袁利明,陳云蕾,劉素平,丁林玲,吳蘭,賽務(wù)加甫*

(1 石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,新疆 石河子 832000;2 西北農(nóng)林科技大學(xué),陜西 楊凌 712100;3 桐廬無規(guī)定馬屬動(dòng)物疫病區(qū)管理中心,浙江 杭州 310000)

磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C(PLC)是與大多數(shù)細(xì)胞受體激活相關(guān)的常見信號(hào)成分[1]。PLC-γ1作為PLC的一個(gè)亞型,可將磷脂酰肌醇 4,5-二磷酸 (PIP2) 轉(zhuǎn)化為肌醇1,4,5-三磷酸 (IP3) 和甘油二酯 (DAG),由于DAG和IP3各自控制不同的細(xì)胞過程,也是合成其他重要信號(hào)分子的底物[2];在細(xì)胞增殖與分化[3]、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)[4]、受精過程中的精卵識(shí)別[5]、淋巴細(xì)胞的活化腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移[6]和機(jī)體生長發(fā)育等生命過程中發(fā)揮重要作用[7]。PLC-γ1在PLC中是獨(dú)特的,是由受體酪氨酸激酶(RTK)磷酸化直接激活并在PLC-γ1的 Tyr 783位點(diǎn)上磷酸化,這種磷酸化是刺激磷脂酶活性的典型條件[8]。Hajicek等人[9]構(gòu)建的磷酸化誘導(dǎo)PLC-γ1活化的模型顯示,PLC-γ1的nSH2結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)自抑制酶向活化的受體酪氨酸激酶,以成纖維細(xì)胞生長因子受體1(FGFR1)的激活為例,如圖1所示的募集引起PLC-γ1空間構(gòu)型的改變,從而發(fā)脂肪酶的磷酸化依賴性激活。Ma等[10]通過敲除斑馬魚胚胎中的morpholino(MO)基因發(fā)現(xiàn)胚胎發(fā)育過程中PLC-γ1在細(xì)胞生成中具有重要調(diào)控作用。盡管初步研究表明PLC-γ1在早期胚胎發(fā)育具有重要作用,但涉及的分子機(jī)制鮮有報(bào)道。

2A肽(豬圓環(huán)病毒)是一類自剪切序列,稱為“順式作用元件水解酶”,含有18到22個(gè)氨基酸,在翻譯到它的時(shí)候會(huì)斷開,能夠有效介導(dǎo)核糖體跳躍,通過自我切割實(shí)現(xiàn)上下游兩個(gè)蛋白單獨(dú)翻譯[11-12];可以把同一條mRNA表達(dá)出的蛋白前后分開產(chǎn)生兩個(gè)蛋白,用于構(gòu)建多順反子載體,實(shí)現(xiàn)同一個(gè)啟動(dòng)子控制下的兩蛋白共翻譯,形成非融合性蛋白[13-14]。同時(shí),非融合性蛋白在結(jié)構(gòu)和功能方面會(huì)基本一致,保持原有的免疫原性[15]。在構(gòu)建載體同時(shí),pDsRed2-C1載體上的DsRed2紅色熒光蛋白為之后的轉(zhuǎn)染提供了很好的依據(jù),這為研究該基因的功能提供了更好的工具載體。

因此,本研究擬通過攜帶紅色熒光蛋白(RFP)報(bào)告功能和2A肽的切割作用構(gòu)建出活性更好的綿羊PLC-γ1非融合性真核表達(dá)載體,從而在不影響蛋白空間功能及活性基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)PLC-γ1蛋白表達(dá),為后續(xù)研究綿羊PLC-γ1基因在綿羊早期胚胎發(fā)育分子機(jī)制研究上提供基礎(chǔ)和便捷。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 載體與細(xì)胞

PUC57-PLC-γ1載體(本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建載體)、帶有紅色熒光蛋白的pDsRed2-C1載體、HEK-293T細(xì)胞,作者已構(gòu)建好的PUC57-PLC-γ1載體,DH5α感受態(tài)細(xì)胞以上皆由動(dòng)物疾病防控兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存提供。

1.1.2 主要試劑和設(shè)備

質(zhì)粒小提取試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒、膠回收試劑盒、Marker II、增強(qiáng)型HRP-DAB底物顯色試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司;增強(qiáng)型ECL 化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(即用型)購置諾唯贊生物科技股份有限公司;Blue Plus? IV Protein Marker (10-180 kDa)購置于北京全式金生物科技有限公司;SDS-PAGE上樣緩沖液、2×Taq MasterMix(Dye)購置于康為世紀(jì)生物科技有限公司;DL10000 DNA Marker、總提RNA試劑盒、反轉(zhuǎn)錄(Perfect Real Time)試劑盒、HindⅢ酶和SalⅠ酶均購置寶日醫(yī)生物科技(北京)有限公司。細(xì)胞裂解液、PMSF、PBS、胰酶、DAPI、HRP標(biāo)記二抗(羊抗兔)、FITC標(biāo)記二抗(羊抗鼠)均購置北京索萊寶科技有限公司;QuantStudio 5實(shí)時(shí)熒光定量儀、Lip 2000、PageRuler? Prestained Protein Ladder(10-180 kDa)購置于賽默飛世爾科技公司;PLC-γ1一抗(羊抗兔)、β-actin一抗(羊抗兔)、Flag一抗(羊抗鼠)、SYBR染料、Flag磁珠、磁力架均購置于美國Bimake生物科技有限公司;犢牛血清、DMEM購置于BI公司。

1.2 方法

1.2.1 重組PLC-γ1序列的設(shè)計(jì)及合成

基于獲取的綿羊PLC-γ1基因序列,在N端前加入P2A序列及3個(gè)連續(xù)Flag序列,兩端分別加入HindⅢ和SalⅠ 酶切位點(diǎn)粘性末端。根據(jù)pDsRed2-C1載體圖譜,在HindⅢ 酶切位點(diǎn)添加cg兩個(gè)堿基,以保護(hù)蛋白正常翻譯(表1)。將設(shè)計(jì)好的序列及含PUC57-PLC-γ1載體的菌液送至上海生工股份有限公司合成,并連接在PLC-γ1基因兩端并純化至PUC-57載體上。

表1 合成序列

1.2.2 重組pDsRed2-C1-P2A-3×Flag-PLC-γ1表達(dá)載體的構(gòu)建

PUC57-P2A-3×Flag-PLC-γ1載體和pDsRed2-C1載體用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和SalⅠ雙酶切,酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,按照膠回收試劑盒說明書進(jìn)行膠回收并純化。純化后用T4連接酶將P2A-3×Flag-PLC-γ1片段與酶切后的pDsRed2-C1空載質(zhì)粒連接,并轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞,涂布在卡那抗性的固體LB平板。16 h后挑單克隆菌株、搖菌并菌液PCR反應(yīng)鑒定,以待檢單克隆菌落為模版,以PUC57-P2A-3×Flag-PLC-γ1為引物。PCR擴(kuò)增體系25 μL:待檢單克隆菌落2 μL,2×Taq MasterMix(Dye)12.5 μL,上、下游引物各0.5 μL,ddH2O 9.7 μL。PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性40 s,56 ℃退火30 s;72 ℃延伸 60 s,共30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min,引物如(表2)。將菌液PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,將具有特異性條帶的單克隆菌落保菌送至上海生工股份有限公司測序。

1.2.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞

將測序正確的pDsRed2-C1-PLC-γ1重組表達(dá)質(zhì)粒和pDsRed2-C1空載質(zhì)粒進(jìn)行菌液活化培養(yǎng),并用天根去內(nèi)毒素大提質(zhì)粒試劑盒進(jìn)行大提質(zhì)粒。用脂質(zhì)體Lip 2000將重組質(zhì)粒和空載質(zhì)粒各4 μg、ddH2O 4 μL轉(zhuǎn)染到HEK-293T細(xì)胞中,24 h后在體視熒光顯微鏡下觀測轉(zhuǎn)染情況并記錄。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量檢測HEK-293T細(xì)胞中PLC-γ1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量

待轉(zhuǎn)染24 h后用PBS洗滌,并加入500 μL Buffer RL吹打細(xì)胞轉(zhuǎn)移至2 mL無酶離心管內(nèi),按照TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit 說明書提取實(shí)驗(yàn)組pDsRed2-C1-PLC-γ1、pDsRed2-C1、ddH2O對(duì)照組細(xì)胞的總RNA。按照TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,并去除基因組DNA。

根據(jù)綿羊β-actin 基因(登錄號(hào):443052)和綿羊P2A-3×Flag-PLC-γ1基因序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量qPCR引物(表3)。實(shí)時(shí)熒光定量qPCR反應(yīng)體系為20 μL,反應(yīng)體系:2×SYBR Green qPCR Master Mix 10 μL,cDNA 1 μL,PLC-γ1/β-actin-qPCR-F(10 μmol·L-1)0.8 μL,PLC-γ1/β-actin-qPCR-R(10 μmol·L-1)0.8 μL,50×ROX Reference Dye(low Donc)0.4 μL,ddH2O 7 μL;利用Quant StudioTMDesign &Analysis Software軟件設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量qPCR反應(yīng)程序試驗(yàn)采用相對(duì)定量反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃預(yù)變性10 min,95 ℃變性15 s,60 ℃ 1 min 45個(gè)循環(huán),最后95 ℃變性15 s,60 ℃ 1 min,95 ℃變性15 s以獲得溶解曲線。每組樣品均重復(fù)3次試驗(yàn)。

表3 實(shí)時(shí)熒光定量qPCR引物

1.2.5 Western blot鑒定3×Flag-PLC-γ1蛋白表達(dá)

將轉(zhuǎn)染48 h后的3組細(xì)胞用PBS洗滌3遍,250 μL RIPA(含1 mmol·L-1PMSF)洗脫至1.5 mL離心管中,4 ℃冷卻30 min,14 000 g離心5 min;按照索萊寶BCA蛋白濃度測定試劑盒將3組蛋白濃度稀釋統(tǒng)一濃度。取16 μL樣品加入4 μL 5×Loading buffer蛋白上樣,混勻后于金屬浴100 ℃煮沸5 min,進(jìn)行SDS-PAGE聚丙烯胺凝膠電泳。將樣品轉(zhuǎn)至PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉2 h,PBST漂洗濾膜3次,每次10 min,以兔抗PLC-γ1單抗為一抗(1∶1 000倍稀釋)4 ℃過夜孵育,然后 PBST 漂洗濾膜 3 次,每次10 min,以辣根過氧化物酶標(biāo)記好的羊抗兔HRP-IgG為二抗(1∶10 000倍稀釋)室溫孵育2 h,再用 PBST 漂洗濾膜 3 次,每次10 min,按照說明書配制ECL發(fā)光液,點(diǎn)滴在PVDF膜上孵育2 min后在化學(xué)發(fā)光成像儀曝光拍照記錄,按照HRP-DAB底物顯色試劑盒說明書對(duì)PVDF膜染色,觀察特異性條帶并拍照記錄。

1.2.6 Co-Immunoprecipitation純化鑒定3×Flag-PLC-γ1蛋白

用移液槍輕柔吹打重懸Anti-Flag免疫磁珠,吸取20 μL磁珠懸液加入到1.5 mL的離心管中;加入500 μL TBS,輕柔吹打重懸的磁珠,于磁力架上靜置10 s后去除上清液,重復(fù)上述步驟2次;在上述沉淀中加入200 μL pDsRed2-C1-PLC-γ1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HEK-293T細(xì)胞蛋白,并輕柔吹打重懸磁珠,室溫孵育2 h;磁力架上靜置10 s后移除上清液,向沉淀中加入500 μL PBST并輕柔吹打重旋磁珠,然后上下翻轉(zhuǎn)樣品5 min。磁性分離后移除上清并回收檢測非特異性蛋白,重復(fù)上述步驟兩次;所得沉淀中加入50 μL 1×Loading buffer蛋白上樣緩沖液并煮沸5 min,冷卻至室溫并在磁力架上靜置10 s,取上清進(jìn)行SDS-PAGE檢測。

1.2.7 PLC-γ1蛋白的細(xì)胞亞定位

HEK-293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染前,將細(xì)胞爬片置于六孔板中,轉(zhuǎn)染按照1.2.4試驗(yàn)方法操作。轉(zhuǎn)染48 h后用1×PBS震蕩洗滌3遍,每次5 min(后面每一步前都按照如此操作)。固定:4%多聚甲醛,室溫浸泡20 min;透膜:0.1 %放入Trition-100透化10 min(可在鏡下觀察到細(xì)胞膜打孔的現(xiàn)象);封閉:加入5 % BSA,室溫下封閉1 h;孵育鼠抗Flag-tag一抗(1∶300 倍稀釋):不需要清洗直接加入一抗50 μL,4 ℃孵育過夜;孵育偶聯(lián)熒光素FITC二抗(1∶500倍稀釋):加入二抗500 μL,37 ℃孵育40 min(避光);染核:DAPI染色10 min(避光);封片:50%甘油取5 μL涂布在載玻片上,小心氣泡(避光),用彎曲的鑷子取出細(xì)胞爬片,將有細(xì)胞的一面朝覆蓋到載玻片上,在激光共聚焦顯微鏡下觀察分析并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)分析

1.3.1 實(shí)時(shí)熒光定量數(shù)據(jù)處理分析

Quant Studio 5實(shí)時(shí)熒光定量儀反應(yīng)后,將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Quant StudioTMDesign &Analysis Software軟件中,進(jìn)行溶解曲線分析檢測產(chǎn)物特異性,確定其獲得產(chǎn)物為目的產(chǎn)物。對(duì)PLC-γ1和β-actin基因的溶解曲線具有單峰特異性產(chǎn)物進(jìn)行PLC-γ1基因的定量分析,并將數(shù)據(jù)導(dǎo)出Excel中,采用2-ΔΔCT法計(jì)算,其中ΔCT=目的基因CT-內(nèi)參基因CT,ΔΔCT=實(shí)驗(yàn)組ΔCT-對(duì)照組ΔCT。得到數(shù)據(jù)用SPSS 21進(jìn)行單因素方差分析中LSD檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較分析,P<0.05為差異性顯著,數(shù)據(jù)分析后用Origin作圖。

1.3.2 Images J 分析PLC-γ1蛋白相對(duì)表達(dá)分析

將ECL曝光圖像導(dǎo)入Images J 軟件,對(duì)PLC-γ1條帶和β-actin條帶進(jìn)行灰度值計(jì)算,重復(fù)3次并計(jì)算均值,PLC-γ1條帶灰度值與其相應(yīng)內(nèi)參β-actin比值為相對(duì)灰度值,可表示為該基因相對(duì)表達(dá)。將對(duì)照組ddH2O組相對(duì)灰度值設(shè)置為1,其他組按照相應(yīng)比值進(jìn)行調(diào)整并用SPSS 21軟件分析差異性,Origin軟件繪制柱狀圖。

2 結(jié)果

2.1 重組pDsRed2-C1-P2A-3×Flag-PLC-γ1表達(dá)載體的構(gòu)建

將原有為大小3 886 bp的PLC-γ1基因N端合成添加P2A-3×Flag序列,由上海生工股份有限公司重組構(gòu)建為大小4 022 bp的P2A-3×Flag-PLC-γ1序列,將含該基因的PUC57菌液活化,經(jīng)質(zhì)粒提取,HindⅢ和SalⅠ雙酶切后電泳鑒定結(jié)果如圖2,符合預(yù)期大小。膠回收后連接到pDsRed2-C1真核表達(dá),轉(zhuǎn)化后挑單克隆菌株,經(jīng)2%瓊脂糖電泳菌液PCR鑒定結(jié)果如圖3顯示,將陽性菌送至上海生工測序,測序結(jié)果成功構(gòu)建了pDsRed2-C1-P2A-3×Flag-PLC-γ1(pDsRed2-C1-PLC-γ1)重組真核表達(dá)載體,載體圖譜如圖4顯示。

M:DL10000 DNA Marker;N,PUC-P2A-3×Flag-PLC-γ1質(zhì)粒;1:PUC-P2A-3×Flag-PLC-γ1質(zhì)粒雙酶切。圖2 PUC-P2A-3×Flag-PLC-γ1質(zhì)粒雙酶切鑒定

M:Marker II;1、2、4,陽性;3、5,陰性。圖3 菌液PCR鑒定

圖4 重組質(zhì)粒pDsRed2-C1-P2A-3×Flag-PLC-γ1示意圖

2.2 重組質(zhì)粒pDsRed2-C1-PLC-γ1轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞

復(fù)蘇HEK-293T細(xì)胞后,在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長期內(nèi)將實(shí)驗(yàn)組重組質(zhì)粒pDsRed2-C1-PLC-γ1、空載質(zhì)粒pDsRed2-C1、對(duì)照組ddH2O,通過脂質(zhì)體Lip 2000轉(zhuǎn)染到HEK-293T細(xì)胞內(nèi)。轉(zhuǎn)染24 h后在熒光倒置顯微鏡下經(jīng)綠色熒光激發(fā),結(jié)果如圖5顯示,轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒和空載質(zhì)粒組均可觀察到紅色熒光表達(dá),對(duì)照組無紅色熒光表達(dá),說明重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染到HEK-293T細(xì)胞內(nèi)并表達(dá)。

圖5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞 200×

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量檢測PLC-γ1的mRNA相對(duì)表達(dá)量

待轉(zhuǎn)染24 h后,收集HEK-293T細(xì)胞提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA為模板,β-actin為內(nèi)參。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測細(xì)胞中PLC-γ1的表達(dá)量,結(jié)果顯示重組質(zhì)粒Pdsred2-C1-PLC-γ1組表達(dá)量極顯著高于其他兩組(P<0.01),其中空轉(zhuǎn)載體與空白對(duì)照組表達(dá)量無明顯差異,如圖6所示。

圖6 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞的mRNA水平表達(dá)量(**P<0.01)

2.4 Co-Immunoprecipitation鑒定純化3×Flag-PLC-γ1蛋白

對(duì)轉(zhuǎn)染48 h重組pDsRed2-C1-PLC-γ1質(zhì)粒的HEK-293T細(xì)胞裂解,用Flag標(biāo)簽標(biāo)記的免疫磁珠進(jìn)行免疫共沉淀反應(yīng),來純化3×Flag-PLC-γ1蛋白。經(jīng)SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳,結(jié)果如圖7顯示,蛋白在158 kDa處呈現(xiàn)特異性單一蛋白,IP上清回收液和HEK-293T細(xì)胞蛋白均有蛋白雜帶,表示構(gòu)建含F(xiàn)lag標(biāo)簽的PLC-γ1質(zhì)粒成功構(gòu)建并表達(dá)。

M. 蛋白 Marker;1:純化的3×Flag-PLC-γ1蛋白;2:IP上清回收液;3:HEK-293T細(xì)胞蛋白。圖7 IP鑒定攜帶Flag標(biāo)簽的PLC-γ1蛋白

2.5 Western blot鑒定PLC-γ1蛋白表達(dá)

轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞48 h后,對(duì)轉(zhuǎn)染重組pDsRed2-C1-PLC-γ1質(zhì)粒、空載pDsRed2-C1質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞和對(duì)照組轉(zhuǎn)染ddH2O的細(xì)胞裂解,經(jīng)ECL化學(xué)發(fā)光成像儀曝光,結(jié)果如圖8顯示,轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pDsRed2-C1-PLC-γ1的條帶尤為明顯,用Image J軟件成像分析計(jì)算三組蛋白相對(duì)表達(dá)量,SPSS 21檢驗(yàn)差異性,結(jié)果圖9顯示,轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的PLC-γ1蛋白表達(dá)量與其他兩組有極顯著區(qū)別。

圖9 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞的蛋白水平表達(dá)量(**P<0.01)

2.6 PLC-γ1蛋白的細(xì)胞亞定位

轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞48 h后,對(duì)轉(zhuǎn)染pDsRed2-C1-PLC-γ1重組質(zhì)粒的試驗(yàn)組、pDsRed2-C1質(zhì)粒的對(duì)照組細(xì)胞用PBS清洗并用5 %BSA封閉。經(jīng)抗Flag一抗孵育和熒光素標(biāo)記的二抗孵育并DIPA染核后,在激光共聚焦顯微鏡下,結(jié)果如圖10顯示,轉(zhuǎn)染pDsRed2-C1質(zhì)粒的對(duì)照組可觀察到紅色熒光DsRed2蛋白表達(dá),蛋白主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中,但在紅色熒光同一細(xì)胞下無法觀察到FITC標(biāo)記的綠色熒光PLC-γ1蛋白。轉(zhuǎn)染pDsRed2-C1-PLC-γ1重組質(zhì)粒的試驗(yàn)組均可觀察到FITC標(biāo)記的綠色熒光和紅色熒光DsRed2的蛋白表達(dá),可間接證明PLC-γ1成功表達(dá),并表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中。

圖10 激光共聚焦顯微鏡檢測PLC-γ1蛋白在HEK-293T細(xì)胞的亞定位

3 討論

受體酪氨酸激酶(RTK)是由一個(gè)大的細(xì)胞外配體結(jié)合區(qū)、一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)細(xì)胞內(nèi)催化激酶結(jié)構(gòu)域組成,RTK可與表皮生長因子(EGF)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等生長因子識(shí)別并結(jié)合,其中像配體PLC-γ1的結(jié)合通常誘導(dǎo)RTK上的單體二聚,觸發(fā)C末端酪氨酸殘基的反式自磷酸化,使這些殘基可以作為PLC-γ1等酶的補(bǔ)充位點(diǎn)[16]。由于RTK的內(nèi)在激酶活性,使這些與之相適配的蛋白磷酸化,從而增加單個(gè)受體激活后的信號(hào)通路并使其多樣化[17]。在功能方面上,RTK介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制主要通過細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶ERK 1/2、粘著斑激酶(FAK)、蛋白激酶A(PKA)和蛋白激酶B(Akt)介導(dǎo),從而促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和存活[18-19]。這些研究說明PLC-γ1在RTK介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制中扮演重要的角色。盡管在Ma ACH研究中已證實(shí)PLC-γ1在早期胚胎發(fā)育具有重要作用,但只是在小鼠等模式動(dòng)物基因敲除的研究,并且涉及的分子機(jī)制仍不清楚。

因此,本研究在原有PUC57-PLC-γ1載體基礎(chǔ)上,構(gòu)建具有DsRed2紅色蛋白作為示蹤標(biāo)記的pDsRed2-C1載體作為過表達(dá)真核載體,進(jìn)一步探索上調(diào)水平下PLC-γ1在早期胚胎發(fā)育具體作用機(jī)制。pDsRed2-C1載體不僅對(duì)宿主細(xì)胞不具有毒性,且不會(huì)影響目的蛋白的表達(dá),可以直接在熒光顯微鏡下觀察到融合蛋白表達(dá)和定位情況,故在融合蛋白真核表達(dá)研究中具有不可替代的作用。然而,pDsRed2-C1載體的DsRed2紅色蛋白大小為55.48 kDa,而MCS位點(diǎn)位于DsRed2紅色蛋白之后,使之與目的蛋白形成融合蛋白來表達(dá)。在常用的2A肽中的P2A與T2A可以使紅色熒光蛋白(RFP)表達(dá)提高1.47倍,并且P2A 可以有效地驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)基因在細(xì)胞中的表達(dá)[11]。綜上所述,為了不影響其目的蛋白PLC-γ1的空間結(jié)構(gòu)及功能,在構(gòu)建真核表達(dá)載體時(shí),我們選用具有高效切割作用的P2A肽來連接DsRed2紅色蛋白和PLC-γ1目的蛋白。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)在目的基因上銜接一段Flag標(biāo)簽的真核表達(dá)載體可使用免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)技術(shù)更方便的探究上下游信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)及聯(lián)系[20-21]。為了更好地研究PLC-γ1在RTK信號(hào)通路的作用機(jī)制,便在PLC-γ1目的基因N端添加了3×Flag標(biāo)簽成功構(gòu)建了pDsRed2-C1-P2A-3×Flag-PLC-γ1質(zhì)粒。結(jié)果顯示重組質(zhì)粒在HEK-293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染后成功表達(dá)PLC-γ1蛋白,且與DsRed2紅色蛋白分割成功。通過mRNA和蛋白水平鑒定發(fā)現(xiàn)處于對(duì)數(shù)生長期的HEK-293T細(xì)胞也能表達(dá)PLC-γ1蛋白,與重組質(zhì)粒差異極顯著(P<0.01),其中PLC-γ1在mRNA水平上表達(dá)與對(duì)照組比較差異極顯著(P<0.01),這可能與基因的轉(zhuǎn)錄及翻譯調(diào)節(jié)有關(guān),具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。在免疫共沉淀上,我們運(yùn)用Flag標(biāo)簽的免疫磁珠成功分離出含3×Flag標(biāo)簽的PLC-γ1蛋白,蛋白大小為158 kDa,表示該3×Flag標(biāo)簽成功構(gòu)建到目的蛋白上,且在傳統(tǒng)的提純真核細(xì)胞的蛋白質(zhì)上,Bimake公司的免疫磁珠在提取蛋白上更具操作簡單、省時(shí)、特異性高等優(yōu)勢。在亞細(xì)胞定位中我們運(yùn)用免疫熒光技術(shù),通過使用抗Flag標(biāo)簽的特異性一抗及FITC熒光素標(biāo)記的二抗來定位PLC-γ1蛋白,結(jié)果顯示DsRed2紅色蛋和PLC-γ1蛋白均分布在細(xì)胞質(zhì)中,同時(shí),也進(jìn)一步驗(yàn)證了3×Flag標(biāo)簽的表達(dá)。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了pDsRed2-C1-P2A-3×Flag-PLC-γ1真核表達(dá)載體,證實(shí)其在P2A肽作用下,目的蛋白PLC-γ1與DsRed2紅色熒光蛋白成功分割,且不影響PLC-γ1蛋白的功能和空間結(jié)構(gòu)。為后續(xù)研究綿羊PLC-γ1基因通過RTK信號(hào)通路調(diào)控綿羊早期胚胎發(fā)育分子機(jī)制研究上提供基礎(chǔ)和便捷。