張峰，耿曉丹，趙晨雨，趙伊萍，王昀，田國祥，劉鵬

糖尿病腎?。―KD）是糖尿病（DM）的重要微血管并發(fā)癥之一，占所有終末期腎病病例的40%以上[1]。最近的數(shù)據(jù)表明，世界上大約9%的成年人受到DKD的影響，并且糖尿病人中DKD的患病率接近70%；預(yù)計(jì)2035年，全球?qū)⒂?.92億人患有糖尿病[2,3]。遺傳因素與DKD的發(fā)生和發(fā)展直接相關(guān)，包括家族聚集性和不同種族之間的可變發(fā)病率[4,5]。因此，在DKD的預(yù)測(cè)和預(yù)防中，確定DKD的潛在易感基因位點(diǎn)勢(shì)在必行。

ABCA1基因位于人類染色體9q31上，是編碼一種促進(jìn)膽固醇和磷脂流出的完整細(xì)胞膜蛋白。研究發(fā)現(xiàn)DKD患者的巨噬細(xì)胞和足細(xì)胞中ABCA1受損導(dǎo)致膽固醇流出減少[4,5]。ABCA1基因rs2230806的基因座位于ABCA1蛋白的主要細(xì)胞外環(huán)中，其在膽固醇流出中具有重要作用[7]。rs2230806也是最廣泛研究的常見錯(cuò)義多態(tài)性，對(duì)亞洲人的研究報(bào)道ABCA1 SNP（rs2230806，也稱為R219K或G1051A）與2型糖尿病相關(guān)[8]。

老年人群身體代謝能力降低，體質(zhì)較弱，在患有DKD后可能出現(xiàn)高膽固醇血癥。因此，促進(jìn)膽固醇流出的ABCA1的功能對(duì)于老年DKD患者尤為重要。由于動(dòng)脈粥樣硬化是2型糖尿病導(dǎo)致心血管疾病最重要的原因之一，其嚴(yán)重程度可預(yù)測(cè)T2DM 患者發(fā)生心腦血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[9]。本研究旨在探討ABCA1基因rs2230806位點(diǎn)多態(tài)性與老年糖尿病腎病患者動(dòng)脈粥樣硬化病變程度的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象參照WHO（1999）指南對(duì)糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)以及K-DOQI指南對(duì)DKD的診斷標(biāo)準(zhǔn)，在北京中醫(yī)醫(yī)院順義醫(yī)院納入400例有7年及以上病史的60周歲以上的2型糖尿病患者，其中205例未伴有腎臟病的病例作為對(duì)照組，195例伴有腎臟病的病例作為觀察組。所有患者均已簽署知情同意書，同時(shí)本研究已得到北京中醫(yī)醫(yī)院順義醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 基因多態(tài)性采集患者的年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)（BMI）、糖尿病持續(xù)時(shí)間、血壓、血肌酐（Scr）、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）的信息。使用以下方程計(jì)算動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)（AI）：AI=[（TC）-（HDL-C）]/[HDL-C]。收集患者外周靜脈血，使用QIAamp DNA Blood Mini Kit （德國Qiagen公司）提取基因組DNA。使用TaqMan SNP基因分型分析（美國Applied Biosystems公司）和ABI PRISM 7500 fast序列檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)患者樣品進(jìn)行基因分型。上游引物5’-GTGTCCTGTCATTGTGCCTTGT-3’，下游引物5’-CTCCCAGCCAGCCGTACTTT-3’。PCR程序?yàn)?5℃預(yù)孵育10 min，92℃變性15 s，60℃延伸60 s，共40個(gè)循環(huán)。隨后，隨機(jī)選擇的PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA測(cè)序驗(yàn)證以確認(rèn)基因分型的準(zhǔn)確性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析統(tǒng)計(jì)分析軟件采用SPSS 22.0軟件包，臨床數(shù)據(jù)計(jì)數(shù)資料以例數(shù)（構(gòu)成比）及以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，并通過卡方檢驗(yàn)進(jìn)行測(cè)試以檢測(cè)患者臨床特征的差異。使用卡方檢驗(yàn)比較了SNP的Hardy-Weinberg平衡分析以及SNP的基因型和等位基因頻率。通過三種遺傳模型（加性，顯性和隱性）的多變量邏輯回歸分析，同時(shí)對(duì)年齡和性別進(jìn)行校正。

2 結(jié)果

2.1 伴和不伴有腎臟疾病的糖尿病患者的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)和臨床特征本研究共有400例參與者，其中DKD組195例，男性110例，女性85例；DM組205例，男性95例，女性110例。在各臨床特征中，年齡、性別、高血壓病史、收縮壓、血清肌酐、TG差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；BMI、糖尿病病史、舒張壓、TC、HDL-C、LDL-C、AI差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表1。

表1 DKD組與DM組各臨床指標(biāo)的對(duì)比

2.2 ABCA1 rs2230806基因型和等位基因頻率分布DM與DKD兩組基因型和等位基因頻率均在Hardy-Weinberg平衡內(nèi)（P＞0.05），且其次要等位基因頻率超過5%。兩組基因型和等位基因頻率之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（基因型頻率，P=0.037；等位基因頻率，P=0.011），表2。

表2 ABCA1 rs2230806基因型和等位基因頻率分布

2.3 ABCA1 rs2230806基因多態(tài)性與DKD的關(guān)系我們通過三種統(tǒng)計(jì)模型（加性，顯性和隱性）來檢驗(yàn)rs2230806多態(tài)性與DKD的基因型關(guān)聯(lián)。在顯性模型中，發(fā)現(xiàn)以AA作為參照，AG+GG基因型的DKD風(fēng)險(xiǎn)顯著降低（AG+GG比AA：優(yōu)勢(shì)比（OR=1.735，95%CI：1.097~2.745，P=0.019）。在加性模型中和隱性模型中，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)性別年齡校正后，結(jié)果未發(fā)生變化，表3。

表3 ABCA1 rs2230806基因多態(tài)性與DKD的關(guān)系

2.4 根據(jù)AI進(jìn)行分組后ABCA1 rs2230806基因型和等位基因頻率分布動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)（AI）≥4表明已經(jīng)發(fā)生了動(dòng)脈硬化，數(shù)值越大動(dòng)脈硬化的程度也就越重，發(fā)生心腦血管事件的危險(xiǎn)性也就越高。根據(jù)患者AI值分為AI正常和AI異常組進(jìn)行亞組分析。在AI異常組中，兩組基因型和等位基因頻率之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（基因型頻率，P=0.024；等位基因頻率，P=0.026）。在AI正常組中，DM與DKD兩組基因型和等位基因頻率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表4。

2.5 在AI正常及AI異常組ABCA1 rs2230806基因多態(tài)性與DKD的關(guān)系基于上述結(jié)果，我們對(duì)TC及TG正常組中ABCA1 rs2230806基因多態(tài)性與DKD的關(guān)系進(jìn)行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在AI異常組隱性模型中，發(fā)現(xiàn)以AA+AG作為參照，GG基因型的心血管事件的發(fā)生率顯著降低[AA+AG比GG：優(yōu)勢(shì)比（OR=3.214，95%CI：1.217~8.488，P=0.018]。根據(jù)性別年齡校正后，結(jié)果未發(fā)生變化。在AI異常組顯性模型中，發(fā)現(xiàn)以AA作為參照，AG+GG基因型的心血管事件的發(fā)生率顯著降低[AG+GG比AA：優(yōu)勢(shì)比（OR=2.718，95%CI：1.012~7.300，P=0.047]。根據(jù)性別年齡校正后，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表5。

表5 ABCA1 rs2230806基因多態(tài)性與DKD的關(guān)系

3 討論

由于目前DKD療效不理想，已成為全世界慢性透析的主要原因，嚴(yán)重危害人類健康。老年DKD患者身體代謝能力降低，體質(zhì)較弱，在患有DKD后可能出現(xiàn)高膽固醇血癥和動(dòng)脈粥樣硬化，增加心血管事件發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[9]。因此，早期預(yù)測(cè)DKD的動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)至關(guān)重要。

ABCA1促進(jìn)脂質(zhì)的溶解和釋放，介導(dǎo)游離膽固醇從細(xì)胞中流出，這是膽固醇逆向運(yùn)輸?shù)脑缙诓襟E。ABCA1基因的分子缺陷導(dǎo)致丹吉爾病，其特征是高密度脂蛋白缺乏、蛋白尿和早期動(dòng)脈粥樣硬化[10]。此外，一些研究報(bào)告稱，ABCA1的遺傳變異與個(gè)體患冠狀動(dòng)脈疾病的風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)[11,12]。由于基因多態(tài)性研究可為疾病的早期診斷、預(yù)防和治療提供新的思路，近年來針對(duì)ABCA1 rs2230806多態(tài)性研究已成為研究熱點(diǎn)。rs2230806多態(tài)性控制肽的殘基219處的精氨酸被賴氨酸取代。這種替代可能影響ABCA1的功能，導(dǎo)致膽固醇代謝異常。研究表明，ABCA1 rs2230806多態(tài)性與嚴(yán)重血脂異常[13]，如冠心病[14]和肥胖癥[15]顯著相關(guān)。

本研究檢測(cè)了400例老年糖尿病患者ABCA1基因rs2230806位點(diǎn)多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)老年糖尿病患者存在ABCA1基因多態(tài)性，AA、A等位基因患者糖尿病腎病風(fēng)險(xiǎn)較AG、GG、G等位基因增加，提示攜帶A等位基因具有較高的糖尿病腎病患病風(fēng)險(xiǎn)。鑒于ABCA1介導(dǎo)的膽固醇代謝在動(dòng)脈粥樣硬化中的關(guān)鍵作用，我們進(jìn)一步分析ABCA1基因rs2230806位點(diǎn)多態(tài)性與動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)≥4的老年糖尿病患者中，AA、A等位基因患者心血管事件的發(fā)生率較AG、GG、G等位基因顯著增加（P＜0.05）；說明ABCA1基因基因突變與動(dòng)脈粥樣硬化嚴(yán)重程度有關(guān)，支持了ABCA1在膽固醇代謝中發(fā)揮重要作用的觀點(diǎn)。此外，這些數(shù)據(jù)有力地支持了糖尿病腎病患者心血管事件發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)較高的觀點(diǎn)，并表明遺傳因素與致動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)記物相關(guān)[16]。

我們的研究證實(shí)攜帶ABCA1基因rs2230806 AA基因型的人群中，DKD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及心血管事件的發(fā)生率較高，這可能與攜帶AA基因型人群中血清總膽固醇水平較高有關(guān)。但仍需要進(jìn)一步的研究來研究這種關(guān)系的生物學(xué)機(jī)制，為今后研究相關(guān)基因藥物提供理論依據(jù)。