蘇克楠 劉麗莉 楊 樂(lè) 王夢(mèng)雨

（河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院/食品加工與安全國(guó)家級(jí)教學(xué)示范中心/食品加工與質(zhì)量安全控制河南省國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，河南 洛陽(yáng) 471023）

豬血中富含蛋白質(zhì)、維生素、氨基酸、礦物質(zhì)和酶等生物活性物質(zhì)，其中豬血紅蛋白（porcine hemoglobin，Hb）為主要部分，占全蛋白含量的75%［1］。目前我國(guó)對(duì)豬血資源的利用主要分為兩部分，一小部分是以血粉形式供做動(dòng)物飼料，但大部分都被遺棄。由于豬血紅蛋白敏感易變性的特性，開(kāi)發(fā)新的、高附加值的產(chǎn)品較為困難，并且與豬血相關(guān)的產(chǎn)品都比較單一，這在一定程度上造成了我國(guó)豬血資源利用率低的現(xiàn)狀。因此，選擇合適的技術(shù)對(duì)其加以改良成為亟待解決的問(wèn)題。

通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾改性可改善蛋白質(zhì)的功能特性，使其適用于工業(yè)化生產(chǎn)。因其具有良好的功能特性也可將其作為食品添加劑應(yīng)用在食品加工中。蛋白質(zhì)的改性方法［2-4］主要有三大類，分別是物理改性、化學(xué)改性、生物改性。其中酶法改性較為溫和、簡(jiǎn)便，并且因其可以改變蛋白質(zhì)的功能結(jié)構(gòu)而運(yùn)用較多。姚倫歡等［5］采用多種酶對(duì)豬血紅蛋白的酶解進(jìn)行了研究，認(rèn)為胰蛋白酶水解脫色的效果更好，可用于調(diào)整食品的口感以及強(qiáng)化營(yíng)養(yǎng)成分。郭善廣等［6］對(duì)豬血紅蛋白進(jìn)行脫色酶解改性處理后發(fā)現(xiàn)，在適宜的酶解程度下，豬血紅蛋白乳化性能顯著提升。吳素娟等［7］對(duì)豬血紅蛋白進(jìn)行酶解改性并從分子層面進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)水解過(guò)程中蛋白質(zhì)會(huì)暴露出更多的疏水基團(tuán)，從而使多肽在空氣-水界面上的融合速率和吸附能力得到提升，且溶解性與乳化性能呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。馬露燕等［8］通過(guò)濕法糖基化反應(yīng)制備豌豆蛋白-低聚木糖復(fù)合物，發(fā)現(xiàn)其乳化特性及乳化穩(wěn)定性有極大提升。不同的改性方法可以改善蛋白質(zhì)不同的功能特性，采用兩種改性方法協(xié)同改性，會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的多個(gè)功能特性有顯著影響［9］。將糖基化和亞硝基改性組合后，運(yùn)用到肉腸中可以改善色澤，起到降低亞硝酸鹽殘留的作用，可考慮作為天然色素替代亞硝酸鈉在肉制品中的使用［10］。將糖基化和酰基化結(jié)合起來(lái)協(xié)同改性，可以改善蛋白質(zhì)的功能特性，且改性的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性與糖基化的糖源有關(guān)［11］。使用磷酸化亞硝基協(xié)同改性處理血紅蛋白后，發(fā)現(xiàn)其具有亞硝基改善色澤的效果，也具有磷酸化的增加保水性的效果［12-13］。此外，磷酸化改善蛋白質(zhì)功能特性的效果與使用的磷酸鹽有關(guān)，Ma等［14］研究了三聚磷酸鈉（sodium tripolyphosphate，STP）對(duì)亞硝基血紅蛋白的磷酸化修飾及其對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性的影響，發(fā)現(xiàn)STP 處理過(guò)的亞硝基血紅蛋白穩(wěn)定性得到極大提升，有利于探究蛋白質(zhì)在極端條件下的應(yīng)用。上述研究表明，協(xié)同改性綜合了兩種單一改性的優(yōu)點(diǎn)，是一種較為理想的改性方法。

國(guó)內(nèi)外研究大多運(yùn)用單一改性的方式改善豬血紅蛋白質(zhì)的功能特性，使用協(xié)同改性的方法對(duì)豬血紅蛋白進(jìn)行改性的研究較少。河南科技大學(xué)食品生物技術(shù)與畜禽及其副產(chǎn)物的綜合加工利用實(shí)驗(yàn)室主要進(jìn)行畜禽副產(chǎn)物精深加工與綜合利用的研究。前期針對(duì)雞蛋卵白蛋白協(xié)同改性進(jìn)行了大量研究，結(jié)果表明卵白蛋白的功能特性經(jīng)協(xié)同改性后得到增強(qiáng)［15-16］，證明協(xié)同改性可以改善蛋白的功能特性。酶法改性條件溫和，同時(shí)磷酸化反應(yīng)可以增強(qiáng)蛋白質(zhì)的功能特性［17-20］，因此本研究采用酶解-磷酸化協(xié)同改性的方法對(duì)豬血紅蛋白（porcine haemoglobin，Hb）進(jìn)行改性，探究酶解-磷酸化協(xié)同改性豬血紅蛋白（phosphorylated porcine haemoglobin，HP-Hb）的功能特性和結(jié)構(gòu)特性的變化，旨在為蛋白質(zhì)的協(xié)同改性提供試驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)拓寬豬血紅蛋白在食品工業(yè)中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬血紅蛋白，伊卡試劑主營(yíng)店，南京；三聚磷酸鈉，武漢生物試劑商城；氫氧化鉀，西隴試劑廠；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀，方正試劑廠，天津；KBr，天津化工研究所；堿性蛋白酶，隆科特酶制劑有限公司，山東。均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

YRLG-10A 型真空冷凍干燥機(jī)，德國(guó)CHRIST 公司；H1850離心機(jī)、LC-LX-H165A 型均質(zhì)機(jī)，安徽力辰科技公司；RSA5065-TG 型FT-IR 紅外光譜儀，北京VNA 矢量網(wǎng)絡(luò)公司；N9010A 型差示掃描量熱儀，深圳弗布斯公司；XSP-H1600 型電子掃描顯微鏡，湖南奧斯維公司；SN-CJB-M1 磁力攪拌器，浙江艾科儀器設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 HP-Hb的制備 取Hb配置成5%的溶液，調(diào)節(jié)pH 值至8.2，堿性蛋白酶的添加量為5 500 U·g-1，在恒溫水浴鍋中以52.5 ℃的溫度反應(yīng)5 h。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)物置于90 ℃的水浴鍋中加熱5 min，使酶鈍化，冷卻至室溫，4 500 r·min-1離心10 min，取上清液冷凍干燥，得到豬血紅蛋白肽（enzyme digestion of porcine haemoglobin，H-Hb）。

取上述H-Hb 溶于0.02 mol·L-1pH 值7.4 的磷酸鹽緩沖溶液中，配制成1 g·100 mL-1的蛋白質(zhì)溶液，調(diào)節(jié)pH 值至8.0，添加9%的STP，在磁力攪拌器上保持恒溫30 ℃攪拌4 h，得到HP-Hb溶液，透析脫鹽除酶后冷凍干燥備用。

1.3.2 HP-Hb、H-Hb和Hb功能特性的測(cè)定

1.3.2.1 溶解度的測(cè)定 參考彭倩［21］的方法測(cè)量溶解度（solubility，S），凱氏定氮法測(cè)定含氮量。氮溶解指數(shù)（nitrogen soluble index，NSI）計(jì)算公式如下：

式中，N0為樣品中總氮含量（mg·mL-1）；N1為溶于2%的KOH上清液氮含量（mg·mL-1）。

1.3.2.2 乳化特性的測(cè)定 參考張根生等［22］的方法測(cè)定乳化活性指數(shù)（economic access index，EAI）和乳化穩(wěn)定性指數(shù)（environmental sustainability index，ESI）。相關(guān)計(jì)算公式如下：

式中，A0、A10為乳濁液在0、10 min 的吸光值；φ 為油相體積分?jǐn)?shù)（油的體積/乳濁液的體積，%）；ρ 為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度（g·mL-1）。

1.3.2.3 起泡性的測(cè)定 參考占福朝［23］的方法測(cè)定蛋白溶液起泡性指數(shù)（foamability index，F(xiàn)AI）和起泡穩(wěn)定性指數(shù)（foam stability index，F(xiàn)SI）。相關(guān)計(jì)算公式如下：

式中，H0為起始高度；H1為10 000 r·min-1均質(zhì)2 min后的高度；H2為靜置10 min后再次記錄的高度。

1.3.3 HP-Hb、H-Hb 和Hb 的結(jié)構(gòu)特性分析 （1）傅里葉紅外光譜（fourier transform infrared spectrometry，F(xiàn)T-IR）：將KBr 于50 ℃干燥12 h，分別與Hb、H-Hb、HP-Hb 凍干樣按質(zhì)量比100∶1 混合研細(xì)，壓片后制成透光片，設(shè)置為400～4 000 cm-1波長(zhǎng)區(qū)間進(jìn)行掃描。

（2）差示掃描量熱儀（differential scanning calorimetry，DSC）：稱量（5.0±0.1）mg 的Hb、H-Hb、HP-Hb 于鋁坩堝中，3 組樣品的溫度范圍為30～300 ℃，參數(shù)設(shè)置為10 ℃·min-1，做空白對(duì)照組和重復(fù)3次試驗(yàn)。

（3）掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）分析：制樣后，設(shè)置參數(shù)放大1 000 倍，加速電壓為20 kV，觀察樣品微觀結(jié)構(gòu)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)所涉及的測(cè)定結(jié)果均做3 次重復(fù)，利用OMIC、Origin2021軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 協(xié)同改性前后Hb的功能特性分析

2.1.1 溶解性分析 由圖1可知，HP-Hb在偏酸性和偏堿性的時(shí)候溶解度較大，在pH 值為4.0～5.0 時(shí)溶解度較低。Hb 和H-Hb 在pH 值5.0～6.0 之間溶解度最低，與其等電點(diǎn)相差不大。當(dāng)pH值與等電點(diǎn)相差較小時(shí)，蛋白質(zhì)與水分子間的力所帶凈電荷最少，且易形成聚集體，相互作用力也最小，易形成蛋白質(zhì)沉淀［24］。在pH 值>4.8時(shí)，Hb和H-Hb的溶解度均小于HP-Hb，可能是由于磷酸化處理引進(jìn)了磷酸根基團(tuán)，這些磷酸根基團(tuán)可與水結(jié)合形成氫鍵，導(dǎo)致整個(gè)蛋白質(zhì)體系電負(fù)性增加，蛋白質(zhì)分子之間的靜電斥力提高，使其體系更加分散，溶解性更大。這與張功圣［25］對(duì)大豆蛋白進(jìn)行多糖糖基化修飾所得到的結(jié)論一致，說(shuō)明酶解-磷酸化協(xié)同改性有效提高了Hb的溶解性。

圖1 Hb、H-Hb和HP-Hb的溶解性隨pH的變化Fig.1 Changes of solubility of Hb，H-Hb and HP-Hb with pH

2.1.2 乳化性和乳化穩(wěn)定性分析 由圖2 可知，乳化活性指數(shù)表現(xiàn)為HP-Hb（43.39 m2·g-1）>H-Hb（49.51 m2·g-1）>Hb（55.81 m2·g-1）（P<0.05）；乳化穩(wěn)定性表現(xiàn)為HP-Hb（55.14%）>H-Hb（58.47%）>Hb（61.51%）（P<0.05）。豬血紅蛋白肽肽鏈在酶解后打開(kāi)，結(jié)合油滴的能力增強(qiáng)，肽中疏水基團(tuán)也增加，親水基團(tuán)進(jìn)入水相增多，相比Hb，H-Hb 的乳化能力變強(qiáng)。這可能是由于磷酸基團(tuán)會(huì)增強(qiáng)液滴之間斥力，體現(xiàn)親油性，暴露疏水基團(tuán)，磷酸化及磷酸基團(tuán)嵌入后，蛋白質(zhì)分子在界面的擴(kuò)散重排速度加快，乳化性增強(qiáng)［26］。蛋白質(zhì)的溶解性與乳化活性和乳化穩(wěn)定性有著一定關(guān)系，溶解性增強(qiáng)使乳化活性和乳化穩(wěn)定性增強(qiáng)，向水油界面擴(kuò)散的能力增強(qiáng)［27］。

圖2 Hb、H-Hb和HP-Hb的乳化性和乳化穩(wěn)定性分析Fig.2 Emulsifiability and emulsifying stability analysis of Hb，H-Hb and HP-Hb

2.1.3 起泡性和泡沫穩(wěn)定性分析 由圖3 可知，起泡性表現(xiàn)為HP-Hb（59.41%）>H-Hb（55.48%）>Hb（51.82%）（P<0.05）；起泡穩(wěn)定性表現(xiàn)為HP-Hb（59.12%）>H-Hb（61.57%）>Hb（65.99%）（P<0.05）。分析原因，可能是酶解后的H-Hb 鏈結(jié)構(gòu)打開(kāi)，蛋白質(zhì)部分肽鏈在界面上通過(guò)肽鍵相互作用形成了二維保護(hù)網(wǎng)絡(luò)，使得界面膜得以加強(qiáng)，促進(jìn)泡沫的形成與穩(wěn)定［28］。磷酸化后在蛋白分子中引入帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)，提高了水/氣界面電荷，形成了致密的電負(fù)性界面層，從而構(gòu)成空間屏障抑制泡沫間的聚集，進(jìn)而提高了泡沫穩(wěn)定性。蛋白質(zhì)的高溶解度是具有良好起泡性和起泡穩(wěn)定性的先決條件［29］，HP-Hb的溶解度大幅度增加，等電點(diǎn)前移，在等電點(diǎn)時(shí)，分子間的靜電吸引作用使吸附在氣液界面上的薄層厚度和硬度增大，起泡穩(wěn)定性增大。

圖3 Hb、H-Hb和HP-Hb的起泡性和起泡穩(wěn)定性分析Fig.3 Analysis of foaming ProPerty and foaming stability of Hb，H-Hb and HP-Hb

2.2 協(xié)同改性前后Hb的結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 傅里葉紅外光譜分析 由圖4 可知，Hb、HHb、HP-Hb 的紅外光譜圖存在差異，說(shuō)明三者的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生變化。酰胺Ⅰ帶（3 400～3 200 cm-1）中，HP-Hb 有特征吸收，HP-Hb 與H-Hb 和Hb 相比峰位紅移，且酰胺Ⅰ帶可能是C—O 的伸縮振動(dòng)或N—H 之間的氫鍵，原因是豬血紅蛋白肽中的肽鏈斷裂，肽上的-NH 與葡聚糖發(fā)生羰基反應(yīng)，影響了C—O 的伸縮振動(dòng)，從而使酰胺Ⅰ帶處的峰發(fā)生了位移。1 330～1 220 cm-1為酰胺Ⅲ帶，HP-Hb在此處吸收峰紅移，這是因?yàn)镠-Hb和三聚磷酸鈉反應(yīng)，產(chǎn)生了共價(jià)鍵結(jié)合。PO43-的紅外特征吸收峰在1 100 cm-1左右，P—N的吸收峰在500 cm-1［30］。HP-Hb 在1 100、500 cm-1處有較大吸收峰，說(shuō)明改性后磷酸根接入蛋白質(zhì)，且連接到N 原子上。HP-Hb 在900 和700 cm-1處的吸收峰與500 cm-1處峰的增加有關(guān)，原因可能是與三聚磷酸鈉反應(yīng)后，磷酸根增加，負(fù)電荷升高，所以吸收峰發(fā)生了偏移，透光率也發(fā)生了變化，產(chǎn)生了新的吸收峰。

圖4 Hb、H-Hb和HP-Hb的FT-IR分析Fig.4 The FT-IR analysis of Hb，H-Hb and HP-Hb

2.2.2 差示掃描量熱分析 由圖5 可知，Hb、H-Hb和HP-Hb均出現(xiàn)了放熱峰，熱變性溫度表現(xiàn)為HP-Hb（86.90 ℃）>H-Hb（72.90 ℃）>Hb（66.23 ℃），原因是溫度過(guò)高時(shí)，蛋白質(zhì)會(huì)產(chǎn)生由于變性導(dǎo)致的分子構(gòu)象變化。同時(shí)，氨基酸的組成也會(huì)影響蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性，與親水性氨基酸相比，疏水性氨基酸的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性較強(qiáng)。而且蛋白質(zhì)變性需要熱能大于分子間氫鍵的結(jié)合能，由于酶解破壞了Hb 的球狀結(jié)構(gòu)，分子間的疏水基被釋放出來(lái)，同時(shí)磷酸基團(tuán)的大量接入增強(qiáng)了分子間的離子相互作用，其變性所需熱能增加，則HPHb 熱穩(wěn)定性增強(qiáng)，由此說(shuō)明酶解-磷酸化協(xié)同改性提高了豬血紅蛋白的熱穩(wěn)定性。

圖5 Hb、H-Hb和HP-Hb的DSC分析Fig.5 DSC analysis of Hb，H-Hb and HP-Hb

2.2.3 SEM 分析 由圖6-A 可知，Hb 經(jīng)過(guò)預(yù)冷凍后再進(jìn)行真空冷凍干燥，為塊狀蛋白，表面光滑；由圖6-B可知，H-Hb 因肽鍵斷裂，結(jié)構(gòu)上遭到了破壞，形成薄片狀結(jié)構(gòu)，并有不規(guī)則的碎片；由圖6-C 可知，Hb 經(jīng)過(guò)酶解-磷酸化協(xié)同改性處理后，微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生了較為明顯的變化，由于磷酸根和蛋白結(jié)合，使蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，形成了堆疊的塊狀結(jié)構(gòu)，周圍有較小的顆粒雜亂分布。

圖6 Hb、H-Hb和HP-Hb的掃描電子顯微鏡圖（×1 000）Fig.6 Scanning electron micrographs of Hb，H-Hb and HPHb（×1 000）

3 討論

本研究通過(guò)對(duì)豬血紅蛋白進(jìn)行酶解-磷酸化協(xié)同改性處理，發(fā)現(xiàn)協(xié)同改性后的功能特性得到很大提升。蛋白質(zhì)的功能特性與其結(jié)構(gòu)相關(guān)，功能特性中的溶解性又直接影響到乳化性和起泡性。原因是蛋白質(zhì)的溶解度可反映其等電點(diǎn)，酶解后的豬血紅蛋白肽鏈打開(kāi)，蛋白顆粒粒徑和疏水性降低，等電點(diǎn)前移，蛋白質(zhì)在水中所帶電荷較大，不易形成聚集體和蛋白沉淀。在實(shí)際生產(chǎn)中，溶解度較高的蛋白質(zhì)表現(xiàn)出更好的理化特性，更加占優(yōu)勢(shì)。蛋白質(zhì)的乳化性、乳化穩(wěn)定性與蛋白質(zhì)的溶解度之間存在一定的相關(guān)關(guān)系，不溶性的蛋白質(zhì)對(duì)蛋白乳化無(wú)影響，溶解性是蛋白質(zhì)具有乳化性的先決條件，只有具有溶解性，蛋白質(zhì)才具有向油水界面擴(kuò)散的能力［31］。磷酸化可在豬血紅蛋白分子中引入帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)，提高了氣/水界面電荷，形成結(jié)構(gòu)致密的電負(fù)性界面層，從而構(gòu)成有效的空間屏障抑制泡沫間的聚集，進(jìn)而提高泡沫穩(wěn)定性。彭倩等［32］發(fā)現(xiàn)，豬血紅蛋白的溶解性、乳化性能和起泡性能在磷酸化處理后顯著提升；李逢振［3］發(fā)現(xiàn)酶解處理后的豬血紅蛋白的功能特性得到明顯提升。本研究采取酶解-磷酸化協(xié)同改性處理豬血紅蛋白，發(fā)現(xiàn)協(xié)同改性具備了酶解以及磷酸化改性后的優(yōu)點(diǎn)，并且兩種改性可能具有相互促進(jìn)的作用。功能特性的變化也與結(jié)構(gòu)上的變化密切相關(guān)。磷酸化改性后，反應(yīng)產(chǎn)生共價(jià)結(jié)合，磷酸根的接入增強(qiáng)了溶液的電負(fù)性，使紅外譜圖中的峰發(fā)生了偏移，而產(chǎn)生了共價(jià)作用后，蛋白質(zhì)變性所需的肽鍵斷裂的能量增加，更加不易斷裂，熱變性溫度升高，熱穩(wěn)定性增強(qiáng)。

在實(shí)際生產(chǎn)中，食品企業(yè)主要是利用豬血紅蛋白的護(hù)色作用、保水性能、乳化性能。護(hù)色作用主要依靠豬血紅蛋白本身的顏色，而協(xié)同改性后的豬血紅蛋白熱穩(wěn)定性升高，護(hù)色效果更好；保水性主要應(yīng)用在肉糜、肉塊，磷酸化后的保水性能增強(qiáng)；乳化性能主要應(yīng)用在肉腸，有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)將血紅蛋白修飾后加入香腸中可以改善乳化性，增強(qiáng)色度，有一定抑菌作用［33］；酶解后1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl radical，DPPH）清除率高于豬血紅蛋白［34］。本研究發(fā)現(xiàn)協(xié)同改性后的豬血紅蛋白溶解性、乳化性能和起泡性能得到增強(qiáng)，推測(cè)其抑菌作用和抗氧化作用也會(huì)發(fā)生變化，需要在后續(xù)研究中進(jìn)一步證實(shí)。

4 結(jié)論

本研究以豬血紅蛋白肽和豬血紅蛋白為對(duì)照，對(duì)酶解-磷酸化協(xié)同改性豬血紅蛋白的功能特性及結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)與H-Hb 和Hb 相比，HP-Hb 的溶解度呈現(xiàn)優(yōu)勢(shì)，乳化性能和起泡性能也有顯著提升；結(jié)構(gòu)分析表明，Hb-Hb 的熱穩(wěn)定性增強(qiáng)，分子結(jié)構(gòu)由緊密的塊狀結(jié)構(gòu)變成了松散的塊狀結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)能夠結(jié)合更多的磷酸根基團(tuán)，有利于更好地發(fā)揮其功能特性。因此，酶解-磷酸化協(xié)同改性對(duì)豬血紅蛋白的功能特性有明顯提升，這為協(xié)同改性在蛋白中的應(yīng)用以及豬血紅蛋白在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)及參考。