同提取溶劑歸一化萃取效率圖

2.3 固相萃取柱洗脫條件的優(yōu)化

茶葉樣品基質(zhì)較蔬菜水果復(fù)雜，提取液色素含量高，基質(zhì)效應(yīng)強(qiáng)，無法直接上機(jī)分析。為了獲得更好的凈化效果，采用固相萃取法凈化。百草枯為親水性強(qiáng)極性化合物，參考SN/T 0293 2014 方法，選用陽離子交換、混合型WCX 固相萃取柱進(jìn)行凈化。洗脫條件是決定回收率的關(guān)鍵因素，在0.2 mg·kg-1加標(biāo)濃度下，分別用含5%、10%、15% FA 的乙腈溶液作為洗脫液，進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，含10%、15%FA 的乙腈溶液的洗脫效率明顯優(yōu)于5%，而用10%和15% FA-乙腈時的洗脫效率相差不大，考慮到相同洗脫效率下優(yōu)先選擇含酸濃度低的乙腈溶液作為洗脫液，最終采用含10% FA 的乙腈進(jìn)行洗脫。不同洗脫溶劑歸一化洗脫效率結(jié)果見圖3。同時，實(shí)驗(yàn)考察了不同體積（2 mL、3 mL、4 mL 和5 mL）洗脫液的洗脫效率。在0.2 mg·kg-1的加標(biāo)濃度下，根據(jù)回收率結(jié)果最終選用4 mL 洗脫液洗脫。不同洗脫體積下的回收率結(jié)果見圖4。

圖3 不同洗脫溶劑歸一化洗脫效率圖

圖4 不同體積洗脫液洗脫歸一化回收率圖

2.4 線性關(guān)系、方法定量限、回收率和精密度實(shí)驗(yàn)

用空白基質(zhì)溶液配制質(zhì)量濃度為5.0 ～200.0 μg·L-1的百草枯系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，1.3 色譜和質(zhì)譜條件下進(jìn)樣，以百草枯定量離子171 色譜峰面積為y軸，質(zhì)量濃度為x軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，在相應(yīng)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，線性方程為y=307.51x-480.63，r2=0.999 86。

以3 倍信噪比確定檢出限，該方法百草枯檢出限為1 μg·kg-1，以10 倍信噪比確定定量限，該方法百草枯定量限為5 μg·kg-1。

為了考察該方法在不同茶葉中的適用性，分別選擇綠茶、紅茶、黑茶陰性樣品，在方法定量限（0.005 mg·kg-1）、歐盟茶葉限量（0.050 mg·kg-1）、標(biāo)曲最高點(diǎn)/國標(biāo)茶葉限量（0.200 mg·kg-1）3 個不同濃度水平下加標(biāo)，按照本研究方法進(jìn)行處理和測定，每個加標(biāo)水平做6 次平行實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)回收率和精密度實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表2 所示。結(jié)果表示，百草枯平均回收率為92.5%～103.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.2%～5.6%，準(zhǔn)確度和精密度滿足方法學(xué)要求。

表2 陰性樣品中百草枯加標(biāo)回收率和精密度表（n=6）

2.5 方法應(yīng)用

用本文建立的方法對市售20 份茶葉樣品進(jìn)行百草枯殘留量檢測，20 份樣品均無百草枯殘留檢出，市售樣品和陰性加標(biāo)樣品MRM 圖見圖5 和圖6。

圖5 市售樣品MRM 圖

圖6 茶葉加標(biāo)樣品MRM 圖

3 結(jié)論與討論

本文建立了一種茶葉中百草枯殘留量的固相萃取/高效液相色譜三重四極桿質(zhì)譜檢測法，茶葉樣品經(jīng)甲醇-甲酸水溶液提取后，采用WCX 固相萃取柱凈化，樣液在含0.1% FA 水-乙腈流動相體系經(jīng)親水性HILIC 色譜柱分離，采用電噴霧離子源正離子模式采集，多反應(yīng)監(jiān)測模式下檢測，外標(biāo)法定量。由于百草枯易產(chǎn)生柱殘留，在分析標(biāo)準(zhǔn)工作溶液與樣液之間可插入數(shù)針試劑空白，避免柱殘留產(chǎn)生的假陽性。該方法結(jié)果準(zhǔn)確，適用于各種茶類中百草枯殘留量的測定，方法定量限可滿足各國對茶葉中百草枯的限量要求，為完善百草枯檢測標(biāo)準(zhǔn)、監(jiān)控茶葉質(zhì)量安全、國家食品安全抽檢提供了技術(shù)支撐。