向圣漢，趙雨賀，彭治鑫，李俊慧，李偉

（長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434000）

隨著蛙類養(yǎng)殖業(yè)的興起，蛙類病害問題也日漸突出。蛙類病害主要有真菌性疾病[1]、細菌性疾病[2]、寄生蟲疾病[3]，環(huán)境因素也可造成病害發(fā)生[4]。在人工養(yǎng)殖環(huán)境下，細菌引起蛙類的多種重要疾病。目前已報道的致病菌如腦膜膿毒性黃桿菌（Flavobacterium menigosepticum）可引起牛蛙（Rana catesbeiana）歪脖子病[5]，氣單胞菌（Aeromonas sp.）可引起牛蛙紅腿病[6]、敗血癥[7]、腹水病[8]、白內(nèi)障[9]等多種疾病。不同致病菌可能會導(dǎo)致類似的病癥，如遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）[10]、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）[7]、點狀產(chǎn)氣單胞菌（Aeromonas punctata）、非霍亂弧菌（Noncholera vibrios）[11]等都可引起蛙類敗血癥。

米爾伊麗莎白菌（Elizabethkingia miricola）是伊麗莎白菌屬的重要物種，最早分離于Mir 空間站的冷凝水[12]。最近，有相關(guān)報道表明，感染米爾伊麗莎白菌的蛙會出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)疾病，造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷和類似于腦膜炎的癥狀[13]。在多種無尾目兩棲動物中報道了米爾伊麗莎白菌感染，導(dǎo)致病蛙出現(xiàn)歪頭和白內(nèi)障等病癥。胡瑞雪等[14]和秦振陽等[15]從患歪頭病黑斑蛙（Pelophylax nigromaculatus）；Lei等[16]從患有歪頭、白內(nèi)障病癥的棘胸蛙（Quasipaa spinosa）中分離鑒定的致病病原均為米爾伊麗莎白菌。國外在林蛙（Rana sylvatica）、雨蛙（Hyla viridis）中也有被米爾伊麗莎白菌感染出現(xiàn)歪頭癥病癥的報道[17]。

針對牛蛙歪頭、白內(nèi)障病致病菌的研究歷史悠久。陳耀明等[18]首次報道了腦膜膿毒性黃桿菌會引起病蛙歪頭和白內(nèi)障病癥。陳會波等[19]報道牛蛙歪頭白內(nèi)障病原是黃桿菌IIb 群（Plavobacterium group IIb）。楊春浩等[20,21]發(fā)現(xiàn)嗜水氣單胞菌、藤黃葡萄球菌（Micrococcus luteus）和淺黃假單胞菌（Pseudomonas mendocina）都存在于患有歪頭白內(nèi)障病癥的牛蛙組織，可能都參與了致病作用。有鑒于此，分離并鑒定牛蛙歪頭白內(nèi)障病病原對于該疾病的預(yù)防和控制至關(guān)重要。2021 年上半年，湖北荊州江陵縣牛蛙養(yǎng)殖場出現(xiàn)大量歪頭、白內(nèi)障癥狀病蛙，通過分離病原菌、生理生化鑒定、基因序列分析等方法鑒定病原并分析其致病性和耐藥性，為該病害的治療和防治提供了參考資料。

1 材料與方法

1.1 供試牛蛙及主要試劑

試驗牛蛙取自湖北省荊州江陵縣牛蛙養(yǎng)殖基地。

抗菌藥物藥敏紙片（批號：20210316）、細菌微量生化反應(yīng)管（批號：20210422）（杭州微生物試劑有限公司）；瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；細菌基因組DNA 提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離、純化和鑒定

患歪頭、白內(nèi)障癥的牛蛙用70%的酒精進行表面消毒后，在實驗室無菌條件下解剖。用接種環(huán)將眼睛和大腦分離的樣本接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，挑取培養(yǎng)基上長勢良好的菌落進行純化培養(yǎng)，并保存?zhèn)溆?。取活化菌體涂片，用革蘭氏染色，觀察形態(tài)特征。根據(jù)生化微量反應(yīng)管說明進行生化鑒定。

提取分離優(yōu)勢菌基因組DNA，對菌株進行16S rRNA 基因和gyrB 基因PCR 擴增。16S rRNA 基因上游引物F 為：5’-AGAGTTTTGATCCTGGCTCAG-3’；下游引物R為：5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’；gyrB 基因上游引物F 為：5’-GAAGTCATCATGACCGT TCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA3’；下游引物R 為：5’-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTC NACRTCNGCRTCNGTCAT-3’。反應(yīng)體系為（50 μL）：2×PCR Mix 25 μL，上下游引物各1.0 μL，DNA 模板2.0 μL，ddH2O 21 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72℃延伸60 s，循環(huán)34 次，72 ℃延伸7 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序得到的基因序列在NCBI中進行BLAST 分析比對，從數(shù)據(jù)庫獲得相關(guān)屬種的16S rRNA 和gyrB 基因序列，找到相似性較高的菌株應(yīng)用MEGA7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.2.2 藥敏試驗

藥敏試驗采用常規(guī)瓊脂擴散（K-B）法。將分離菌培養(yǎng)液在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基表面涂布接種，室溫干燥10 min 后用無菌鑷子取出藥敏片緊貼于培養(yǎng)基表面，每個處理3 個重復(fù)，然后將培養(yǎng)基倒置放在30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出觀察并測定抗生素紙片周圍透明圈直徑，有透明圈則表示對該藥物耐藥，根據(jù)直徑大小判定菌株的耐藥強弱。

1.2.3 病原菌生長特性研究

調(diào)節(jié)初始液體培養(yǎng)基pH 為3、4、5、6、7、8、9。取甘油保存的菌種在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上活化后,挑取單菌落于LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，取300 μL 菌液接種到15 mL 不同pH 液體培養(yǎng)基中，于30 ℃、200 r/min 培養(yǎng)8 h 后在紫外分光光度計600 nm 處測定菌液OD 值，表示生物量，每個梯度做三次重復(fù)。

用NaCl 調(diào)節(jié)培養(yǎng)基鹽度為0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，取300 μL 菌液接種到15 mL 不同鹽度液體培養(yǎng)基中30 ℃、200 r/min 培養(yǎng)8 h。每個梯度做三次重復(fù)。

1.2.4 產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶檢測

純化后的菌株在LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，使用打孔器分別在含0.2%可溶性淀粉和含0.2%脫脂奶粉的LB 固體培養(yǎng)基中等間距打四個孔，其中三孔加入100 μL 菌液，另一孔加等體積LB液體培養(yǎng)基作為對照，30 ℃培養(yǎng)24 h 后向淀粉培養(yǎng)基中加入碘液，觀察顏色變化和透明圈大小。

1.2.5 病原菌的致病性試驗

純化后的分離菌株接種到LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，離心收集菌體，用無菌生理鹽水將菌株配置成1.0×108CFU/mL 的菌懸液，并將菌液經(jīng)0.3%福爾馬林滅活制備滅活菌液。體質(zhì)量（242±5）g 的健康牛蛙隨機分為三個組，每組60 只，每30 只牛蛙暫養(yǎng)在200 L 的養(yǎng)殖箱里，每天換一次水，正常投喂商品飼料，暫養(yǎng)一周后，一組腹腔注射0.2 mL 108 CFU/mL 細菌，另一組注射等體積經(jīng)福爾馬林溶液滅活的細菌；第三組腹腔注射0.2 mL 0.9%生理鹽水。記錄30 d 內(nèi)蛙的外觀表現(xiàn)及發(fā)病數(shù)量。

1.2.6 統(tǒng)計分析

數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 14.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用卡方檢驗（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的菌落形態(tài)及生理生化指標(biāo)

從牛蛙腦組織中分離到多個形態(tài)特征相似的菌株，經(jīng)純化后篩選到1 株優(yōu)勢菌株，30℃培養(yǎng)24 h 后觀察形態(tài)特征,進行革蘭氏染色。結(jié)果顯示，菌株長勢良好，培養(yǎng)24 h 后菌落直徑1～1.5 mm，形狀規(guī)則，不透明，表面光滑，呈淡黃色。顯微鏡觀察呈桿狀，革蘭氏陰性。該菌對苯丙氨酸、蛋白胨、葡磷胨、葡萄糖、山梨醇、木糖、棉子糖試驗反應(yīng)呈陰性，對尿素、半固體瓊脂、賴氨酸、鳥氨酸試驗呈陽性；不能利用葡萄糖酸鹽、枸櫞酸鹽，不能產(chǎn)生硫化氫（表1）。

表1 生化試驗結(jié)果Tab.1 Biochemical test results

2.2 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

分離菌株經(jīng)16S rRNA 和gyrB 的特異性引物擴增產(chǎn)物送生工有限公司測序，所得序列經(jīng)拼接后在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進行BLAST 比對分析。結(jié)果表明，分離菌株的16S rRNA 和gyrB 基因序列與Genbank 中其他米爾伊麗莎白菌分離株的同源性高達99.33%～99.93%，對序列比對相似度較高的序列進行篩選后，應(yīng)用MEGA7.0 軟件構(gòu)建序列遺傳進化樹，分離株與米爾伊麗莎白菌聚為一支，結(jié)果如圖1。該結(jié)果表明，分離菌株為米爾伊麗莎白菌，菌株編號為Mir-N11，GenBank 注冊號CP090369.1。

圖1 菌株Mir-N11 的16s rRNA 基因（A）和gyrB 基因（B）序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of 16s rRNA gene（A）and gyrB gene（B）of strain Mir-N11

2.3 藥敏試驗結(jié)果

菌株E.miricola Mir-N11 對米諾環(huán)素、紅霉素高度敏感，對多西環(huán)素、環(huán)丙沙星、氧氟沙星中度敏感，對哌拉西林、頭孢哌酮、麥迪霉素、羧芐西林、萬古霉素敏感，對克林霉素、卡那霉素、四環(huán)素、氯霉素等不敏感（耐藥）（表2）。

表2 藥敏試驗結(jié)果Tab.2 Drug sensitivity test results

2.4 菌株生長特性研究

菌株Mir-N11 在脫脂奶粉培養(yǎng)基中生長24 h后能明顯觀察到透明圈，表明Mir-N11 具有較強的產(chǎn)蛋白酶能力（圖2-A）；而在淀粉培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h 后用碘液進行染色，在菌落周圍未觀察到透明圈，表明菌株Mir-N11 沒有產(chǎn)淀粉酶的能力（圖2-B）。菌株Mir-N11 在pH 3.0～9.0 范圍內(nèi)均可生長，最適生長pH 為6.0（圖3-A）；在鹽度0.5%～2.5%范圍內(nèi)均可生長，最適生長鹽度為0.5%（圖3-B）。

圖2 菌株Mir-N11 產(chǎn)蛋白酶（A）和淀粉酶（B）能力Fig.2 Protease（A）and amylase（B）production capacity of strain Mir-N11

圖3 pH 和鹽度對菌株Mir-N11 生長的影響Fig.3 Effects of pH and salinity on the growth of strain Mir-N11

2.5 菌株Mir-N11 致病性驗證

活菌注射組的牛蛙在注射后第5 d 開始出現(xiàn)不攝食、歪頭、眼球發(fā)白、水中轉(zhuǎn)圈等癥狀，30 d 內(nèi)累計發(fā)病率為43%，而滅活細菌注射組和對照組的牛蛙試驗期間未出現(xiàn)發(fā)?。▓D4）。進一步分離表現(xiàn)明顯癥狀的病蛙腦組織細菌，將16s rRNA 基因測序，并在NCBI 上進行序列比對，鑒定為米爾伊麗莎白菌，與自然患病蛙細菌分離鑒定結(jié)果一致，這進一步表明，菌株Mir-N11 具有較強的致病能力，是造成此次牛蛙歪頭病的病原菌。

圖4 不同處理組的牛蛙30 d 內(nèi)發(fā)病情況統(tǒng)計Fig.4 Incidence statistics of bullfrog in different treatment groups within 30 days

3 討論

蛙類歪頭、白內(nèi)障病病原的研究倍受關(guān)注。但伊麗莎白菌屬的病原菌分類地位及分類體系的混亂，很長時間以來沒有統(tǒng)一蛙歪頭、白內(nèi)障病病原的分類地位。陳耀明[18]報道了腦膜膿毒性黃桿菌會引起病蛙歪頭和白內(nèi)障病癥。陳會波等[19]發(fā)現(xiàn)，牛蛙歪頭白內(nèi)障病原是黃桿菌。在本研究中，從患有歪頭白內(nèi)障病的牛蛙腦組織中分離得到一株米爾伊麗莎白菌，經(jīng)生理生化、16s rRNA 和gyrB 基因測序，鑒定其為E.miricola，通過回歸感染試驗證實了該菌株能引起牛蛙歪頭白內(nèi)障病。

藥敏試驗結(jié)果顯示，分離株對哌拉西林、紅霉素、多西環(huán)素、環(huán)丙沙星、頭孢哌酮等藥物敏感；對克林霉素、卡那霉素、慶大霉素、氯霉素等耐藥。秦振陽等[15]的研究顯示，從患歪頭病黑斑蛙中分離的米爾伊麗莎白菌對鏈霉素、強力霉素、麥迪霉素等多種藥物敏感，對諾氟沙星、氧氟沙星、多粘菌素B等耐藥。雷雪平等[16]的研究顯示，從患病棘蛙中分離得到的米爾伊麗莎白菌對阿米卡星、阿芐西林、紅霉素、慶大霉素、氧氟沙星、四環(huán)素耐藥，但僅對氟苯尼考敏感。李川北等[22]從患歪頭病黑斑蛙中分離的米爾伊麗莎白菌對米諾環(huán)素、氟苯尼考、利福平和萬古霉素敏感，對青霉素、氨芐青霉素、頭孢氨芐、頭孢他啶、頭孢克洛等耐藥。造成耐藥表型不一致的原因可能是耐藥基因隱性表達或不表達[23]，或者細菌處于異質(zhì)性耐藥[24]。細菌耐藥性的獲得與生物膜的形成有關(guān)[25]。不同菌株的藥敏差異說明不同時間、不同地域養(yǎng)殖過程中抗生素的使用差異可能是菌株耐藥性差異的主要原因[26]。

致病菌在生長繁殖過程中會產(chǎn)生多種胞外活性產(chǎn)物，包括胞外蛋白酶、溶血素、明膠酶、脂肪酶、和淀粉酶等[27]。本研究通過平板打孔法初步測定了米爾伊麗莎白菌胞外產(chǎn)物的酶活性。結(jié)果表明，分離株Mir-N11 能夠產(chǎn)生胞外蛋白酶，但不產(chǎn)生淀粉酶。胞外產(chǎn)物與病原菌致病作用密切相關(guān)[28]，能夠在一定程度上增加病原菌的毒性[29]。張飛等[30]在研究大黃魚（Pseudosciaena crocea）發(fā)光桿菌（Photobacterium damselae）的致病能力時發(fā)現(xiàn)，胞外蛋白酶與明膠酶、淀粉酶等協(xié)同作用致大黃魚患病。金珊等[31]發(fā)現(xiàn)，溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）的胞外產(chǎn)物中具有明膠酶、淀粉酶、酪蛋白酶、脂肪酶活性及溶血活性，對大黃魚有直接致死作用。牟海津等[32]在副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的胞外產(chǎn)物中檢測到蛋白酶、淀粉酶、卵磷脂酶、幾丁質(zhì)酶活性，表明胞外產(chǎn)物在感染對蝦的過程中起至關(guān)重要作用。許兵等[33]研究表明，導(dǎo)致對蝦紅腿病的毒力因子是副溶血弧菌和溶藻弧菌的胞外蛋白酶。綜上所述，致病菌胞外產(chǎn)物在致病過程中起著重要作用，不同細菌的胞外產(chǎn)物也不盡相同，對于米爾伊麗莎白菌其他胞外產(chǎn)物活性以及在致病過程中的作用還有待進一步研究，以便進一步闡明其致病機理。

結(jié)論：分離得到一株強致病菌，經(jīng)鑒定為米爾伊麗莎白菌。該菌對牛蛙具有較強的致病性和多重抗耐藥性；可產(chǎn)生胞外蛋白酶，但不產(chǎn)淀粉酶。本研究結(jié)果可為E.miricola 病原流行分析及防治提供參考資料。