張志鵬，王大勝，王建輝，王志彬，陳義旺，商紹彬，楊章平，楊 奕*

（1.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009；2.睢寧縣畜牧獸醫(yī)技術(shù)指導(dǎo)站，江蘇徐州 221200；3.徐州永浩牧業(yè)有限公司，江蘇徐州 221200；4.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009）

奶業(yè)是關(guān)系國(guó)民健康的重要產(chǎn)業(yè)，奶牛疫病是制約奶業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵因素之一。長(zhǎng)期高強(qiáng)度的經(jīng)濟(jì)性狀選擇導(dǎo)致奶牛對(duì)疫病的抗性普遍下降，因此，基于適應(yīng)性免疫應(yīng)答性狀的遺傳選育是提高奶牛疾病抗性的重要策略。近年來(lái)，人們開(kāi)始關(guān)注健康性狀的選擇，包括奶中的體細(xì)胞計(jì)數(shù)、奶牛的長(zhǎng)壽性等，但一直沒(méi)有篩選出能夠反映奶牛綜合抗病性的標(biāo)志（性狀）。免疫學(xué)技術(shù)在奶?？共∮N領(lǐng)域的應(yīng)用為奶牛抗病性狀的選育提供了新的思路。有研究表明，適應(yīng)性免疫應(yīng)答性狀受到遺傳因素調(diào)控[1]，其中細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答都具有數(shù)量性狀特征，可估計(jì)育種值，可作為候選性狀用于奶?？共⌒赃x種，以提高其綜合抗病性能[2]。本文將對(duì)這種新興的免疫應(yīng)答性狀選擇技術(shù)在培育抗病奶牛領(lǐng)域中的應(yīng)用和發(fā)展進(jìn)行闡述，為建立新型可定量且易于標(biāo)準(zhǔn)化測(cè)定的奶牛遺傳性免疫能力選擇體系、突破國(guó)外奶牛遺傳性免疫應(yīng)答能力選擇的技術(shù)封鎖、攻克高免疫力奶牛種源“卡脖子”技術(shù)，培育具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的本土化奶牛高免疫力新品系提供理論依據(jù)。

1 奶?？共⌒誀钸x擇研究進(jìn)展

自20 世紀(jì)末以來(lái)，隨著奶業(yè)發(fā)展和牛只健康等問(wèn)題的日益突出，對(duì)奶牛的選育目標(biāo)已經(jīng)由最初產(chǎn)奶、產(chǎn)肉等生產(chǎn)性狀逐步發(fā)展為平衡育種，抗病性狀的選育也逐漸受到人們的重視。抗病性選育是主要基于品種和個(gè)體對(duì)疾病易感性的差異，通過(guò)定向選擇的方法培育對(duì)特定疾病擁有較強(qiáng)抵抗力的奶牛新品種（系）。一般包含2 部分：一是抵抗常見(jiàn)病、傳染病的選育，二是針對(duì)某些遺傳缺陷的選育。奶牛常見(jiàn)疾病包括乳腺炎、瘤胃異位、繁殖疾病、代謝疾病、肢蹄病等，這些疾病的發(fā)生會(huì)導(dǎo)致奶牛生產(chǎn)性能下降，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前，圍繞上述疾病已經(jīng)開(kāi)展了一些抗性選育工作。

1.1 奶牛特定疾病抗性選擇

現(xiàn)有的研究大多集中在針對(duì)某一特定疾病的抗性選育，為此已經(jīng)開(kāi)發(fā)出從表型到分子選育的多種技術(shù)手段。目前奶牛乳腺炎是一個(gè)尚未解決的世界性難題，人們?cè)噲D通過(guò)篩選候選基因開(kāi)展奶牛乳腺炎抗性育種，Usman 等[3]研究發(fā)現(xiàn)，IL-17F 和IL-17A 基因中的單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNP）奶牛乳腺炎的抗性有顯著相關(guān)性，而這些SNP 可以在奶?？谷橄傺子N工作中作為有效的遺傳標(biāo)記。肢蹄病是奶牛養(yǎng)殖中的常見(jiàn)病、高發(fā)病，被列為牧場(chǎng)最重要的動(dòng)物福利指標(biāo)，目前針對(duì)牛肢蹄病的選育主要依賴于選擇體型等間接性狀或根據(jù)肢蹄病發(fā)病記錄進(jìn)行直接選育。Matthew Barden 等[4]以蹄病恢復(fù)情況為指標(biāo)，開(kāi)發(fā)了一種新的選育方法，該方法將動(dòng)物分類為“易感”和“抗病”，在此基礎(chǔ)上建立了牛蹄病選育責(zé)任量表，量表顯示，唯一病變易感性的遺傳率為0.25，表明蹄病恢復(fù)性狀是可遺傳的。因此，可通過(guò)該性狀的選擇性育種減少長(zhǎng)期患有蹄病奶牛的概率，為提高牛群的蹄病抗性提供了一種有效的途徑。

對(duì)于奶牛育種，無(wú)論是通過(guò)表型記錄還是分子選育，對(duì)單一疾病進(jìn)行抗性選育的效果均不明顯并存在一系列問(wèn)題。例如，對(duì)奶牛乳腺炎的抗性選育可能會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)奶量的明顯下降，基于現(xiàn)有抗乳腺炎表型選擇的方法，確定的具有高乳腺炎抗性的奶牛，其產(chǎn)奶量顯著降低[5]。對(duì)奶牛進(jìn)行人工感染特定病原菌后，檢測(cè)相關(guān)反應(yīng)的指標(biāo)也可以用于評(píng)估抗性水平，例如對(duì)布魯氏菌感染導(dǎo)致的流產(chǎn)進(jìn)行檢測(cè)[6]，但存在疾病暴發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，因此這種方法在商業(yè)環(huán)境中并不適用。此外，有研究表明，對(duì)特定病原體的抗性并不具有對(duì)其他病原體的抗性，甚至可能發(fā)生相反的情況[7,8]。

1.2 奶牛健康性狀選擇

針對(duì)單一疾病進(jìn)行牛的抗性選育是不可行的。為了保證牛的生產(chǎn)性能不受影響，并提高牛的適應(yīng)性，降低疾病發(fā)生率，保證抗病育種工作的持續(xù)推進(jìn)，開(kāi)展健康性狀的研究和應(yīng)用勢(shì)在必行。目前，美國(guó)健康性狀分類指數(shù)中包括：乳腺炎、酮病、子宮炎、真胃變位、胎衣不下和產(chǎn)乳熱等6 個(gè)健康性狀[9]。因?yàn)樵S多健康性狀的表型數(shù)據(jù)采集困難，所以在研究中經(jīng)常將其作為整體考慮，統(tǒng)計(jì)特定時(shí)間內(nèi)發(fā)生這類健康事件的次數(shù)。例如，澳大利亞的育種工作者將胎衣不下、子宮炎等各類繁殖疾病組合稱為繁殖性能障礙類健康性狀，其估計(jì)遺傳力為0.01[10]。

保持肢蹄健康對(duì)奶牛場(chǎng)非常重要。研究表明，蹄病對(duì)奶牛的長(zhǎng)壽性和產(chǎn)奶量存在顯著影響[11]。以往的肢蹄性狀健康選育研究大多是被包含在體型外貌性狀中來(lái)開(kāi)展的，牛體型外貌性狀的遺傳評(píng)估研究已經(jīng)進(jìn)行了很多年，然而，近期的研究表明，肢蹄的健康狀況與體型線性評(píng)分之間無(wú)顯著遺傳相關(guān)性，這表明在今后的抗病育種工作中，在選育目標(biāo)中單獨(dú)加入肢蹄健康性狀是十分必要的[12,13]。牛的肢蹄健康性狀是根據(jù)其發(fā)病與否定義的一種二分類閾性狀，可使用混合線性模型進(jìn)行遺傳參數(shù)估計(jì)。因此，為了選育肢蹄健康性狀，需要經(jīng)過(guò)很長(zhǎng)時(shí)間的肢蹄疾病診療記錄的積累，這大大影響了選育的效率。為了解決上述問(wèn)題，各類檢測(cè)奶牛行為的智能化檢測(cè)系統(tǒng)被陸續(xù)開(kāi)發(fā)出來(lái)，通過(guò)奶牛的行為變化來(lái)推測(cè)其肢蹄健康情況[14]。研究結(jié)果表明，奶牛肢蹄健康性狀估計(jì)遺傳力在0.01～0.03[15]。荷蘭和北歐已經(jīng)將肢蹄健康性狀納入奶牛選育指數(shù)中，其權(quán)重為3%～7%。

有關(guān)乳房健康性狀的遺傳選擇在奶業(yè)發(fā)達(dá)國(guó)家開(kāi)展的比較早，起初主要將乳房深度、前乳房附著和牛奶體細(xì)胞數(shù)等指標(biāo)作為乳房健康性狀的標(biāo)志，以此來(lái)間接選擇臨床乳腺炎的抗性，但是臨床乳腺炎抗性的遺傳性能并不能通過(guò)上述乳房健康性狀的標(biāo)志來(lái)完全解釋清楚[16]。因此，各個(gè)國(guó)家陸續(xù)開(kāi)發(fā)了臨床乳腺炎的表型數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)，與牛的肢蹄健康性狀相同，牛乳腺的健康性狀是根據(jù)其發(fā)病與否定義的一種二分類閾性狀，可使用廣義線性模型和線性模型對(duì)其進(jìn)行遺傳參數(shù)估計(jì)[9]，廣義線性模型遺傳力估計(jì)結(jié)果（0.06～0.10）高于線性模型（0.01～0.03）[17]。目前，一些國(guó)家已將臨床乳腺炎抗性加入了選擇指數(shù)中，在法國(guó)和加拿大的奶牛選育指數(shù)中，臨床乳腺炎抗性的權(quán)重分別為7.2%和6.6%[18]。

對(duì)奶牛動(dòng)物福利和生產(chǎn)性能產(chǎn)生影響的健康因素很多，這些因素來(lái)源于不同發(fā)病機(jī)制的疾病，導(dǎo)致健康性狀之間遺傳相關(guān)較小。表型數(shù)據(jù)是影響健康性狀遺傳評(píng)估的主要因素，國(guó)外的研究人員很早便嘗試直接選擇健康性狀，并構(gòu)建了特定的數(shù)據(jù)收集方法和制度以開(kāi)展相關(guān)的研究，然而健康性狀（＜5%）的遺傳力一般比生產(chǎn)性狀（＞30%）低[19]，直接選擇效果較差。

2 免疫應(yīng)答性狀選擇技術(shù)原理與應(yīng)用現(xiàn)狀

免疫應(yīng)答是指免疫系統(tǒng)識(shí)別和清除入侵的病原微生物以及機(jī)體內(nèi)突變的細(xì)胞和衰老、死亡細(xì)胞的整個(gè)過(guò)程，可分為固有免疫和適應(yīng)性免疫兩大類。固有免疫又稱先天性免疫，適應(yīng)性免疫又稱獲得性免疫。目前對(duì)于奶牛而言，針對(duì)固有免疫性狀的測(cè)定尚無(wú)標(biāo)準(zhǔn)方法，盡管已經(jīng)有學(xué)者開(kāi)始關(guān)注血液中的中性粒細(xì)胞數(shù)量等性狀，但是選擇的具有高中性粒細(xì)胞的奶牛的抗病性能并不理想。相反，適應(yīng)性免疫已被證明受遺傳影響較大，相應(yīng)的細(xì)胞及體液免疫應(yīng)答性狀測(cè)定方法已被成功開(kāi)發(fā)并應(yīng)用在了種公牛的選種選育工作中。本文探討的免疫應(yīng)答性狀選擇技術(shù)主要指能在奶牛育種和生產(chǎn)上應(yīng)用的適應(yīng)性免疫性狀測(cè)定技術(shù)。

2.1 免疫應(yīng)答性狀選擇技術(shù)原理

免疫應(yīng)答性狀選擇技術(shù)是加拿大圭爾夫大學(xué)等研究人員開(kāi)發(fā)的一種測(cè)定奶牛細(xì)胞及體液免疫應(yīng)答性狀的方法，根據(jù)該方法將奶牛的免疫力定義為“高、中、低”三個(gè)不同的水平，以此來(lái)對(duì)奶牛的綜合抗病性能進(jìn)行選擇。其原理是對(duì)奶牛注射模式抗原后，檢測(cè)奶牛的免疫應(yīng)答反應(yīng)程度，以此來(lái)衡量細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答性狀水平。細(xì)胞免疫應(yīng)答性狀的檢測(cè)方法是手動(dòng)測(cè)量VI 型超敏反應(yīng)引起的皮褶厚度，該方法的原理是：在模式抗原刺激奶牛產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答后，再用相同的抗原進(jìn)行皮試，可誘導(dǎo)遲發(fā)型超敏反應(yīng)。激活的T 細(xì)胞會(huì)釋放多種細(xì)胞因子，產(chǎn)生以單個(gè)細(xì)胞浸潤(rùn)為主的局部炎癥反應(yīng)，陽(yáng)性反應(yīng)表現(xiàn)為局部紅腫和硬結(jié)，通過(guò)陽(yáng)性反應(yīng)的強(qiáng)度可以確定細(xì)胞免疫的水平。體液免疫應(yīng)答性狀檢測(cè)是通過(guò)間接酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）來(lái)測(cè)定奶牛血清中的特異性抗體滴度，該方法的原理是：在模式抗原刺激奶牛產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答后，B 細(xì)胞會(huì)分泌抗原特異性抗體來(lái)保護(hù)機(jī)體，將該模式抗原包被96 孔酶標(biāo)板，并通過(guò)間接ELISA 測(cè)定該抗原免疫后的奶牛血清中的特異性抗體滴度。目前，相關(guān)方法已被申請(qǐng)國(guó)際專利保護(hù)，并被加拿大先馬士育種公司應(yīng)用于種公牛的選擇，以開(kāi)發(fā)具有高免疫力遺傳物質(zhì)的凍精產(chǎn)品。

2.2 免疫應(yīng)答性狀選擇技術(shù)應(yīng)用及優(yōu)化

研究人員對(duì)加拿大荷斯坦牛的細(xì)胞及體液免疫應(yīng)答水平分別進(jìn)行了遺傳分析，發(fā)現(xiàn)這些性狀的遺傳力在0.16～0.41[20]，處于中等水平，說(shuō)明性狀比較穩(wěn)定，具有良好的抗病育種應(yīng)用價(jià)值。已有研究表明，在犢牛中，抗雞蛋清溶菌酶和抗人紅細(xì)胞抗原抗體水平的遺傳率分別為0.48 和0.31[21]。而另外一項(xiàng)包括了42 個(gè)不同品種牛的研究報(bào)告指出，細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答性狀的遺傳力分別為0.19 和0.16[20]。因此，研究這些性狀與產(chǎn)奶、繁殖和健康等因素之間的遺傳關(guān)系，對(duì)提高動(dòng)物健康狀況、適應(yīng)性和繁殖能力具有重要意義。國(guó)外奶牛育種公司篩選了具有高免疫反應(yīng)的種公牛，并利用其精液進(jìn)行配種，以提高牛群的疾病抗性。根據(jù)國(guó)內(nèi)牛群中的研究：在犢牛階段，高免疫反應(yīng)水平公牛后代的消化道疾病發(fā)病率比普通公牛的后代下降了30.11%；在成母牛階段，高免疫反應(yīng)水平公牛后代的乳房炎發(fā)病率相比普通公牛的后代降低了45.66%（表1）[22]。

表1 不同免疫應(yīng)答水平公牛后代各類疾病的發(fā)病情況[21]

本課題組總結(jié)國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究?jī)?nèi)容，深度解析了已經(jīng)被申請(qǐng)專利的現(xiàn)有免疫應(yīng)答性狀測(cè)定技術(shù)，并優(yōu)化了現(xiàn)有技術(shù)的免疫方案（圖1）。將原有的1 次模式抗原免疫增加至2 次，并在免疫后的第21 天進(jìn)行免疫應(yīng)答性狀的檢測(cè)。優(yōu)化后的方案兼容了免疫記憶效應(yīng)，可在最大程度上反應(yīng)被測(cè)動(dòng)物的免疫應(yīng)答能力，并考慮了免疫應(yīng)答性狀值的變化幅度，進(jìn)而使測(cè)得的各項(xiàng)數(shù)據(jù)更加準(zhǔn)確。

圖1 免疫應(yīng)答性狀測(cè)定的免疫方案

本課題組現(xiàn)已采用上述優(yōu)化后的免疫應(yīng)答性狀測(cè)定方法，測(cè)定了千余頭中國(guó)荷斯坦成年母牛并獲得了一批高、中、低免牛。目前，正在通過(guò)單細(xì)胞測(cè)序和多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)深度挖掘“高免?！焙汀暗兔馀！钡男滦蜕飿?biāo)志物，并采用細(xì)胞與分子免疫學(xué)方法，通過(guò)比較免疫學(xué)分析，鑒定奶牛天然免疫能力選擇指標(biāo)或組合，建立新型可定量且易于標(biāo)準(zhǔn)化測(cè)定的奶牛遺傳性免疫能力選擇體系。本研究旨在突破國(guó)外奶牛遺傳性免疫應(yīng)答能力選擇技術(shù)的封鎖，攻克高免疫力奶牛種源“卡脖子”技術(shù)，并為培育具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的本土化奶牛高免疫力新品系提供理論依據(jù)和試驗(yàn)支撐。

除此之外，根據(jù)免疫應(yīng)答性狀的分類，對(duì)牛進(jìn)行高免、中免和低免的群體劃分，有利于免疫應(yīng)答性狀在生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用推廣。如圖2 所示，先前的研究使用“四分位數(shù)”將不同免疫應(yīng)答性狀表型的牛劃分為高免、中免和低免牛。該方法避免了因均值和標(biāo)準(zhǔn)差不同所導(dǎo)致的高免、低免牛數(shù)量的差異，與生產(chǎn)實(shí)際更加吻合。此外，育種值分類已獨(dú)立用于高免牛和低免牛的篩選[23]，且研究表明，其與表型分類的結(jié)果相一致。Bateman 等[24,25]人利用適應(yīng)性免疫應(yīng)答性狀的育種值選擇高免疫反應(yīng)性和低免疫反應(yīng)性的豬，研究結(jié)果顯示，在第1 個(gè)世代中高免疫反應(yīng)的育種值為0.23，低免疫反應(yīng)的育種值為-0.17，經(jīng)過(guò)8 代選擇后，高免疫反應(yīng)性的育種值達(dá)到0.47，而低免疫反應(yīng)性的育種值為-0.08。上述表型和育種值分類均考慮到了動(dòng)物的遺傳因素，但從商業(yè)推廣層面來(lái)看，使用表型分類更實(shí)際，因此目前主要使用表型分類來(lái)鑒定奶牛的適應(yīng)性免疫應(yīng)答性狀水平。

圖2 奶牛免疫應(yīng)答性狀表型分類

Heriazon 等[2]研究表明，細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答性狀表型之間呈負(fù)相關(guān)。在抗原刺激后，B 細(xì)胞分泌抗體并發(fā)揮體液免疫功能，而T 細(xì)胞則分化為細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞及其他功能亞群并發(fā)揮細(xì)胞免疫效應(yīng)。在胸腺依賴性抗原（TD 抗原）的識(shí)別和清除過(guò)程中，B 細(xì)胞在提呈抗原后，需要Th 細(xì)胞的輔助才能產(chǎn)生抗體；然而對(duì)于非胸腺依賴性抗原（TI 抗原），則無(wú)需Th 細(xì)胞輔助即可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體[26]。因此，體液免疫和細(xì)胞免疫雖然效應(yīng)機(jī)制不同，但卻是彼此關(guān)聯(lián)、相互調(diào)控的?；谄渌麆?dòng)物的研究表明，利用“高體液免疫應(yīng)答”這一標(biāo)準(zhǔn)篩選出的小鼠和雞，對(duì)胞外病原體的感染表現(xiàn)出高抗性，但對(duì)胞內(nèi)病原體易感[27]。因此，在商業(yè)應(yīng)用中，為了培育出綜合抗病能力強(qiáng)的 “高免牛新品系”，建議對(duì)細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答性狀同時(shí)進(jìn)行測(cè)試，并以此定義高免、中免和低免牛。同時(shí)，需要對(duì)每個(gè)免疫應(yīng)答性狀的表型或育種值進(jìn)行合理的加權(quán)，進(jìn)而創(chuàng)建一個(gè)平衡的指數(shù)，以實(shí)現(xiàn)兩個(gè)性狀的同步遺傳改良，并保持或改進(jìn)育種指數(shù)中包含的其他性狀（例如生產(chǎn)性狀等）。

現(xiàn)有研究表明，與牛群中的普通奶牛相比，具有卓越適應(yīng)性免疫應(yīng)答反應(yīng)的奶牛能夠更好地消除病原菌，并更快地恢復(fù)免疫穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而防止乳腺炎等奶牛常見(jiàn)炎癥類疾病的發(fā)生[28-30]。一項(xiàng)關(guān)于適應(yīng)性免疫應(yīng)答性狀對(duì)奶牛乳腺炎發(fā)病率影響的研究表明，細(xì)胞及體液免疫應(yīng)答性狀與體細(xì)胞評(píng)分、乳腺炎發(fā)病率顯著相關(guān)。除此之外，免疫性狀還可能與生產(chǎn)性狀之間存在相互作用關(guān)系。在豬中的研究表明，適應(yīng)性免疫應(yīng)答性狀的遺傳選擇加快了豬的出欄速度[24]；而在牛中的研究表明，提高產(chǎn)量的遺傳選擇增加了疾病的易感性[31]。因此，將免疫應(yīng)答性狀納入育種選擇指標(biāo)是非常具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的，并且還可以避免在選擇其他性狀（如產(chǎn)量）時(shí)，對(duì)免疫應(yīng)答性狀的選擇可能產(chǎn)生的負(fù)面反應(yīng)。

3 免疫應(yīng)答性狀選擇技術(shù)發(fā)展趨勢(shì)

免疫應(yīng)答性狀在牛的育種工作中屬于一個(gè)新性狀，目前僅在加拿大、美國(guó)等奶業(yè)發(fā)達(dá)國(guó)家推廣試用。任何一個(gè)新性狀在育種中的應(yīng)用都是在不斷的實(shí)踐中逐漸走向成熟的。通常，隨著行業(yè)新需求的產(chǎn)生，研究人員會(huì)關(guān)注一些新的性狀，并且開(kāi)展相關(guān)的試驗(yàn)來(lái)收集新性狀的數(shù)據(jù)，進(jìn)而逐步構(gòu)建出新性狀的評(píng)價(jià)方法和體系。通過(guò)經(jīng)濟(jì)重要性分析法來(lái)確定各性狀在選擇指標(biāo)中的權(quán)重，并收集更大規(guī)模的數(shù)據(jù)來(lái)逐步開(kāi)展該性狀的大規(guī)模評(píng)價(jià)和育種。在該性狀的選育過(guò)程中，可以觀察和測(cè)試選育效果，并實(shí)時(shí)調(diào)整相應(yīng)的選育策略和方法。由此可見(jiàn)，針對(duì)任何一個(gè)性狀的選種選育工作都不是一朝一夕的，需要大量時(shí)間積累相關(guān)數(shù)據(jù)，所以選種選育工作要求具備一定的預(yù)見(jiàn)性。綜上所述，總結(jié)奶業(yè)發(fā)達(dá)國(guó)家的育種經(jīng)驗(yàn)，并在中國(guó)的牛群中進(jìn)行相關(guān)研究是非常有意義的。

3.1 免疫應(yīng)答性狀選擇技術(shù)的新突破

加拿大先馬士公司率先將免疫應(yīng)答性狀選擇技術(shù)應(yīng)用在種公牛的選育工作中，并開(kāi)發(fā)出了“免疫大師”凍精產(chǎn)品，相關(guān)技術(shù)已申請(qǐng)國(guó)際專利，該凍精產(chǎn)品推向市場(chǎng)后獲得了廣泛的好評(píng)。雖然該技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用于種公牛的抗病選擇，但仍存在很多不足之處。例如，現(xiàn)有的技術(shù)需要對(duì)牛進(jìn)行保定，工作量巨大，并且測(cè)定過(guò)程以人工測(cè)量為主，存在一定誤差，因此目前僅用于極少的高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的種公牛選擇，無(wú)法廣泛應(yīng)用于其他種公牛和后備母牛。除此之外，目前關(guān)于免疫應(yīng)答性狀的相關(guān)研究大多集中在表型分析方面，缺乏關(guān)于其遺傳機(jī)制的研究，在一定程度上阻礙了該技術(shù)的推廣。因此，研究者們一直在對(duì)相關(guān)方法不斷進(jìn)行完善。

中國(guó)市場(chǎng)的奶牛凍精需求量巨大，目前很多牧場(chǎng)已經(jīng)開(kāi)始使用“免疫大師”凍精產(chǎn)品。因此，對(duì)免疫應(yīng)答性狀進(jìn)行研究，挖掘新型生物標(biāo)志物，尤其是開(kāi)發(fā)新型的、具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的免疫應(yīng)答性狀測(cè)定技術(shù)十分重要。和美國(guó)、加拿大、荷蘭等國(guó)家相比，中國(guó)在奶牛育種領(lǐng)域的研究還相對(duì)落后，對(duì)奶牛免疫性狀選育的相關(guān)工作更是乏善可陳。通過(guò)深入解析奶牛免疫應(yīng)答性狀的遺傳機(jī)制，進(jìn)而挖掘新型免疫應(yīng)答性狀標(biāo)志，建立新型免疫應(yīng)答性狀測(cè)定技術(shù)體系，可實(shí)現(xiàn)在該領(lǐng)域的“彎道超車(chē)”。對(duì)此，本課題組在國(guó)內(nèi)外率先進(jìn)行了不同免疫應(yīng)答性狀中國(guó)荷斯坦牛外周血單個(gè)核細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序工作，首次對(duì)牛T、B 細(xì)胞進(jìn)行了多亞群的Marker 基因鑒定和細(xì)胞注釋，并繪制了中國(guó)荷斯坦牛T、B細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜，揭示了不同免疫應(yīng)答性狀中國(guó)荷斯坦牛外周血免疫細(xì)胞的異質(zhì)性。在此基礎(chǔ)上，創(chuàng)新性地建立了用于中國(guó)荷斯坦牛T、B 細(xì)胞表型及功能分析的七色流式細(xì)胞術(shù)方案，并利用該方案首次對(duì)不同免疫應(yīng)答性狀奶牛的細(xì)胞及體液免疫應(yīng)答進(jìn)行了系統(tǒng)而全面的分析，揭示了中國(guó)荷斯坦牛適應(yīng)性免疫應(yīng)答過(guò)程中各T、B 細(xì)胞亞群的動(dòng)態(tài)變化及應(yīng)答機(jī)制。本課題組已成功挖掘了可用于評(píng)價(jià)牛適應(yīng)性免疫應(yīng)答能力的T、B 細(xì)胞亞群生物標(biāo)志，并基于新型生物標(biāo)志開(kāi)發(fā)出一套高效、便捷、標(biāo)準(zhǔn)化的適應(yīng)性免疫應(yīng)答水平測(cè)定方法。利用以上方法在1000 余頭中國(guó)荷斯坦牛中進(jìn)行了初步試用，選育出的“高免?！本C合抗病性能顯著提高。目前本課題組正在逐步擴(kuò)大該方法的應(yīng)用范圍，進(jìn)行中國(guó)荷斯坦?！案呙庑缕废怠钡呐嘤ぷ?。

3.2 與其他育種技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用

免疫應(yīng)答性狀選擇技術(shù)與其他先進(jìn)抗病育種技術(shù)的結(jié)合是未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)，基因組選擇為改善免疫應(yīng)答性狀提供了一種具有應(yīng)用前景的工具。由于免疫應(yīng)答表型的測(cè)量工作相對(duì)繁瑣，基因組學(xué)檢測(cè)可能是一種更好的解決方案，通過(guò)使用有關(guān)動(dòng)物遺傳學(xué)的可用數(shù)據(jù)，挖掘與高、低免疫應(yīng)答相關(guān)的遺傳效應(yīng)，將免疫反應(yīng)性狀納入基因組育種指數(shù)，以改善畜群健康狀況并降低乳腺炎等疾病的發(fā)病率。

除此之外，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，其在動(dòng)物遺傳育種領(lǐng)域的應(yīng)用頻率日益增加，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的誕生也為動(dòng)物遺傳育種相關(guān)研究提供了新的技術(shù)方法。單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)是指對(duì)單細(xì)胞的基因組進(jìn)行高通量測(cè)序分析，目前該項(xiàng)技術(shù)在不同家畜的育種工作中均有應(yīng)用。在豬的研究中，通過(guò)對(duì)豬的胚胎細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，構(gòu)建了豬早期胚胎的轉(zhuǎn)錄組圖譜，發(fā)現(xiàn)了很多新的基因[32]，相關(guān)結(jié)果豐富了豬的遺傳資源，對(duì)改善豬的重要性狀具有重要的意義；在牛的研究中，通過(guò)對(duì)牛的性腺細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，系統(tǒng)性分析了牛的原始生殖細(xì)胞的遺傳特征，發(fā)現(xiàn)牛的生殖細(xì)胞系與人類相似[33]。本課題組在該領(lǐng)域也有所探索，利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)深入分析了不同免疫應(yīng)答性狀的中國(guó)荷斯坦牛外周血免疫細(xì)胞的異質(zhì)性，通過(guò)對(duì)這些細(xì)胞亞群的差異基因篩選及功能富集分析，初步揭示了“高免?！焙汀暗兔馀！北憩F(xiàn)出的免疫力差異遺傳機(jī)制，為建立新型可定量、易于標(biāo)準(zhǔn)化測(cè)定的奶牛遺傳性免疫能力選擇方法提供了初步的理論依據(jù)和試驗(yàn)支撐。

4 小結(jié)

長(zhǎng)期高強(qiáng)度的生產(chǎn)性能選育降低了奶牛的抗病性能，疾病的頻發(fā)給養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，抗生素的使用帶來(lái)了潛在的食品安全和公共衛(wèi)生問(wèn)題。因此，通過(guò)抗病育種提升奶牛綜合抗病能力，是改善奶牛健康、降低疾病發(fā)生的重要途徑。傳統(tǒng)的特定疾病抗性選擇和健康性狀選擇周期長(zhǎng)、進(jìn)展小，并且存在生產(chǎn)性能降低和“一病消、多病長(zhǎng)”的風(fēng)險(xiǎn)。因此，挖掘能夠反映奶牛綜合抗病能力，并且易于測(cè)定應(yīng)用的抗病性狀或標(biāo)志是奶牛育種工作中迫切需要解決的重大科學(xué)問(wèn)題。

畜禽免疫學(xué)相關(guān)研究和新技術(shù)的發(fā)展為解決上述問(wèn)題提供了新思路。動(dòng)物的抗病性能主要取決于自身的免疫系統(tǒng)，適應(yīng)性免疫應(yīng)答作為機(jī)體抵御感染的“最后一道防線”，具有高效性、特異性和記憶性。細(xì)胞和抗體介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫應(yīng)答分別主要針對(duì)胞內(nèi)和胞外病原體，它們與天然免疫系統(tǒng)分工協(xié)作并相互配合。動(dòng)物的一般抗病性，可以理解為健康性或廣譜抗病性。因此，如果同時(shí)對(duì)細(xì)胞和體液免疫性狀進(jìn)行選擇，那么對(duì)于任何病原體，機(jī)體都會(huì)擁有良好的自我保護(hù)能力，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)一般抗病性的遺傳改良。細(xì)胞和體液免疫性狀已被證明具有數(shù)量性狀特征，是提高奶牛一般抗病性更好的候選性狀，可用于奶牛抗病性選種，根據(jù)該表型性狀篩選的奶牛具有較低的傳染性和代謝性疾病的發(fā)生率、對(duì)疫苗更好的響應(yīng)和更高的乳品質(zhì)。然而現(xiàn)有的性狀測(cè)定方法周期長(zhǎng)、操作程序復(fù)雜、成本高、技術(shù)要求高，目前世界上僅應(yīng)用于少量種公牛的選擇，未來(lái)還需要對(duì)上述測(cè)定方法不斷進(jìn)行優(yōu)化簡(jiǎn)化，以便適用于更大群體的后備青年牛和成母牛的選種選育工作。同時(shí)，對(duì)相關(guān)性狀與疾病深入關(guān)聯(lián)機(jī)制的研究也可能成為一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。建立新型可定量、易于標(biāo)準(zhǔn)化測(cè)定的奶牛遺傳性免疫能力選擇指標(biāo)以及選擇方法，早期識(shí)別和選擇具有高水平先天免疫應(yīng)答能力的青年牛，提高奶牛健康水平，培育具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、適應(yīng)性強(qiáng)的本土化奶牛高免疫力新品系，將是奶牛育種領(lǐng)域的重要趨勢(shì)。