陳云憲，張文濤，梁家榮，涂少文，周錫文，陳志鑫，夏玨，唐良秋

ST段抬高型心肌梗死（STEMI）是一種表現(xiàn)為相應(yīng)心電圖導(dǎo)聯(lián)ST段抬高的急性冠脈閉塞性疾病，有較高的發(fā)病率和死亡率，常引起心源性死亡、慢性心力衰竭、心律失常等心臟并發(fā)癥[1]。冠狀動(dòng)脈（冠脈）粥樣硬化引起冠脈狹窄和斑塊破裂導(dǎo)致急性血栓形成是STEMI的主要發(fā)病過程，而炎癥反應(yīng)則是貫穿整個(gè)發(fā)病過程的重要環(huán)節(jié)[2]。長鏈非編碼RNA（LncRNA）是一類長度超過200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，越來越多研究證實(shí)許多不同類型的LncRNA在STEMI的發(fā)病中起著重要作用，包括調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡、自噬、壞死、氧化應(yīng)激、炎癥等[3]。最近有學(xué)者發(fā)現(xiàn)[4]，冠心病患者的外周血單核細(xì)胞（PBMCs）和血漿中LncRNA OTTHUMT00000387022（CoroMarker）表達(dá)明顯增加，其中LncRNA CoroMarker診斷冠心病的AUC高達(dá)0.940，是冠脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┑囊环N新型特異性生物標(biāo)志物。CoroMarker與炎癥呈負(fù)相關(guān)的基因聚集在一起，可能起到調(diào)控炎癥的作用。對(duì)于LncRNA CoroMarker是否在STEMI中也存在著生物學(xué)作用目前尚未見相關(guān)研究，本文通過分析STEMI患者PBMCs中CoroMarker和血漿細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）的表達(dá)水平，闡述CoroMarker在STEMI中的意義。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象與分組連續(xù)選取2020年7月至2021年1月于廣東省韶關(guān)市粵北人民醫(yī)院心血管內(nèi)科住院確診為STEMI的患者30例作為研究對(duì)象（STEMI組），其中男性36例，女性14例，年齡43~72（60.03±8.69）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有STEMI患者均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)2019 年《急性ST段抬高型心肌梗死診斷和治療指南》診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，均行急診冠脈介入手術(shù)，證實(shí)存在冠脈急性閉塞。排除標(biāo)準(zhǔn)：嚴(yán)重肝腎功能損害、重癥感染性疾病、心力衰竭、嚴(yán)重的心臟瓣膜疾病、嚴(yán)重心律失常、惡性腫瘤、血液系統(tǒng)性疾病和自身免疫系統(tǒng)疾病。另選取本院體檢中心同時(shí)期健康體檢的無冠心病人群30例作為對(duì)照組，其中男性30例，女性20例，年齡40~67（56.77±7.68）歲。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，經(jīng)患者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 收集一般臨床資料、生化指標(biāo)和預(yù)后資料收集所有研究對(duì)象一般臨床資料，包括性別、年齡、血壓、吸煙史、高血壓史及糖尿病史等。收集血常規(guī)、血脂、電解質(zhì)、心肌肌鈣蛋白T（cTnT）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、血肌酐（SCr）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、左室射血分?jǐn)?shù)（EF）等檢查指標(biāo)。記錄患者住院期間和出院后1年內(nèi)主要不良心血管事件（MACE）發(fā)生情況，包括：心源性死亡；再發(fā)急性心肌梗死；心絞痛反復(fù)發(fā)作；惡性心律失常（如室性心動(dòng)過速、心室顫動(dòng)、嚴(yán)重的心動(dòng)過緩）；支架內(nèi)血栓形成；心源性休克；心力衰竭：包括急性心力衰竭或心功能評(píng)定為紐約心臟協(xié)會(huì)（NYHA）Ⅲ~Ⅳ級(jí)。

1.2.2 CoroMarker和MCP-1檢測(cè)所有入選對(duì)象入院后即刻采集5 ml靜脈血于EDTA抗凝管中，控溫離心機(jī)4 ℃、3000 r/min離心血液樣本10 min。吸取上層血漿樣本至1.5 mL離心管中，保存于超低溫冰箱（-80 ℃），待樣本收集完畢后統(tǒng)一采用ELISA法檢測(cè)血漿MCP-1水平。離心下層血液樣本加入淋巴細(xì)胞分離液2.5 mL，以20 ℃、400 g的條件離心30 min，提取PBMCs。使用Trizol法提取RNA，用RNase free的水溶解沉淀。核酸蛋白定量儀檢測(cè)RNA濃度，瓊脂糖電泳檢測(cè)RNA完整性。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作。qRTPCR法檢測(cè)PBMCs中CoroMarker的表達(dá)情況。根據(jù)Genebank中CoroMarker序列，使用primer 6.0軟件設(shè)計(jì)引物（表1）。

表1 實(shí)驗(yàn)用PCR 引物序列及擴(kuò)增片段大小

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，正態(tài)分布的計(jì)量資料兩組間比較采用t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布的計(jì)量資料兩組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)Mann-Whitney U檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)（構(gòu)成比）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)。CoroMarker對(duì)STEMI的診斷價(jià)值采用受試者工作特征（ROC）曲線分析，對(duì)預(yù)后的影響采用多因素Cox回歸分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般臨床資料比較兩組人群性別構(gòu)成、年齡無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），但高血壓病、糖尿病、LDL-C、總膽固醇等心血管危險(xiǎn)因素存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），表2。

表2 兩組患者一般臨床資料比較

2.2 兩組患者外周血單核細(xì)胞CoroMarker和血漿MCP-1的表達(dá)水平LncRNA CoroMarker在STEMI組患者外周血單核細(xì)胞CoroMarker相對(duì)表達(dá)量為0.21±0.25，與對(duì)照組的相對(duì)表達(dá)量相比明顯下降，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01，圖1A）。STEMI組患者的血漿MCP-1 濃度高于對(duì)照組[（173.06±9.76）pg/mL vs.（144.15±10.59）pg/mL，P=0.032，圖1B]。Pearson相關(guān)性分析提示STEMI組CoroMarker的Ct值與血漿MCP-1濃度成正相關(guān)（r=0.568，P＜0.01），即外周血PBMCs中CoroMarker的表達(dá)水平與血漿MCP-1濃度成負(fù)相關(guān)性（圖1C）。

圖1 兩組患者外周血單核細(xì)胞CoroMarker（A）和血漿MCP-1（B）的表達(dá)水平比較；MCP-1與CoroMarker相關(guān)性分布散點(diǎn)圖（C）

2.3 CoroMarker作為STEMI診斷標(biāo)志物的ROC分析ROC曲線分析顯示LncRNA CoroMarker的AUC為0.806（95%CI：0.705~0.920，P＜0.001）。診斷STEMI的敏感度和特異性分別為75.0%、76.7%，cut-off值為CT值12.02（圖2）。

圖2 CoroMarker診斷STEMI的ROC曲線

2.4 CoroMarker與STEMI患者預(yù)后的相關(guān)性追蹤患者住院期間及出院后1年主要不良心血管事件（MACE）發(fā)生情況，包括心源性死亡、心室顫動(dòng)、室性心動(dòng)過速、再發(fā)急性心肌梗死、反復(fù)心絞痛發(fā)作、心力衰竭、新發(fā)腦梗死。住院期間發(fā)生心源性死亡1例，心室顫動(dòng)1例，室性心動(dòng)過速1例，心力衰竭4例。出院后1年內(nèi)，再發(fā)心絞痛發(fā)作5例，再發(fā)急性心肌梗死1例，新發(fā)腦梗死1例，心力衰竭5例，室性心動(dòng)過速1例。多因素Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)CoroMarker是STEMI患者住院期間發(fā)生MACE事件的保護(hù)因子（HR=0.28，95%CI：0.08~0.96，P=0.042），但與STEMI患者出院1年內(nèi)發(fā)生MACE事件無明顯相關(guān)性（HR=0.78，95%CI：0.47~1.29，P=0.326），圖3。

3 討論

急性心肌梗死（AMI）是全球發(fā)病率和死亡率的主要原因之一，AMI實(shí)質(zhì)上是一種心肌壞死和炎癥反應(yīng)的過程，炎癥程度與缺血再灌注損傷、不良心臟重構(gòu)、心肌梗死面積和預(yù)后不良有關(guān)。研究認(rèn)為，促炎癥細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNFα）、白介素-6（IL-6）和白介素-1（IL-1）以及脂肪因子脂聯(lián)素等水平升高與高死亡率和發(fā)病率有關(guān)。相反，抗炎癥細(xì)胞因子，如白介素-10（IL-10）、omentin-1等可抑制AMI誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，與更好的預(yù)后相關(guān)[6]。促炎和抗炎細(xì)胞因子的失衡是改變AMI預(yù)后的重要因素，對(duì)于AMI炎癥因子和相關(guān)信號(hào)通路的研究一直是心血管領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA CoroMarker是STEMI的一個(gè)重要生物標(biāo)志物，可能通過調(diào)控相關(guān)炎性因子參與STEMI的發(fā)病過程。

許多LncRNA已被證實(shí)在AMI中起著重要的調(diào)控炎癥和心肌凋亡的作用[7]。如LncRNA MIAT、MALAT1、MDRL等在AMI中上調(diào)表達(dá)，而ANRIL、HOTAIR、MDRL等表達(dá)水平下降，可通過調(diào)控不同的信號(hào)通路或自噬等，參與心肌壞死、氧化應(yīng)激、炎癥、線粒體功能調(diào)節(jié)和鈣超載[3,8]。由于AMI患者的死亡率很高，早期發(fā)現(xiàn)和治療可顯著改善患者預(yù)后。LncRNA具有高度的組織特異性，也是存在于血漿、血清、尿液和其他體液樣本中的相對(duì)穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)。因此，LncRNA可作為診斷和預(yù)測(cè)多種疾病預(yù)后的新型生物標(biāo)志物[9]。有研究發(fā)現(xiàn)，STEMI患者外周血中6個(gè)LncRNAs顯著高于非ST段抬高型心肌梗死（NSTEMI）患者，可用于鑒別STEMI和NSTEMI[10]。Cai等[4]發(fā)現(xiàn)，LncRNA CoroMarker是冠心病的最佳候選生物標(biāo)志物，且獨(dú)立于已知的冠心病危險(xiǎn)因素和其他心血管疾病。功能富集分析表明，CoroMarker與炎癥呈負(fù)相關(guān)的基因聚集在一起。本研究發(fā)現(xiàn)CoroMarker在STEMI中表達(dá)較非疾病人群明顯下降，對(duì)診斷STEMI同樣具有良好的價(jià)值，且CoroMarker與血漿MCP-1濃度具有顯著負(fù)相關(guān)性。MCP-1是一種通過與CC趨化因子受體2（CCR2）結(jié)合來調(diào)節(jié)單核細(xì)胞趨化性和T淋巴細(xì)胞分化的趨化因子，在炎癥性疾病、動(dòng)脈粥樣硬化和癌癥的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用[11]。有學(xué)者對(duì)STEMI后的患者的單核細(xì)胞亞群進(jìn)行了定量分析，發(fā)現(xiàn)循環(huán)中的非經(jīng)典單核細(xì)胞與心肌壞死之間存在正相關(guān)[12]。我們猜測(cè)CoroMarker可能通過調(diào)節(jié)MCP-1及相關(guān)信號(hào)通路參與心肌炎癥過程，但具體信號(hào)通路仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

尋找良好的預(yù)后生物指標(biāo)也是心血管領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，個(gè)別LncRNA已被證實(shí)在AMI中具有一定的預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值，如ANRIL、KCNQ1OT1和心肌梗死相關(guān)轉(zhuǎn)錄本可預(yù)測(cè)AMI后4個(gè)月是否會(huì)發(fā)生左心室心臟功能受損[13]。我們研究發(fā)現(xiàn)，CoroMarker可預(yù)測(cè)STEMI患者院內(nèi)主要不良心血管事件的發(fā)生，是院內(nèi)MACE的保護(hù)因子，但對(duì)出院后長期MACE無預(yù)測(cè)價(jià)值。這可能是因?yàn)锳MI急性期的病理生理是影響短期預(yù)后的重要因素，而長期預(yù)后還受藥物治療、生活方式和其他心血管危險(xiǎn)因素的控制情況影響。一些研究者通過細(xì)胞或動(dòng)物模型的研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)或下調(diào)關(guān)鍵LncRNA的表達(dá)水平可能是治療AMI的一種治療策略。在大鼠AMI模型中，HOTAIR過表達(dá)可抑制炎癥和心肌細(xì)胞凋亡，并減少心肌梗死面積[14]。對(duì)于CoroMarker能否作為一種治療AMI的干預(yù)靶點(diǎn)，仍需深入研究。

本研究局限性在于：僅在STEMI患者血液循環(huán)PBMC中檢測(cè)CoroMarker的表達(dá)水平，未在動(dòng)物或細(xì)胞層面深入分析上下游信號(hào)通路，難以闡明CoroMarker的具體分子機(jī)制；樣本量較少，且為單中心研究，需更大的樣本量確保其作為生物標(biāo)志物的診斷潛力。總之，我們?cè)谌梭w中初步證實(shí)LncRNA CoroMarker可作為STEMI的診斷生物標(biāo)志物，具有預(yù)測(cè)STEMI患者住院期間發(fā)生主要不良心血管事件的作用，并且可能通過調(diào)控相關(guān)炎性因子參與STEMI的發(fā)病過程。后期有必要進(jìn)一步深入分析CoroMarker的具體生物機(jī)制，為心肌梗死的治療提供更多理論依據(jù)。