張笑丹 梁平 梁倞 王洪博 蘇江衛(wèi)

河北省胸科醫(yī)院1藥學(xué)部，3醫(yī)學(xué)裝備處，4試驗(yàn)部（石家莊 050041）；2河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院藥學(xué)部（石家莊 050011）

肝硬化是由一種或多種原因引起肝臟損害，也是各種肝病發(fā)展的晚期階段，常見病因包括藥物毒物、免疫紊亂、膽汁淤積、慢性酒精中毒、血吸蟲、病毒性肝病等［1-2］。肝硬化在臨床上主要表現(xiàn)為肝功能減退和門靜脈高壓，常出現(xiàn)多種并發(fā)癥［3］?，F(xiàn)代研究表明細(xì)菌易位及腸道菌群失調(diào)可導(dǎo)致肝硬化并發(fā)癥，而腸道上皮屏障功能障礙是導(dǎo)致細(xì)菌易位的重要因素。目前，隨著腸-肝軸理論的建立，肝硬化患者的腸道屏障功能得到了廣泛重視與研究［4］。有研究發(fā)現(xiàn)，隨著肝硬化患者肝臟儲(chǔ)備功能下降，腸道的通透性增加，可誘發(fā)肝腹水的發(fā)生［5-6］。因此研究肝臟儲(chǔ)備功能不同的肝硬化患者的腸道屏障功能，對(duì)其治療具有重要意義。初始CD4+T 細(xì)胞在IL-4 和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）聯(lián)合作用下可誘導(dǎo)分化為IL-9+IL-10+Foxp3-效應(yīng)性T 細(xì)胞，即Th9 細(xì)胞，是當(dāng)前新的CD4+效應(yīng)性T 細(xì)胞［7-8］。微生態(tài)制劑（Probioties），是指運(yùn)用微生態(tài)學(xué)原理，利用對(duì)宿主有益無(wú)害的益生菌或益生菌的促生長(zhǎng)物質(zhì)，經(jīng)特殊工藝制成的制劑，其作用主要是調(diào)整微生態(tài)失調(diào)，保持生態(tài)平衡，提高人體的健康水平，以達(dá)到防病、治病的效果［9-10］?？莶輻U菌二聯(lián)活菌腸溶膠囊也叫枯草桿菌二聯(lián)活菌腸溶膠囊，為典型的微生態(tài)制劑，能提高細(xì)胞活性，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫，調(diào)控巨噬細(xì)胞，抑制血小板黏附［11-12］，但是對(duì)腸道屏障功能與Th9 細(xì)胞表達(dá)的影響還尚不清楚。因此，本文具體探討了枯草桿菌二聯(lián)活菌腸溶膠囊對(duì)肝臟儲(chǔ)備功能不同的肝硬化患者的腸道屏障功能與Th9 細(xì)胞表達(dá)的影響，希望為此類疾病的研究和治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取我院2020年6月至2022年8月期間接受診療的肝硬化患者172 例作為研究對(duì)象，納入標(biāo)準(zhǔn)：18 ～65 歲；患者知情同意本研究；通過(guò)詢問(wèn)病挑選史、臨床檢查、實(shí)驗(yàn)室檢查、CT 檢查確診為肝硬化，符合“病毒性肝炎防治方案”中肝硬化的診斷標(biāo)準(zhǔn)；研究得到醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（編號(hào)：2020030619）。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）近2 周使用抗生素、微生態(tài)制劑及影響腸道菌群制劑；（2）合并嚴(yán)重的內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)疾病；（3）不能嚴(yán)格遵循醫(yī)囑導(dǎo)致治療無(wú)效者；合并肝癌患者；（4）精神疾病患者；（5）妊娠與哺乳期婦女。根據(jù)肝臟儲(chǔ)備功能不同分為Child-Pugh A 級(jí)（觀察組）72 例與Child-Pugh B-C 級(jí)（對(duì)照組）100 例，對(duì)比兩組患者的合并疾病、體重指數(shù)、性別、年齡、病程等資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 兩組一般資料對(duì)比Tab.1 Comparison of general information between two groups ±s

表1 兩組一般資料對(duì)比Tab.1 Comparison of general information between two groups ±s

組別觀察組對(duì)照組χ2/t 值P 值合并疾?。ㄌ悄虿?高血壓/高脂血癥）（例）例數(shù)72 100性別（男/女，例）38/34 55/45 0.223＞0.05年齡（歲）58.22 ± 2.48 58.02 ± 3.10 0.193＞0.05體質(zhì)指數(shù)（kg/m2）22.93 ± 2.14 23.33 ± 1.04 0.332＞0.05病程（年）5.20 ± 1.44 5.09 ± 1.33 0.183＞0.05 13/12/10 18/16/15 0.241＞0.05

1.2 治療方法 所有患者都在常規(guī)治療手段的基礎(chǔ)上加用腸道益生菌制劑治療，口服枯草桿菌二聯(lián)活菌腸溶膠囊（枯草桿菌二聯(lián)活菌腸溶膠囊，北京韓美藥品有限公司制造），500 mg/次，3 次/d。常規(guī)治療包括保肝、利尿、降低門脈壓力、退黃等處理。所有患者治療觀察14 d。

1.3 觀察指標(biāo) （1）療效標(biāo)準(zhǔn)：顯效：天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）檢查正常，臨床癥狀與體征改善明顯。有效：ALT 與AST比正常值上限小2 倍，臨床癥狀與體征顯著減輕；無(wú)效：惡化或未達(dá)到上述標(biāo)準(zhǔn)。（有效+顯效）/本組例數(shù)×100%=總有效率。（2）檢測(cè)腸道屏障功能：在治療前后留取足量糞便標(biāo)本，放置于-70 ℃冰箱內(nèi)保存，收齊標(biāo)本后統(tǒng)一檢測(cè)腸桿菌、乳酸桿菌、白色念珠菌、腸球菌、雙歧桿菌等菌屬的含量，以百分比進(jìn)行表述。（3）炎癥因子變化對(duì)比：在治療前后抽取空腹時(shí)靜脈血3 mL，1 000 r/min共離心5 min，選擇上清血清，采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)炎癥因子［（白介素-6（IL-6）與腫瘤壞死因子-α（TNF-α）］的表達(dá)。（4）Th9 細(xì)胞檢測(cè)：采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血Th9 細(xì)胞含量，每個(gè)樣品設(shè)置三個(gè)復(fù)孔，取檢測(cè)的平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 21.00 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用±s表示計(jì)量資料，對(duì)比方法為χ2檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)等，性別等計(jì)數(shù)資料采用百分比表示，P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)比兩組總有效率 對(duì)比觀察組與對(duì)照組治療后的總有效率分別為98.6%和89.0%，觀察組優(yōu)于對(duì)照組（P＜0.05）。見表2。

表2 對(duì)比兩組總有效率Tab.2 Compare the total effective rate of two groups 例

2.2 腸道菌群變化對(duì)比 兩組治療前腸道菌屬比較無(wú)明顯差異（P＞0.05）；觀察組治療后雙歧桿菌屬及乳酸桿菌屬較治療前有顯著增加（P＜0.05），白色念珠菌屬較治療前有明顯的降低（P＜0.05），對(duì)比治療前后對(duì)照組腸道菌群差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 兩組治療前后腸道菌群變化對(duì)比Tab.3 Comparison of changes in gut microbiota between two groups before and after treatment %，±s

表3 兩組治療前后腸道菌群變化對(duì)比Tab.3 Comparison of changes in gut microbiota between two groups before and after treatment %，±s

注：與治療前對(duì)比，*P ＜0.05；與對(duì)照組對(duì)比，#P ＜0.05

菌群腸桿菌屬腸球菌屬雙歧桿菌屬乳酸桿菌屬白色念珠菌屬觀察組（n = 72）治療前15.67 ± 2.42 18.23 ± 3.02 24.02 ± 3.11 20.34 ± 2.44 20.00 ± 2.94治療后16.29 ± 2.11 18.33 ± 3.92 27.99 ± 3.93*#23.87 ± 3.02*#18.39 ± 3.90*#對(duì)照組（n = 100）治療前15.89 ± 2.22 17.90 ± 3.20 24.67 ± 3.10 20.54 ± 3.14 20.34 ± 2.84治療后16.09 ± 2.11 18.33 ± 2.94 25.55 ± 3.39 21.98 ± 3.11 21.88 ± 4.11

2.3 炎癥因子變化對(duì)比 對(duì)比兩組治療后血清TNF-α 與IL-6 值，觀察組與對(duì)照組均低于治療前（P＜0.05），且治療后觀察組低于對(duì)照組（P＜0.05）。見表4。

表4 對(duì)比兩組患者治療前后的血清炎癥因子變化Tab.4 Comparison of changes in serum inflammatory factors between two groups of patients before and after treatment ng/mL，±s

表4 對(duì)比兩組患者治療前后的血清炎癥因子變化Tab.4 Comparison of changes in serum inflammatory factors between two groups of patients before and after treatment ng/mL，±s

注：與治療前對(duì)比，*P ＜0.05；與對(duì)照組對(duì)比，#P ＜0.05

菌群IL-6 TNF-α觀察組（n = 72）治療前288.36 ± 14.98 289.65 ± 20.37治療后95.67 ± 18.54*#120.97 ± 22.34*#對(duì)照組（n = 100）治療前8.64 ± 1.55 8.66 ± 1.34治療后2.65 ± 0.98*5.01 ± 0.98*

2.4 Th9 細(xì)胞變化對(duì)比 治療后觀察組與對(duì)照組的Th9 細(xì)胞分別為（0.11±0.05）%和（0.32±0.10）%（P＜0.05），均低于治療前的（0.82 ± 0.32）%和（0.83 ± 0.24）%，觀察組Th9 細(xì)胞治療后低于對(duì)照組（P＜0.05）。見表5。

表5 對(duì)比兩組患者治療前后Th9 細(xì)胞變化Tab.5 Comparison of changes in Th9 cells between two groups of patients before and after treatment %，±s

表5 對(duì)比兩組患者治療前后Th9 細(xì)胞變化Tab.5 Comparison of changes in Th9 cells between two groups of patients before and after treatment %，±s

組別觀察組對(duì)照組t 值P 值例數(shù)72 100治療前0.82 ± 0.32 0.83 ± 0.24 0.045＞0.05治療后0.11 ± 0.05 0.32 ± 0.10 7.298＜0.05 t 值33.294 25.682 P 值＜0.05＜0.05

3 討論

目前，肝硬化發(fā)病率依然較高，發(fā)病高峰年齡在35 ～48 歲［13］。肝硬化早期無(wú)明顯臨床表現(xiàn)，隨著病情的發(fā)展，肝功能逐漸減退，可誘發(fā)肝功能衰竭?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為肝硬化可逆轉(zhuǎn)，但缺乏理想的針對(duì)性治療藥物，且停藥后常會(huì)復(fù)發(fā)。肝臟儲(chǔ)備功能是反映肝功能狀態(tài)的主要指標(biāo)，一般采用Child-pugh 分級(jí)進(jìn)行判定，Child-pugh 分級(jí)越高，肝臟儲(chǔ)備功能越差［14-15］。當(dāng)前研究表明肝硬化患者可出現(xiàn)腸道屏障功能障礙，由此產(chǎn)生的腸道細(xì)菌紊亂是引起肝硬化進(jìn)一步惡化和促進(jìn)肝性腦病發(fā)生的重要因素［16］。腸道是機(jī)體最大的內(nèi)毒素池，內(nèi)毒素可通過(guò)腸粘膜屏障經(jīng)門靜脈進(jìn)入肝臟，肝硬化患者中血清中可以檢測(cè)到內(nèi)毒素水平變化［17］。內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌的主要重要組成，在患者腸道屏障被破壞、腸道通透性增加時(shí)，可以被釋放入血液。有研究表明肝硬化腸道菌群失調(diào)，主要表現(xiàn)為白色念珠菌等的增加，有益菌如雙歧桿菌、乳酸桿菌的減少［18］。微生態(tài)制劑不僅可以糾正腸道菌群紊亂而且能抑制腸道細(xì)菌發(fā)生易位，對(duì)腸黏膜屏障功能起到恢復(fù)和保護(hù)作用?？莶輻U菌二聯(lián)活菌腸溶膠囊對(duì)調(diào)節(jié)人體腸道菌群失調(diào)有顯著功效，其含有枯草桿菌和屎腸球菌兩種活菌，對(duì)致病菌的生長(zhǎng)有一定的抑制作用，但對(duì)腸道內(nèi)有益菌的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用［19］。本研究顯示治療后觀察組與對(duì)照組的總有效率分別為98.6%和89.0%，觀察組優(yōu)于對(duì)照組。且觀察組治療后雙歧桿菌屬及乳酸桿菌屬較治療前有顯著增加，白色念珠菌屬較治療前有明顯的降低，而對(duì)照組治療前后腸道菌群比較無(wú)明顯差異。從機(jī)制上分析，枯草桿菌二聯(lián)活菌腸溶膠囊本身的雙歧桿菌可平衡腸道菌群種類和數(shù)量的改變，同時(shí)枯草桿菌二聯(lián)活菌腸溶膠囊本身可以促進(jìn)腸道有益菌的生長(zhǎng)，也可以直接分泌代謝物質(zhì)提高腸道免疫功能［20］。也有研究發(fā)現(xiàn)枯草桿菌二聯(lián)活菌腸溶膠囊可有效治療肝硬化合并自發(fā)性腹膜炎，顯改善肝硬化患者肝功能，對(duì)腸道菌群生長(zhǎng)的微環(huán)境有明顯改善，對(duì)腸道菌群失調(diào)起到調(diào)節(jié)作用［21］。同時(shí)枯草桿菌能利用自身產(chǎn)生的多種消化酶分解纖維蛋白、脂肪等物質(zhì)，促進(jìn)消化吸收，從而抑制腸道內(nèi)有害細(xì)菌過(guò)度繁殖，調(diào)整腸道菌群［22］。

腸道微生物衍生的化合物及其影響的信號(hào)通路與肝硬化的進(jìn)展有關(guān)。而TNF-α 是判斷腸道屏蔽功能的重要指標(biāo)，可破壞腸上皮細(xì)胞的屏蔽功能，增加腸黏膜的通透性，另外TNF-α 也可加重肝細(xì)胞的損傷和形成內(nèi)毒素血癥，從而促進(jìn)其他炎性因子和氧自由基的大量釋放［23-24］。研究發(fā)現(xiàn)，腸道神經(jīng)細(xì)胞可通過(guò)分泌的IL6 起到抑制調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞水平的作用，在神經(jīng)細(xì)胞特異性缺失IL6 的腸道中，調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞水平有所上升。另外，調(diào)節(jié)性細(xì)胞誘導(dǎo)菌很有可能是通過(guò)降低腸道神經(jīng)系統(tǒng)密度和神經(jīng)細(xì)胞IL6 水平的雙重作用，來(lái)誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的［25］。本研究顯示對(duì)比兩組治療后血清TNF-α 與IL-6 值，觀察組與對(duì)照組均低于治療前，且治療后觀察組低于對(duì)照組。提示枯草桿菌二聯(lián)活菌腸溶膠囊可降低肝硬化患者IL-6 與TNF-α 的水平，來(lái)改善肝臟炎癥和腸道屏蔽功能。也有研究［26］表明微生態(tài)制劑對(duì)非產(chǎn)氨乳酸桿菌數(shù)量的增加有顯著促進(jìn)作用，有效降低患者內(nèi)毒素血癥及血氨，50%患者的Child-Pugh 評(píng)分得到改善，這與本研究結(jié)果具有一致性。

Th9 細(xì)胞是一種新型CD4+輔助性T 細(xì)胞亞群，主要分泌IL-9，在炎癥性腸病等自身免疫性疾病發(fā)揮重要作用，IL-9 通過(guò)與IL-9R 結(jié)合激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)依賴性JAK-STAT 途徑發(fā)揮生物學(xué)功能［27］。不過(guò)在不同的微環(huán)境中，Th9 細(xì)胞發(fā)揮不同的免疫調(diào)節(jié)功能，研究［28］發(fā)現(xiàn)乙肝肝硬化患者中Th9 細(xì)胞顯著升高，同時(shí)也表現(xiàn)為腸道屏障功能紊亂，兩者相互促進(jìn)并參與乙肝肝硬化的發(fā)生與發(fā)展。本研究顯示治療后觀察組與對(duì)照組的Th9 細(xì)胞都低于治療前，觀察組治療后Th9 細(xì)胞低于對(duì)照組，表明枯草桿菌二聯(lián)活菌腸溶膠囊在治療肝臟儲(chǔ)備功能良好的肝硬化患者中能減少Th9 細(xì)胞，將為明確肝硬化的發(fā)病機(jī)制及治療提供新的理論和線索。

總之，相對(duì)于肝臟儲(chǔ)備功能差的患者，枯草桿菌二聯(lián)活菌腸溶膠囊在肝臟儲(chǔ)備功能良好的肝硬化患者中的應(yīng)用能改善腸道屏障功能，抑制Th9細(xì)胞表達(dá)，抑制炎癥因子的表達(dá)，從而更好的發(fā)揮治療效果。

【Author contributions】ZHENG Xiaodan performed the experiments and wrote the article.WANG Hongbo performed the experiments.LIANG Ping and LIANG Jing revised the article.SU Hongwei designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.