賈彩云 趙娜 宋浩靜 萬(wàn)青華 許玉芳 胡義亭 郭彩會(huì) 董占軍

1966 年由Magerlein等首次合成克林霉素,作用機(jī)制為作用于敏感菌核糖體50S亞基,抑制細(xì)菌細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成[1]。克林霉素是治療金黃色葡萄球菌骨髓炎的首選藥物,對(duì)需氧革蘭陽(yáng)性球菌有較高抗菌活性,如葡萄球菌屬(包括耐青霉素及甲氧西林敏感株)、草綠色鏈球菌等;對(duì)厭氧菌也有抗菌作用,如梭形桿菌屬、消化鏈球菌等[2]。鹽酸克林霉素胃腸道吸收迅速,分布廣泛[3,4]。多次給藥無(wú)藥物蓄積現(xiàn)象,血透及腹透不能清除克林霉素[5,6]。參考《以藥動(dòng)學(xué)參數(shù)為終點(diǎn)評(píng)價(jià)指標(biāo)的化學(xué)藥物仿制藥人體生物等效性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[7],本研究選用石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司研發(fā)的克林霉素膠囊為受試者制劑,美國(guó)法瑪西亞普強(qiáng)公司(Pharmacia &UpjohnCo) 生產(chǎn)的鹽酸克CLEOCIN HCL為參比制劑,進(jìn)行人體生物等效性臨床試驗(yàn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 試驗(yàn)方案經(jīng)河北省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。試驗(yàn)中的所有受試者均在充分了解試驗(yàn)的目的、方法及風(fēng)險(xiǎn)后,自愿簽署知情同意書(shū),年齡≥18歲,體重指數(shù) 18.0～26.0 kg/m2,進(jìn)行體格檢查和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)后合格的受試者隨機(jī)納入空腹試驗(yàn)24例,餐后試驗(yàn)24 例?？崭菇M年齡( 27.3±4.6) 歲,體重指數(shù)(22.56±1.89) kg/m2。餐后組年齡(25.7±4.1) 歲,體重指數(shù)(22.51±1.87) kg/m2。完成例數(shù):空腹試驗(yàn)完成23例,1例受試者無(wú)脫落;餐后試驗(yàn)完成24例,無(wú)脫落/剔除。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) (1)年齡>18周歲的女性和男性受試者; (2)女性體重≥45.0 kg,男性體重≥50.0 kg,體重指數(shù)(BMI)在19.0～26.0 kg/m2(包括臨界值);(3)體格檢查、生命體征檢查、12導(dǎo)聯(lián)心電圖、胸部X片、心臟彩超檢查、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)及酒精呼氣檢測(cè),結(jié)果正?；虍惓o(wú)臨床意義者;(4)沒(méi)有心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、精神神經(jīng)系統(tǒng)異常及代謝異常等病史。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) (1)對(duì)克林霉素或其他相關(guān)藥物(如林可霉素)有過(guò)敏史者;(2)有胃腸道疾病史或(和)存在吞咽困難者;(3)在篩選前3個(gè)月內(nèi)接受過(guò)手術(shù)治療,或者近期有手術(shù)計(jì)劃者,及既往接受過(guò)任何有可能會(huì)影響藥物代謝的手術(shù)者;(4)篩選前14 d內(nèi)發(fā)生腹瀉者;(5)有暈針暈血史者,不能耐受靜脈穿刺者;(6)篩選前6個(gè)月內(nèi)有藥物濫用史者;(7)篩選前3個(gè)月內(nèi)使用過(guò)毒品;(8)篩選前3個(gè)月內(nèi)入組了其他藥物臨床試驗(yàn)或參加過(guò)其他的藥物臨床試驗(yàn);(9)篩選前3個(gè)月內(nèi)有獻(xiàn)血史者或失血≥200 ml者;(10)篩選前30 d內(nèi)使用過(guò)任何抑制或誘導(dǎo)肝臟對(duì)藥物代謝的藥物者,給藥前14 d內(nèi)使用過(guò)任何處方藥、非處方藥、中草藥、和維生素者等。

1.4 藥品 克林霉素膠囊受試制劑[T,規(guī)格:0.15 g/片,石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司生產(chǎn),批號(hào):國(guó)藥準(zhǔn)字H13020795]; 克林霉素膠囊參比制劑[R,規(guī)格:0.15 g/片,Pharmacia and Upjohn Co生產(chǎn),批號(hào):SGYM]?？肆置顾鼗瘜W(xué)對(duì)照品(純度94.7%,批號(hào)137371),Dr.Ehrenstorfer公司生產(chǎn);鹽酸克林霉素-d3(內(nèi)標(biāo),純度96.0%,批號(hào):9-AKS-149-2),Toronto Research Chemicals Inc公司生產(chǎn)?？瞻谆|(zhì),抗凝劑為肝素鈉的空白人血漿和全血(考察全血穩(wěn)定性)來(lái)自中國(guó)健康志愿者捐獻(xiàn)。甲醇(HPLC級(jí))購(gòu)于美國(guó)Fisher Chemical公司,乙腈(HPLC級(jí))購(gòu)于美國(guó)Fisher Chemical公司,甲酸(MS級(jí))購(gòu)于美國(guó)Honeywell公司。

1.5 給藥方案與血樣采集

1.5.1 本研究為在健康成年受試者中進(jìn)行的單中心、單劑量、隨機(jī)、開(kāi)放、雙周期、自身交叉對(duì)照試驗(yàn)設(shè)計(jì),評(píng)價(jià)克林霉素膠囊在空腹及高脂餐后兩種狀態(tài)下的生物等效性研究[8]。每周期給藥1次,健康受試者隨機(jī)分為2組,每組人數(shù)相等,

1.5.2 空腹組和餐后組受試者各24人,隨機(jī)分為2組進(jìn)行,交叉給藥(12人/組),口服克林霉素膠囊受試制劑和參比制劑0.15 g,隔洗脫 7 d,每周期第1天服藥?？崭菇M受試者空腹過(guò)夜 >10 h,服用相應(yīng)受試制劑,240 ml 水送服,在服藥0 h(服藥前1 h內(nèi))和服藥后10 min,20 min,30 min,45 min,1.00 h,1 h 20 min,1 h 40 min,2.00 h,2 h 30 min,3.00 h,4.00 h,5.00 h,6.00 h,8.00 h,12.00 h,24.00 h共17個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集靜脈血,每次4 ml至EDTA-K2抗凝真空采血管中。餐后組受試者空腹過(guò)夜>10 h,于第2天早上在服藥前 30 min 開(kāi)始高脂(提供食物中約50%的熱量)高熱量(約800～1 000 kcal)餐[9](30 min 內(nèi)結(jié)束進(jìn)餐),在進(jìn)餐后且以開(kāi)始進(jìn)餐時(shí)間計(jì)的30 min時(shí)服用相應(yīng)受試制劑或參比制劑,240 ml水送服,在服藥0 h(餐后至服藥前)和服藥后0.25 h,0.50 h,0.75 h,1.00 h,1.50 h,2.00 h,2.50 h,3.00 h,3.50 h,4.00 h,4.50 h,5.00 h,6.00 h,8.00 h,10.00 h,12.00 h,24.00 h共18個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集靜脈血,每次4 ml至EDTA-K2抗凝真空采血管中。見(jiàn)表1。

1.5.3 空腹組和餐后組所采集的血樣在1 h內(nèi)4℃條件下離心(1 700 g,10 min),從采血至離心的時(shí)間全程置于冰浴中,所有離心后血漿樣品將被分成兩份,2 h內(nèi)存放于≤-60℃冰箱中,以供藥代動(dòng)力學(xué)分析。

1.6 測(cè)定方法與血樣處理

1.6.1 色譜條件:色譜柱:SHIMADZU,Shim-packGIST,C8,3 μm,2.1*50 mm;流動(dòng)相:0.1%甲酸水(A)-100% 乙腈(B),梯度洗[0～0.30 min,20.0%;0.30～2.00 min,20.0% B→40.0% B ;2.00～2.01 min,40% B～90.0% B;2.01～2.60 min,95% B;2.60～2.61 min,95%B～20.0% B;2.61～3.10 min,20%B],流速:流速:0.400 ml/min; 柱溫:40℃;分析時(shí)間為3.10 min; 進(jìn)樣量:2.0 μl。

1.6.2 質(zhì)譜條件:電噴霧離子源,正離子方式檢測(cè)(ESI+);監(jiān)測(cè)方式:MRM 模式;接口溫度:300℃;脫溶劑管溫度:250℃;加熱塊溫度:400℃;霧化器流量:3 L/min;加熱器流量:10 L/min;干燥器流量:10 L/min。克林霉素離子對(duì)為425.10/126.10,駐留時(shí)間為150.0 ms,預(yù)四級(jí)桿偏轉(zhuǎn)電壓偏差Q1 Pre為-13.0V,碰撞能量(CE)為-30.0 eV,預(yù)四級(jí)桿偏轉(zhuǎn)電壓偏差Q3 Pre為-24.0 V;克林霉素-d3離子對(duì) 428.10/129.10,駐留時(shí)間為150.0ms,Q1 Pre為-10.0 V,CE為-29.0eV,Q3 Pre 為-20.0 V。

1.6.3 血漿樣品處理:樣品室溫下融化后,渦旋混勻,取30.0 μl樣品(校正標(biāo)樣,質(zhì)控樣品或測(cè)試樣品;對(duì)于雙空白樣品或QC0樣品,加入30.0 μl空白基質(zhì))至96孔板中,對(duì)于雙空白樣品及不含內(nèi)標(biāo)的定量上限樣品加入30.0 μl 50% MeOH;其他樣品加入30.0 μl內(nèi)標(biāo)溶液,搖勻;加入300 μl的100%MeOH,然后搖勻,約10 min,在約4℃條件下2 600×g離心10 min;轉(zhuǎn)移100.0 μl上清液至新的96孔板中,加入400 μl H2O,然后搖勻,約5 min,待進(jìn)樣。

1.7 方法學(xué)考察 克林霉素在組織、體液或細(xì)胞中含量測(cè)定的方法報(bào)道較多。常用的有微生物法[10,11]、放射免疫分析法(RIA)、分光光度法[12]、氣相色譜法(GC)[13]、液相色譜法(HPLC)[14]、反相高效液相法(RP-HPLC)[15]或高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS)[16]等。本文采用的LC-MS/MS方法具有靈敏度高、選擇性高、分析速度快、使用范圍廣等特點(diǎn),液質(zhì)聯(lián)用法的方法學(xué)驗(yàn)證由蘇州國(guó)辰生物科技股份有限公司生物分析部完成。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用Phoenix WinNonlin軟件(Certara USA Inc,7.0)對(duì)血藥濃度進(jìn)行非房室模型藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的估算分析,計(jì)算主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù),使用SAS 9.2軟件進(jìn)行生物等效性評(píng)價(jià),將藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù) Cmax、AUC0-t、AUC0-∞ 經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后,進(jìn)行方差分析和90%置信區(qū)間分析,Tmax用非參數(shù)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾克林霉素的測(cè)定 克林霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線10.0～2 500 ng/ml,該范圍內(nèi),以克林霉素峰面積與克林霉素-d3峰面積之比與克林霉素和克林霉素-d3濃度比作線性回歸方程,權(quán)重因子采取1/C2,R>0.99,R2>0.985。血漿樣品中克林霉素的提取回收率為93.4%～94.7%,內(nèi)標(biāo)克林霉素-d3 的回收率為 92.8%。克林霉素在10～2 500 ng/ml濃度,稀釋因子為 1∶10 時(shí)具有良好的稀釋可靠性。血漿樣本在-20℃條件下儲(chǔ)存28 d的穩(wěn)定性良好,-60℃條件下儲(chǔ)存29 d穩(wěn)定性良好;血漿樣本在-60℃條件下經(jīng)歷5次冷凍-解凍循環(huán)的穩(wěn)定性良好;血漿樣本在處理前室溫白光條件下放置25 h以及提取后進(jìn)樣器(溫度設(shè)置:4℃)放置120 h穩(wěn)定性良好;全血樣本于冰浴白光下放置2 h的穩(wěn)定性良好; 基質(zhì)效應(yīng)(包括溶血基質(zhì)效應(yīng)與高脂基質(zhì)效應(yīng))、殘留均不影響血漿中克林霉素的準(zhǔn)確定量。方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明本方法可用于臨床試驗(yàn)血漿樣品的分析。見(jiàn)表2。

表2 血漿中克林霉素的精密度和準(zhǔn)確度

2.2 受試者入組及完成情況 空腹組24例健康受試者參加試驗(yàn),其中1例因不良事件退出,未參加第2周期,剩余23例受試者均按照方案要求完成試驗(yàn);餐后組24例健康受試者入組。

2.3 血藥濃度-時(shí)間曲線 空腹組和餐后組受試者口服受試制劑和參比制劑后,克林霉素的平均血藥濃度-時(shí)間曲線。見(jiàn)圖1。

圖1 受試者服用受試制劑(T) 和參比制劑(R)后克林霉素均血藥濃度-時(shí)間曲線

2.4 藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù) 健康空腹組和餐后組受試者口服克林霉素膠囊受試制劑和參比制劑的的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。見(jiàn)表3。

表3 空腹和餐后受試者口服受試制劑和參比制劑后的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

2.5 生物等效性分析 口服克林霉素受試藥物和參比藥物在空腹?fàn)顟B(tài)下的Cmax、AUC0-t及 AUC0-∞的幾何均值的比值分別為92.29%,95.32%和95.59%,90% CI分別為 84.12%～101.27%,90.14%～100.79%和90.49%～100.98%,個(gè)體內(nèi)變異分別為18.42%,11.03% 和10.83%。在餐后狀態(tài)下 Cmax、AUC0-t及AUC0-∞的幾何均值的比值分別為95.79%,100.92%和101.65%,90% CI 分 別 為87.75%～104.56%,93.48%～108.95%,個(gè)體內(nèi)變異分別為17.81%,15.54% 和15.67%。同參比制劑比較,受試制劑Cmax、AUC0-t及 AUC0-∞的 90% 置信區(qū)間均落在參比制劑的80.00%～125.00%,說(shuō)明兩種制劑具有生物等效性。

2.6 安全性評(píng)價(jià) 空腹服用受試制劑后,共4例(17.4%)受試者發(fā)生9例次不良事件,2例(8.7%)受試者發(fā)生6例次藥物不良反應(yīng)。服用參比制劑后,共3例(12.5%)受試者發(fā)生4例次不良事件,3例(12.5%)受試者發(fā)生4例次藥物不良反應(yīng)。服用受試制劑或參比制劑后均無(wú)嚴(yán)重、導(dǎo)致死亡和退出的不良事件和藥物不良反應(yīng)發(fā)生,餐后服用受試制劑后,共2例(8.3%)受試者發(fā)生4例次不良事件。服用參比制劑后,共3例(12.5%)受試者發(fā)生5例次不良事件。不良事件均為Ⅰ級(jí)(NCI CTCAE 5.0)。服用受試制劑或參比制劑后均無(wú)藥物不良反應(yīng)、嚴(yán)重、導(dǎo)致死亡和退出的不良事件和藥物不良反應(yīng)發(fā)生,兩制劑的安全性基本一致。

3 討論

克林霉素是臨床常用的抗生素,屬林可酰胺類抗生素。與林可霉素抗菌譜相同,其抗菌活性更強(qiáng)。與林可霉素比較,克林霉素的抗菌活性增強(qiáng)4～8 倍,常用于敏感革蘭陽(yáng)性球菌和厭氧菌引起的感染,是β-內(nèi)酰胺類過(guò)敏患者的首選藥物。國(guó)內(nèi)目前測(cè)定克林霉素的血藥濃度的方法:微生物法,靈敏度低,專屬性差,較難真正反映藥物在人體內(nèi)血藥濃度變化情況;液質(zhì)聯(lián)用的方法,靈敏度高,成本較高,難以普及。目前多采用液質(zhì)聯(lián)用測(cè)定血漿藥物濃度。

本試驗(yàn)采用乙晴沉淀,鹽酸克林霉素-d3做內(nèi)標(biāo),LCMS/MS法測(cè)定血漿中克林霉素濃度并進(jìn)行生物利用度及生物等效性研究。本試驗(yàn)中,空腹口服受克林霉素膠囊試制劑和參比制劑Tmax中位數(shù)為0.5 h(0.33～1.33 h)、0.75 h(0.33～1.33 h);餐后口服克林霉霉素膠囊受試制劑和參比制劑后Tmax中位數(shù)為3.5 h(1.00～4.51 h)、2.50 h(0.50～4.00 h)。消除半衰期為3～4 h,表明克林霉素口服吸收快速完全,組織穿透性良好。與文獻(xiàn)報(bào)道一致。本試驗(yàn)中的受試制劑 Cmax、AUC0-t及 AUC0-∞ 的90% 置信區(qū)間均落在參比制劑80.00%-125.00% 內(nèi),表明本試驗(yàn)達(dá)到生物等效。受試制劑鹽酸克林霉素膠囊與參比制劑CLEOCIN HCL在中國(guó)健康成年受試者中,在空腹和餐后狀態(tài)下單次口服給藥,安全性較好。空腹?fàn)顟B(tài)下服用受試制劑后,共4例(17.4%)受試者發(fā)生9例次不良事件,2例(8.7%)受試者發(fā)生6例次藥物不良反應(yīng)。服用參比制劑后,共3例(12.5%)受試者發(fā)生4例次不良事件,3例(12.5%)受試者發(fā)生4例次藥物不良反應(yīng)。服用受試制劑或參比制劑后均無(wú)嚴(yán)重、導(dǎo)致死亡和退出的不良事件和藥物不良反應(yīng)發(fā)生,兩制劑的安全性基本一致。餐后狀態(tài)下服用受試制劑后,共2例(8.3%)受試者發(fā)生4例次不良事件。服用參比制劑后,共3例(12.5%)受試者發(fā)生5例次不良事件。不良事件均為Ⅰ級(jí)(NCI CTCAE 5.0)。服用受試制劑或參比制劑后均無(wú)藥物不良反應(yīng)、嚴(yán)重、導(dǎo)致死亡和退出的不良事件和藥物不良反應(yīng)發(fā)生,兩制劑的安全性基本一致。

兩制劑在空腹和餐后給藥后藥時(shí)曲線相似,所發(fā)生的不良事件及發(fā)生率均相似。經(jīng)生物等效性評(píng)價(jià),兩制劑生物等效。