徐 瑞，陳素文，段亞飛，張文文，王 珺，周傳朋，王 蕓

（1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點實驗室，廣州 510300）

帚狀江蘺（Gracilariaedulis），隸屬于紅藻門（Rhodophyta），江蘺目（Gracilariales），江蘺科（Gracilariaceae），江蘺屬，是一種主要分布于海南省和廣東省沿海的大型海藻［1－2］。帚狀江蘺不僅具有改善水體環(huán)境、修復(fù)生態(tài)系統(tǒng)的功能［3－4］，且富含海藻多糖、藻膠、多種氨基酸和微量元素，是生產(chǎn)工業(yè)瓊膠和制作水產(chǎn)動物餌料的重要原料［5－7］。最新研究表明，帚狀江蘺提取物在抗菌和抑制腫瘤細(xì)胞增殖等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域亦發(fā)揮作用［8－10］。目前獲得帚狀江蘺的途徑主要依靠捕撈野生資源，因此，為了實現(xiàn)帚狀江蘺種質(zhì)資源的可持續(xù)利用，需要開展帚狀江蘺種質(zhì)資源的鑒定評價與遺傳多樣性分析。

質(zhì)體基因組和線粒體基因組具有細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)基因組單系遺傳和克隆進(jìn)化的特征，在植物群體遺傳學(xué)研究中應(yīng)用廣泛［11］。其中，質(zhì)體UPA基因（質(zhì)體23S rRNA V區(qū)域）作為通用擴(kuò)增子，具有通用性強(qiáng)、擴(kuò)增率高等特點，在大型海藻的分子鑒定中常被選為候選標(biāo)記［12－14］。線粒體COⅠ基因片段具有母系遺傳、進(jìn)化速度快的特點［15］，已被公認(rèn)為是有效區(qū)分不同動物物種的DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)區(qū)域［16］，作為海洋紅藻的DNA條形碼，可以用于區(qū)分親緣關(guān)系相近的物種和種內(nèi)群體的生物地理亞群［17－18］。本研究采集了海南省文昌和鶯歌海潮間帶的野生帚狀江蘺，對其質(zhì)體UPA基因片段和線粒體COⅠ基因片段進(jìn)行了序列分析，并結(jié)合GenBank數(shù)據(jù)庫中紅藻門其他藻類的UPA和COⅠ序列，從分子水平上對其遺傳距離與系統(tǒng)進(jìn)化進(jìn)行分析，以期為帚狀江蘺種質(zhì)鑒定和系統(tǒng)進(jìn)化研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

帚狀江蘺樣品于2020年7月采自海南文昌和鶯歌海近海潮間帶，采集30株整株藻體，活體運回實驗室，取藻體幼嫩莖葉組織置于95%乙醇，－20℃保存，以待后續(xù)提取DNA。

1.2 DNA的提取與PCR擴(kuò)增測序

取出95%乙醇中保存的帚狀江蘺莖葉組織吸干水分（約20 mg），采用液氮研磨和吸附柱法提取樣品DNA，試劑盒選用廣州邁寶瑞生物科技有限公司的磁珠法植物DNA提取試劑盒。提取的DNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳和核酸定量儀檢測后于－80℃保存。

以帚狀江蘺基因組DNA為模板，進(jìn)行UPA基因片段和COⅠ基因片段的擴(kuò)增，引物的選擇參照文獻(xiàn)［12］和文獻(xiàn)［18］（表1）。引物p23SrV＿F和p23SrV＿R在紅藻門中具有較好的擴(kuò)增效果，目前已在紅藻門和綠藻門中成功擴(kuò)增多個物種［12，19－22］；COⅠ基因選用的引物GazF1和GazR1是目前紅藻門、褐藻門藻類最常用的引物［18－22］。引物購自上海生工生物工程股份有限公司，PCR試劑購自艾科瑞生物工程有限公司，反應(yīng)體系參照試劑說明。

表1 本實驗所用引物序列及反應(yīng)程序Tab.1 Primer sequences and reaction procedure used in this study

將經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢驗過有明亮清晰條帶的產(chǎn)物送往上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行純化回收測序。為避免測序機(jī)器測量誤差及確保PCR產(chǎn)物為目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物，每個樣品做兩個平行，送兩管PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序。

1.3 序列分析

使用SeqMan程序?qū)y序數(shù)據(jù)進(jìn)行峰圖校正和序列拼接，通過BLAST比對確定所獲得序列為目的基因片段，利用MEGA 11進(jìn)行序列比對并去除引物兩端序列，獲得完整目的基因序列。利用DNAsp 6.0計算序列核苷酸多樣性指數(shù)和單倍型多樣性指數(shù)，并用MEGA 11計算序列堿基組成，基于Kimura-2-parameter模型計算帚狀江蘺種內(nèi)和種間遺傳距離，利用鄰接法（neighbor joining method）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，Bootstrap value設(shè)置為1 000次重復(fù)［23］。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列組成分析

帚狀江蘺UPA和COⅠ基因片段PCR產(chǎn)物經(jīng)測序拼接后，通過與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對，確認(rèn)所得序列為江蘺的UPA和COⅠ基因片段。利用MEGA 11軟件進(jìn)行序列比對，刪去測序不準(zhǔn)確的序列，分別得到370 bp的UPA基因片段和664 bp的COⅠ基因片段。

30個帚狀江蘺樣品的UPA基因片段共檢測到1種單倍型，無多態(tài)性位點，堿基T、C、A、G和A＋T的平均含量分別為26.2%、16.2%、30.3%、27.3%和56.5%。30個帚狀江蘺樣品的COⅠ基因片段共檢測到2種單倍型（hap1、hap2），3個多態(tài)性位點，均為簡約信息位點，其中轉(zhuǎn)換位點2個，均為A／G轉(zhuǎn)換，分別在第325和第379位點，顛換位點1個，為A／C顛換，位于第532位點，轉(zhuǎn)換顛換比值為2.0（表2）。序列無缺失和插入位點；堿基T、C、A、G和A＋T的平均含量分別為39.2%、15.1%、27.6%、18.1%和66.8%，與其他藻類的堿基組成研究結(jié)果一致［24－25］。

表2 帚狀江蘺不同單倍型CO I 基因序列的變異位點分布Tab.2 Distribution of variab le sites of CO I gene sequence from different hap lotypes of G.edu lis

利用DNAsp 6.0軟件對帚狀江蘺UPA和COⅠ基因片段的遺傳多樣性參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計（表3）。其中，UPA基因只有1種單倍型，各項遺傳多樣性參數(shù)均為0，UPA基因片段的遺傳多樣性參數(shù)均低于COⅠ基因片段，說明UPA基因片段比COⅠ基因片段更保守。

表3 帚狀江蘺UPA和CO I 基因片段的遺傳多樣性參數(shù)Tab.3 Genetic diversity parameters of UPA and CO I gene fragments of G.edulis

2.2 基于UPA基因的遺傳距離與系統(tǒng)進(jìn)化分析

從GenBank中選擇15種紅藻的UPA序列作為外群物種的UPA序列，包含江蘺屬、角叉菜屬（Chondrus）、海頭紅屬（Plocamium）、沙菜屬（Hypnea）、蜈蚣藻屬（Grateloupia）、石花菜屬（Gelidium）和仙菜屬（Ceramium）共7個屬。外群物種的序列信息見表4，15個外群物種的UPA基因序列堿基含量差異不大，相同屬的堿基含量則更為接近。

表4 外群物種UPA基因序列基本信息Tab.4 Basic data of UPA gene sequences of outgroup species

基于Kimura-2-parameter模型，計算得到PCR擴(kuò)增帚狀江蘺UPA基因序列的1種單倍型與15種外群物種UPA序列的遺傳距離（表5）。江蘺屬中，傘房江蘺（Gracilariacoronopifolia）與扁江蘺（Gracilariatextorii）遺傳距離最近，為0.025；帚狀江蘺與真江蘺（Gracilariavermiculophylla）遺傳距離最遠(yuǎn)，為 0.089。16 種藻類中，石花菜（Gelidium amansi）和細(xì)毛石花菜（Gelidium crinale）遺傳距離最近，為0.005，真江蘺與細(xì)毛石花菜遺傳距離最遠(yuǎn)，為0.152。不同屬間，海頭紅屬與沙菜屬間遺傳距離最近，江蘺屬和石花菜屬間遺傳距離最遠(yuǎn)。

表5 基于UPA基因片段的Kimura-2-parameter遺傳距離（對角線左下）Tab.5 K imura-2-parameter genetic distances（lower left of the diagonal）based on UPA gene fragments

鄰接法構(gòu)建的16種紅藻的UPA基因系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖1）顯示，傘房江蘺與扁江蘺先匯為一支，真江蘺和縊江蘺（Gracilariasalicornia）先匯為一支，這二支匯聚后再與帚狀江蘺匯聚，最后再與龍須菜（Gracilarialemaneiformis）匯聚為江蘺屬。沙菜屬、仙菜屬和石花菜屬首先分別聚為一支，隨后，石花菜屬與仙菜屬匯為一支，沙菜屬與海頭紅匯為一支，蜈蚣藻屬和角叉菜匯為一支，最后與江蘺屬匯聚。

2.3 基于CO I 基因的遺傳距離與系統(tǒng)進(jìn)化分析

從GenBank中選擇15種紅藻的COⅠ序列作為外群物種的COⅠ序列，包含江蘺屬、角叉菜屬、海頭紅屬、沙菜屬、蜈蚣藻屬、石花菜屬和仙菜屬共7個屬。外群物種的序列信息見表6，15個外群物種的COⅠ基因序列堿基含量差異不大。A＋T含量顯著高于C＋G，相同屬藻類的堿基含量更為接近。

表6 外群物種CO I 基因序列信息Tab.6 Data of CO I gene sequences of outgroup species

基于Kimura-2-parameter模型，計算得到PCR擴(kuò)增的帚狀江蘺COⅠ基因序列的2種單倍型（hap1、hap2）與15種外群物種COⅠ序列的遺傳距離（表7），帚狀江蘺2種單倍型的遺傳距離為0.005。江蘺屬中，縊江蘺和傘房江蘺遺傳距離最近，為0.127，扁江蘺和龍須菜遺傳距離最遠(yuǎn)，為0.175。16種藻類中，帶型蜈蚣藻和蜈蚣藻間遺傳距離最近，為0.120；扁江蘺和三叉仙菜（Ceramiumkondo）遺傳距離最遠(yuǎn)，為0.275。不同屬間，江蘺屬與仙菜屬遺傳距離最遠(yuǎn)，海頭紅屬和角叉菜屬遺傳距離最近。

表7 基于CO I 基因片段的K imura-2-parameter遺傳距離（對角線左下）Tab.7 K imura-2-parameter genetic distances（lower left of the diagonal）based on CO I gene fragments

鄰接法構(gòu)建的16種紅藻的COⅠ基因系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2）顯示，傘房江蘺和扁江蘺先匯為一支，真江蘺和縊江蘺分別獨立為一支，帚狀江蘺的2種單倍型聚在一起成一支，這5種江蘺匯聚后再與龍須菜匯為江蘺屬。石花菜屬、蜈蚣藻屬、海頭紅、角叉菜、沙菜屬和仙菜屬先各自分別匯為一支，隨后，沙菜屬與角叉菜和海頭紅匯為一支，然后再與蜈蚣藻屬和江蘺屬匯聚，最后與石花菜屬和仙菜屬匯聚。

圖2 基于CO I 基因片段構(gòu)建的NJ進(jìn)化樹Fig.2 NJ phylogenetic tree based on CO I gene fragments

3 討論

3.1 帚狀江蘺UPA和CO I 基因片段的序列比較

本研究采用PCR技術(shù)對帚狀江蘺的UPA和COⅠ基因序列進(jìn)行擴(kuò)增，分別得到370 bp和664 bp的基因序列，序列分析結(jié)果表明，帚狀江蘺UPA基因和COⅠ基因的A＋T含量（分別為56.5%和66.8%）均高于G＋C。SHERWOOD等［25］研究發(fā)現(xiàn)，紅藻門藻類COⅠ基因的A＋T含量大于60%，而UPA基因的堿基含量更為均衡，A＋T和G＋C含量通常各約占50%。相關(guān)研究表明，相對于COⅠ基因，UPA基因進(jìn)化速度更慢，更為保守；COⅠ基因比UPA基因擁有更高的變異度［14］。

本研究中，帚狀江蘺的野生群體30個樣本中，UPA基因只檢測出1個單倍型，COⅠ基因則檢測出2個單倍型和3個多態(tài)性位點，COⅠ基因片段的各項遺傳參數(shù)均高于UPA基因片段。結(jié)果表明，與COⅠ基因序列相比，UPA基因序列的遺傳變異更小，序列更保守。本研究中，UPA片段只檢測到一種單倍型，推測與UPA基因的保守性相關(guān)。SHERWOOD等［25］的研究表明，由于COⅠ基因是一個編碼基因，密碼子的第3個堿基位點的差異是大部分變異的來源，COⅠ基因片段顯示出最大的置換飽和度，而UPA基因片段則沒有顯示出置換飽和度，這也驗證了UPA基因更加保守。對沙菜屬的研究結(jié)果表明，COⅠ基因在6個沙菜種間的差異為10.1%～16.3%，而UPA基因只有2.5%～4.4%的種間差異，也證明了UPA基因的保守性［26］。本研究中，帚狀江蘺UPA基因片段與傘房江蘺、縊江蘺、扁江蘺、真江蘺和龍須菜的序列差異分別為4.5%、7.1%、5.0%、8.9%和8.6%，而帚狀江蘺COⅠ基因片段與傘房江蘺、縊江蘺、扁江蘺、真江蘺和龍須菜的序列差異均大于10.0%。UPA和COⅠ基因均能夠區(qū)分江蘺屬內(nèi)不同種間的物種，本研究表明，UPA基因不適合帚狀江蘺種內(nèi)的遺傳多樣性分析，但仍能用于屬內(nèi)種間的物種鑒定；與UPA基因相比較，COⅠ基因適用于帚狀江蘺種內(nèi)遺傳多樣性分析，在物種鑒定上也更具優(yōu)勢。但本研究中，UPA基因只檢測到1種單倍型，COⅠ基因也只檢測到2種單倍型，且COⅠ基因的3個變異位點中包含2個轉(zhuǎn)換位點和1個顛換位點，轉(zhuǎn)換顛換比值高，COⅠ基因變異尚未達(dá)到飽和，也反映了海南海域的帚狀江蘺種質(zhì)資源相對單一。

3.2 帚狀江蘺的系統(tǒng)進(jìn)化

本研究中，基于UPA基因的江蘺屬內(nèi)的遺傳距離為0.025～0.089，基于COⅠ基因的江蘺屬內(nèi)遺傳距離為0.136～0.175，帚狀江蘺種內(nèi)遺傳距離為0.005，符合相關(guān)研究中提出的種間差異大于種內(nèi)差異的10倍的標(biāo)準(zhǔn)［27］。COⅠ基因的種間差異度高，已經(jīng)作為DNA條形碼成功鑒定了許多紅藻物種［28－29］。

對于傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)難以鑒定的生物，DNA序列分析提供了一個分類新工具，同時也被廣泛應(yīng)用于系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系的研究［30］?；贑OⅠ基因構(gòu)建的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹表明，帚狀江蘺與傘房江蘺、縊江蘺、扁江蘺、真江蘺、龍須菜匯聚為一支，江蘺屬、沙菜屬、仙菜屬、石花菜屬和海頭紅屬各自匯成獨立的一支，這與形態(tài)學(xué)分類結(jié)果一致［1，31］?；赨PA基因構(gòu)建的NJ進(jìn)化樹在江蘺屬內(nèi)和蜈蚣藻屬的劃分和COⅠ基因有些不一致：UPA構(gòu)建的進(jìn)化樹中，縊江蘺和真江蘺、傘房江蘺和扁江蘺分別匯為一支，而COⅠ構(gòu)建的進(jìn)化樹中，縊江蘺和真江蘺被分為獨立的兩支，傘房江蘺和扁江蘺匯為一支；UPA構(gòu)建的進(jìn)化樹中，蜈蚣藻被單獨分為一支，帶形蜈蚣藻與角叉菜匯為一支，而COⅠ構(gòu)建的進(jìn)化樹中，蜈蚣藻屬的兩個種匯聚到一起，角叉菜單獨一支。黃艷等［20］的研究中，同樣也出現(xiàn)UPA基因無法區(qū)分親緣關(guān)系較近的種的現(xiàn)象。相較于UPA基因，COⅠ更能區(qū)分親緣關(guān)系更近的物種。結(jié)合形態(tài)學(xué)分類特征，COⅠ基因比UPA基因更適合構(gòu)建紅藻的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系；COⅠ基因適合進(jìn)行屬內(nèi)種間的系統(tǒng)進(jìn)化分析，UPA基因則適合在更高階的分類單元應(yīng)用。

大型海洋藻類種類繁多，形態(tài)復(fù)雜，采用單一的形態(tài)鑒定方法確定物種較為困難。DNA條形碼技術(shù)多應(yīng)用于獲取未鑒定生物的分類學(xué)信息［32］，在大型海藻的鑒定和遺傳分析中也被廣泛應(yīng)用［33］，本研究所選用的UPA和COⅠ基因片段在紅藻門藻類的分子鑒定中具有較高的適用性［34］。UPA基因在分析帚狀江蘺的遺傳多樣性時，其保守性可能會導(dǎo)致對南海海區(qū)帚狀江蘺遺傳多樣性的低估，但UPA序列易于獲取，通用性強(qiáng)，仍可作為紅藻門DNA條形碼的一個備選。COⅠ基因在本研究和其他學(xué)者的研究中，均表現(xiàn)出較強(qiáng)的區(qū)分物種的能力，適合作為紅藻門藻類的DNA條形碼，但也有研究表明，COⅠ基因在某些藻類中存在擴(kuò)增和測序方面的問題［35］。

用于研究海洋藻類的DNA條形碼還有許多，本研究僅選擇了UPA和COⅠ基因?qū)χ銧罱y進(jìn)行評估，未來將選擇更多DNA條形碼進(jìn)行海洋藻類種質(zhì)資源及遺傳多樣性研究。本研究結(jié)果顯示，南海海區(qū)帚狀江蘺種質(zhì)資源相對單一，未來應(yīng)著手開展江蘺資源保護(hù)工作。