紀 達，楊玉梅，姚俊杰，王益海，張書海

（1.貴州大學漁業(yè)資源與環(huán)境研究中心，貴陽 550025；2.貴州大學高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴陽 550025；3.黔東南州水產(chǎn)技術(shù)推廣站，貴州凱里 556000）

鯉（Cyprinuscarpio）是亞歐大陸?zhàn)B殖范圍最廣、歷史最悠久的淡水魚［1］，經(jīng)過歷史上長期的自然選擇與近代人工雜交選育過程，形成了極為豐富的鯉的品種。遺傳資源的多樣性為鯉的遺傳育種提供了便利。截止到2018年，我國已有29個鯉新品種獲得水產(chǎn)新品種認定［2］。近年來，由于大規(guī)模的養(yǎng)殖開發(fā)，導致很多鯉的品種遺傳多樣性降低［3－5］。遺傳多樣性水平直接關(guān)系到鯉的生產(chǎn)價值，通過對鯉群體遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)的研究，可以評價其種質(zhì)資源現(xiàn)狀和種群進化關(guān)系［6］。

線粒體DNA（mtDNA）具有母系遺傳、進化速度快等特點，線粒體基因片段ND3、D-loop區(qū)、細胞色素b基因（cytochrome b，Cytb）、COI等已作為一些魚類遺傳多樣性的標記［7－12］。Cytb的結(jié)構(gòu)和功能清晰，豐富的堿基含量可以更客觀地反映出密碼子使用的偏倚性［13］。同時，Cytb基因可以靈敏地反映出生物的進化情況，是研究水產(chǎn)動物遺傳多樣性和系統(tǒng)進化的重要基因［14］。

目前，對于貴州鯉遺傳多樣性的研究主要見于野生群體，如袁振興等［15］采用PCR和DNA測序技術(shù)對野生都柳江鯉mtDNA D-loop區(qū)進行測序分析，發(fā)現(xiàn)都柳江鯉遺傳多樣性較高；向燕等［16］研究了清水江鯉線粒體COI基因序列及遺傳多樣性；董在杰等［17］基于微衛(wèi)星標記發(fā)現(xiàn)，清水江鯉遺傳多樣性較高。貴州省鯉的種類大多為稻田、池塘、循環(huán)水等養(yǎng)殖群體，對于貴州省養(yǎng)殖鯉群體遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)的研究尚未見報道，其遺傳多樣性、遺傳背景現(xiàn)狀尚不明確。因此，本研究基于線粒體DNACytb基因，對貴州7個鯉養(yǎng)殖群體進行遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)分析，以期明確貴州省養(yǎng)殖鯉群體種質(zhì)資源現(xiàn)狀，為貴州養(yǎng)殖鯉的良種選育提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗所用松浦鏡鯉（CyprinuscarpioSongpu）、松浦紅鏡鯉（CyprinuscarpioSongpu red mirror）、興國紅鯉（Cyprinuscarpiovar.singuonensis）取自遵義市華利興農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，建鯉（Cyprinus carpiovar.Jian）取自龍里縣灣灘河稻田養(yǎng)魚試驗田，福瑞鯉（Cyprinuscarpio，F(xiàn)FRC strain common carp）取自遵義市紅笑康循環(huán)農(nóng)業(yè)科技有限公司，都勻紅鯉（CyprinuscarpioDuyun）取自都勻市勻東鎮(zhèn)楊里生態(tài)種養(yǎng)殖有限公司，金背鯉（Cyprinus carpiovar.Jinbei）取自黃平縣舊州鎮(zhèn)稻田養(yǎng)魚基地（表1），共152尾。

表1 采樣信息Tab.1 Sam p ling inform ation

1.2 基因組DNA的提取與檢測

剪取鮮活鯉個體背部肌肉，無水乙醇－20℃保存。采用擎科生物科技有限公司的動物基因組提取試劑盒提取DNA，獲得的DNA樣品采用分光光度計檢測，樣品OD值均在1.8～2.0范圍，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 線粒體DNA Cyt b區(qū)PCR擴增

PCR采用25μL體系，DNA模板1μL，上下游引物各1μL，金牌MIX（擎科生物科技有限公司）22μL。引物序列為F1：5′-AAAATCGCTAAC GACGCACT；Y1：5′-AACCATCCTGCTAGTGGCATA。PCR擴增條件為：98℃預變性3 min，98℃變性10 s，58℃退火10 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)，最后72℃終延伸1 min。產(chǎn)物用1%的瓊脂糖進行凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察產(chǎn)物長度與濃度，PCR原液委托擎科生物科技有限公司進行雙向測序。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

運用ClustalX 1.81軟件對測序結(jié)果進行人工拼接［18］；運用MEGA 6.0軟件統(tǒng)計堿基含量和各群體間的遺傳距離，使用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹［19］；運用DnaSP 5.0軟件統(tǒng)計單倍型（Hap）種類和數(shù)量，并計算單倍型多樣性指數(shù)（Hd）、核苷酸多樣性指數(shù)（Pi），繪制歧點分布曲線圖［20］；運用Network 5.0構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)圖［21］；運用Arlequin 3.5計算遺傳分化指數(shù)（Fst），進行分子變異方差分析，以1 000次置換分析顯著性［22］；基因流（Nm）按照公式Nm≈（1－Fst）／4Fst計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 7個鯉群體Cyt b基因堿基組成

對152尾鯉線粒體DNACytb基因進行擴增與測序，將測序結(jié)果兩端不穩(wěn)定部分裁剪，保留900 bp左右的序列用于進一步的分析。Cytb序列中，A、T、C、G 4種堿基平均含量分別為28.9%、26.5%、30.4%、14.2%，其中，A＋T含量為55.4%，C＋G含量為44.6%（表2）。

表2 7個鯉群體Cyt b序列堿基組成（n=152）Tab.2 Base com position of Cyt b sequences in 7 populations of C.carpio（n=152）

2.2 基于Cyt b序列的遺傳多樣性參數(shù)

基于Cytb序列分析，7個鯉養(yǎng)殖群體共界定出16種單倍型，整體單倍型多樣性指數(shù)（Hd）和核苷酸多樣性指數(shù)（Pi）分別為0.792和0.003 23。其中，金背鯉群體單倍型多樣性指數(shù)最高，達到0.913，福瑞鯉群體單倍型多樣性指數(shù)最低，僅為0.091；都勻紅鯉群體核苷酸多樣性指數(shù)最高，為0.004 95，福瑞鯉核苷酸多樣性指數(shù)最低，僅為0.000 10（表3）。

表3 7個鯉群體線粒體Cyt b序列的遺傳多樣性參數(shù)（n=152）Tab.3 Genetic diversity parameters ofm itochondrial Cyt b sequences in 7 populations of C.carpio（n=152）

2.3 NJ系統(tǒng)樹與單倍型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)

用Network 5.0軟件基于Cytb序列繪制單倍型網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果顯示：各單倍型交織在一起，各群體之間均未形成明顯的譜系結(jié)構(gòu)，Hap7在7個群體中分布最多，除都勻紅鯉和福瑞鯉外，其余5個群體中均有分布；7個鯉群體間沒有共享單倍型（圖1）。

圖1 基于Cyt b序列構(gòu)建的7個鯉群體單倍型網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 Haplotype network based on Cyt b sequences in 7 populations of C.carpio

Cytb基因NJ樹顯示，建鯉與福瑞鯉聚成一支，節(jié)點布展值為87；松浦鏡鯉與松浦紅鏡鯉聚成一支，節(jié)點布展值為63；都勻紅鯉與金背鯉聚成一支，節(jié)點布展值為96（圖2）。

圖2 基于Cyt b基因的7個鯉群體NJ進化樹Fig.2 NJ evolutionary tree of 7 populations of C.carpio based on Cyt b gene

2.4 貴州7個鯉養(yǎng)殖群體間的遺傳分化

基于Cytb基因，貴州省7個鯉養(yǎng)殖群體間的遺傳距離在0.001至0.005之間，遺傳距離普遍較近，其中松浦鏡鯉與松浦紅鏡鯉群體間的遺傳距離最小，僅為0.001（表4）。

表4 基于Cyt b基因的7個鯉群體間及群體內(nèi)遺傳距離Tab.4 Genetic distances between and w ithin populations of 7 populations of C.carpio based on Cyt b gene

基于Cytb序列，7個鯉養(yǎng)殖群體間的遺傳分化系數(shù)Fst值范圍在0.049 46～0.968 21。其中，福瑞鯉群體和松浦鏡鯉群體間的Fst值最大，為0.968 21（表5）。統(tǒng)計檢驗結(jié)果顯示，7個群體均未達到極顯著差異（P＞0.001）。

表5 7個鯉群體間的遺傳分化指數(shù)（F st）與基因流（N m）Tab.5 Values of genetic differentiation coefficient F st and gene flow N m among 7 populations of C.carpio

基因流（Nm）計算結(jié)果顯示，建鯉群體與金背鯉群體基因流（Nm）值為4.805，松浦鏡鯉群體與松浦紅鏡鯉群體基因流（Nm）值為2.238，其余群體間基因流（Nm）值均小于1.000（表5）。

AMOVA分析結(jié)果顯示，基于Cytb基因群體間、群體內(nèi)分子變異率分別為41.630 39%、58.369 61%（表6），群體間與群體內(nèi)變異比近似1∶1。群體總的遺傳分化指數(shù)Fst值為0.416 30，達到了極顯著差異水平（P＜0.000 1）。

表6 基于Cyt b基因的分子變異方差分析Tab.6 Analysis ofmolecular variance（AMOVA）based on Cyt b gene

2.5 貴州7個鯉養(yǎng)殖群體種群歷史動態(tài)

基于Cytb基因，結(jié)合中性檢驗和歧點分布曲線圖（圖3），對貴州7個鯉養(yǎng)殖群體進行歷史動態(tài)研究。Fu’sFs和Tajima’sD檢驗結(jié)果顯示，均未出現(xiàn)顯著性差異的負值（P＞0.05）（表3）。歧點分布曲線圖顯示，7個鯉養(yǎng)殖群體的錯配分布曲線均未呈現(xiàn)單峰型（圖3），表明貴州7個鯉養(yǎng)殖群體歷史上均未出現(xiàn)種群擴張。

圖3 基于Cyt b基因的7個鯉養(yǎng)殖群體歧點分布曲線圖Fig.3 Graph ofm ismatch distribution of 7 cultured C.carpio populations based on Cyt b gene

3 討論

3.1 貴州7個鯉養(yǎng)殖群體遺傳多樣性現(xiàn)狀

根據(jù)WAS和BOWEN［23］將單倍型多樣性指數(shù)、核苷酸多樣性指數(shù)分別以0.5、0.005作為高低的分界線，貴州7個鯉養(yǎng)殖群體遺傳多樣性水平整體偏低，松浦鏡鯉、松浦紅鏡鯉、福瑞鯉均屬于低單倍型多樣性、低核苷酸多樣性類型。松浦紅鏡鯉、松浦鏡鯉和福瑞鯉的單倍型多樣性指數(shù)、核苷酸多樣性指數(shù)均較低，松浦紅鏡鯉分別為0.100、0.000 11；松浦鏡鯉分別為0.395、0.000 45；福瑞鯉分別為0.091、0.000 10，每個群體均僅檢測出兩個單倍型，遺傳多樣性極度匱乏，原因可能是近親繁殖導致多樣性降低，因此對這3種鯉的保護已迫在眉睫，建議擴大選育范圍，定期從外地良種場引進親本，以提高遺傳多樣性水平。以上結(jié)果從另一角度也說明，貴州省鯉養(yǎng)殖群體種質(zhì)純度高，基因污染程度低。

值得一提的是，根據(jù)鯉的養(yǎng)殖方式，金背鯉、建鯉、都勻紅鯉屬于稻田養(yǎng)殖，松浦鏡鯉、松浦紅鏡鯉、興國紅鯉屬于池塘養(yǎng)殖，福瑞鯉屬于循環(huán)水養(yǎng)殖，將3種養(yǎng)殖方式對比發(fā)現(xiàn)，稻田養(yǎng)殖的3種鯉遺傳多樣性明顯高于池塘和循環(huán)水養(yǎng)殖的幾種鯉。后續(xù)通過跟蹤調(diào)研發(fā)現(xiàn)，進行池塘養(yǎng)殖的企業(yè)，常年沒有定向引種，導致池塘養(yǎng)殖鯉在小群體的基礎(chǔ)上近親繁殖，白云等［4］和楊正玲等［24］先后研究發(fā)現(xiàn)，小群體基礎(chǔ)上的繁殖使州河鯉（C.carpioheamatopterus）遺傳多樣性下降。由此可見，長期自繁自育，可能是池塘、循環(huán)水養(yǎng)殖鯉群體遺傳多樣性匱乏的一個重要原因。相比之下，稻田養(yǎng)殖的鯉，成魚當年9、10月份全部售空，第二年需要向不同地區(qū)的苗種廠引進魚苗，相比于池塘、循環(huán)水養(yǎng)殖鯉，一定程度上擴大了繁殖群體，進而避免了種群遺傳多樣性的下降。

貴州省稻田養(yǎng)殖金背鯉、建鯉群體為高單倍型多樣性、低核苷酸多樣性類型，楊博等［25］、向燕等［16］分別對鱇浪白魚（Anabariliusgrahami）和青水江鯉線粒體DNA進行遺傳分析，發(fā)現(xiàn)所研究群體也呈現(xiàn)高單倍型多樣性、低核苷酸多樣性情況。向燕等［16］推測，研究的群體是由一個數(shù)量較小的有效種群擴張而成。據(jù)此推斷，近年來，隨著貴州省稻田養(yǎng)魚的發(fā)展，數(shù)量較少的金背鯉、建鯉群體在貴州省短期內(nèi)發(fā)生小型擴張，加上單倍型多樣性較核苷酸多樣性短時間內(nèi)積累更快［26］，從而表現(xiàn)為高單倍型多樣性、低核苷酸多樣性的特點。

3.2 貴州省7個鯉養(yǎng)殖群體的遺傳分化

NJ樹顯示，建鯉、福瑞鯉先聚成一支，再共同與興國紅鯉聚成一支，松浦鏡鯉和松浦紅鏡鯉聚成一支，都勻紅鯉與金背鯉聚成一支。福瑞鯉是以黑龍江野鯉和黃河鯉為親本，歷經(jīng)5代選育而成［27］，建鯉則是由荷包紅鯉與沅江鯉雜交選育而成［28］，荷包紅鯉與興國紅鯉、玻璃紅鯉并稱“江西三紅”，研究表明，“江西三紅”親緣關(guān)系很近［29－30］；松浦鏡鯉與松浦紅鏡鯉均是由散鱗鏡鯉與其他鯉雜交選育而成［31－32］。這就不難解釋，建鯉、福瑞鯉和興國紅鯉共同聚成一支，松浦鏡鯉和松浦紅鏡鯉聚成一支。在形態(tài)方面，都勻紅鯉與金背鯉背鰭兩側(cè)均有兩條穩(wěn)定遺傳的金色條紋、頭蓋骨上均有形似金色蝴蝶的圖案，區(qū)別在于都勻紅鯉體色更偏暗紅，可見都勻紅鯉與金背鯉親緣關(guān)系很近。

單倍型網(wǎng)絡(luò)圖顯示，貴州7個鯉養(yǎng)殖群體間沒有形成明顯的譜系結(jié)構(gòu)，沒有共享單倍型，僅Hap7被5個鯉群體共享。值得一提的是，Hap12～16 為金背鯉群體特有單倍型。POBEDINTSEVA等［33］2021年在西西伯利亞南部湖泊和河流里的普魯士鯉（Prussian carp）中發(fā)現(xiàn)一種特有單倍型，可以作為普魯士鯉的鑒定標準之一。目前，對于金背鯉的精準鑒定還沒有較好的方法，本研究發(fā)現(xiàn)的這5個特有單倍型可以為金背鯉的種質(zhì)鑒定提供參考。

群體間遺傳分化方面，AMOVA分析顯示，7個鯉養(yǎng)殖群體基因的群體間遺傳變異率高達41.630 39%（表6），依據(jù)WRIGHT［34］提出的群體中度遺傳分化的判斷標準是群體間遺傳變異率在5% ～15%，貴州省7個鯉養(yǎng)殖群體總體遺傳分化程度較高。相對而言，建鯉和金背鯉、松浦鏡鯉和松浦紅鏡鯉遺傳分化程度很低。參考BALLOUX和NICOLAS［35］提出的群體遺傳分化標準：當Fst＜0.05時，表示群體間無遺傳分化，當0.05≤Fst＜0.15時，表示群體間產(chǎn)生了較小的遺傳分化。松浦紅鏡鯉與松浦鏡鯉群體間Fst＝0.100 48，表明僅產(chǎn)生較小遺傳分化；建鯉與金背鯉群體間Fst＝0.049 46，表明群體間無遺傳分化?；蛄鱊m也顯示，僅這兩對群體基因流Nm值大于1.000（表5），表明這兩對群體間正進行著密切的基因交流。建鯉和金背鯉同為稻田養(yǎng)殖，通過調(diào)研發(fā)現(xiàn)，貴州省稻田養(yǎng)魚的主體大多為農(nóng)戶，防范種質(zhì)污染意識相對薄弱，稻田中金背鯉和建鯉有混養(yǎng)情況，二者基因交流頻繁、遺傳分化程度低，可能與此有關(guān)。因此，對于“稻田鯉魚”的種質(zhì)污染情況，今后應更加引起重視。