陳琳，陳緣，何亮亮，李萬華*，汪浪紅,*，曾新安

（1.西北大學食品科學與工程學院，陜西西安 710069）（2.佛山科技學院廣東省食品智能制造重點實驗室，廣東佛山 528225）（3.華南理工大學食品科學與工程學院，廣東廣州 510640）

酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌（Alicyclobacillus acidoterrestris，A.acidoterrestris）是一類非致病性、產(chǎn)芽孢的嗜酸耐熱菌，大量研究表明這類細菌是引起蘋果汁、橙汁等酸性果汁腐敗的主要原因之一[1-3]。被脂環(huán)酸芽孢桿菌污染的果汁在初期并不出現(xiàn)明顯酸敗或漲包現(xiàn)象，很難直接觀察到，但其代謝產(chǎn)物如愈創(chuàng)木酚、2,6-二溴苯酚以及2,6-二氯苯酚會使果汁出現(xiàn)口感和風味變劣、濁度升高等質量問題[4]，進而給生產(chǎn)企業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。巴氏滅菌處理（70～90 ℃）是果汁加工中最常見的殺菌手段，但是很難將其完全殺滅[5,6]。鑒于其危害性，脂環(huán)酸芽孢桿菌被認為是果汁加工中需控制的關鍵微生物之一[7]。因此，如何有效殺滅果汁中的脂環(huán)酸芽孢桿菌對于我國果汁行業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

非熱等離子體技術是由電離或部分電離的氣體所產(chǎn)生的原子、電子、帶電粒子、自由基、紫外線光子形成的集合體[8]。等離子體能夠在低溫短時間殺滅食品中的各種微生物，近幾年被廣泛運用于果汁、快餐食品、肉類制品等各類食品滅菌[9-11]。研究表明，細菌在遭受不良的環(huán)境狀況如低溫、酸或堿以及食品加工或儲存中的高鹽脅迫后會引入應激反應并通過相應的代謝過程對其產(chǎn)生耐受性[12]。根據(jù)同源耐受性原理，產(chǎn)生適應的細菌會對同一脅迫條件產(chǎn)生更高的耐受性[13]。另外，遭受脅迫的細菌可能還會誘發(fā)交叉耐受性反應，進而產(chǎn)生對不同的條件如酸、熱環(huán)境產(chǎn)生高耐受性[14,15]。果汁是一種高酸環(huán)境體系（pH值為3.2～5.0），不同的酸性環(huán)境對脂環(huán)酸芽孢桿菌造成酸脅迫，并引起應激反應。然而，pH值介導下的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌對等離子體的耐受性的高低并未見相關報道。

因此，本文從酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌在不同pH值下的生長速率、形態(tài)變化，并基于氣相-質譜聯(lián)用法分析酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌細胞膜脂肪酸成分的差異，探究pH值介導下酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌與等離子耐受性之間的關系，本文對于全面了解脂環(huán)酸芽孢桿菌在不同pH值下的生長特性及對等離子體耐受性機理具有重要的理論意義。

1 材料與方法

1.1 原料

酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌（Alicyclobacillus acidoterrestrisATCC 49025）采購廣東微生物研究所微生物培養(yǎng)物保藏中心提供。細菌脂肪酸甲酯標準溶液，美國Sigma公司。

1.2 主要儀器設備

CTP-2000K等離子體設備（裝配DBD-50反應器），南京蘇曼有限公司；UV-1800島津紫外可見分光光度計，日本島津公司；8890B-7000D氣相-質譜聯(lián)用儀，安捷倫科技有限公司；掃描電鏡儀，日本日立有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種活化與培養(yǎng)

將安瓿管中的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌轉移至AAM培養(yǎng)基中，于搖床中在45 ℃條件下隔夜培養(yǎng)。用接種環(huán)沾取酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌培養(yǎng)物于固體培養(yǎng)基中進行劃線，放置培養(yǎng)箱中于45 ℃溫度下培養(yǎng)24.0 h進行菌種活化。將含酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌培養(yǎng)物接種至新鮮AAM培養(yǎng)基中（pH值3.2、3.6、4.0和4.4），45 ℃下進行培養(yǎng)，并測定其生長曲線。

1.3.2 細胞膜脂肪酸提取與分析

不同pH值下將酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌培養(yǎng)至穩(wěn)定初期，離心收集菌體。根據(jù)Wang等[16]報道的方法進行膜脂肪酸提取與甲基化，具體方法如下：（1）取菌體40～50 mg加入1.0 mL皂化液（4.5 g NaOH，15.0 mL甲醇，15.0 mL蒸餾水），浸泡在沸水浴中充分混合30 min；（2）冷卻至室溫后，加入2.0 mL甲基化溶液（32.5 mL 6.0 mol/L HCl和27.5 mL甲醇），80 ℃水浴10 min后冷卻至適溫；（3）加入1.25 mL的萃取液（正己烷/甲基叔丁基醚，V/V=1:1）充分混合，去除水相；（4）加入3.0 mL 0.3 mol/L NaOH，將一定量的有機相移到氣相小瓶，并作氣質聯(lián)用分析。

1.3.3 DBD-等離子體處理

介質阻擋放電等離子體（DBD-ACP）設備原理圖如圖1所示，產(chǎn)生等離子體的氣源為空氣。將酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌培養(yǎng)至穩(wěn)定初期，離心重懸于等體積的無菌生理鹽水和蘋果汁之中。取4.0 mL菌液于20 kV和30 kV電壓下處理0、0.5、1.0和2.0 min，其中高壓電極板和樣品表面距離為5 mm，頻率為1.0 kHz。處理后的菌液進行梯度稀釋并涂布，于45 ℃下培養(yǎng)36.0～48.0 h以檢測菌落總數(shù)（CFU/mL），根據(jù)處理前后菌落數(shù)變化分析致死率。每次處理重復三次，實驗結果取平均值。

圖1 介質阻擋放電（DBD）等離子體處理實驗裝置原理圖Fig.1 Schematic of a dielectric barrier discharge (DBD) plasma treatment experimental device

1.3.4 掃描電鏡觀察

掃描電鏡制樣參考之前的方法進行[17]：將不同pH值（3.2、3.6、4.0和4.4）培養(yǎng)的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌進行菌體收集（離心，4 000g，5.0 min），并用含2.5%（V/V）戊二醛的PBS緩沖液在4 ℃條件下保存過夜。離心后分別使用φ=30%～100%乙醇溶液對細菌樣品進行梯度脫水。脫水后的菌體用叔丁醇處理兩次，然后將樣品滴在錫箔紙上進行真空冷凍干燥，噴金后即可觀察酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌形態(tài)變化。

1.3.5 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)均以Origin Pro 8作圖，采用SPSS Statistics 22作數(shù)據(jù)分析分析，結果用平均值±標準差來表示，每組試驗平行3次。

2 結果與討論

2.1 酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長動力學分析

通過測量OD600nm值繪制生長曲線，研究不同pH值對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生長的影響。如圖2所示，不同pH值培養(yǎng)基培養(yǎng)下，酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生長速率存在一定的差異。其中，pH值4.0條件下酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生長速率最快，培養(yǎng)6 h后即進入生長對數(shù)期，20 h后進入生長穩(wěn)定期。pH值3.6和4.4條件下培養(yǎng)的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生長有輕微的延遲，分別在10 h后和22 h后進入生長對數(shù)期和生長穩(wěn)定期。相比之下，酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌在pH值3.2下生長被顯著抑制，培養(yǎng)16 h后才進入對數(shù)生長期，36 h后才進入穩(wěn)定期。另外，從圖中可以看出，到達穩(wěn)定期后，不同pH值培養(yǎng)下的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長總量（OD600nm）存在差異，依次為pH值4.0＞4.4≈3.6＞3.2。不同pH值下生長的菌體總量和生長延遲的現(xiàn)象與Zhao等[18]報道的結果一致，表明不同的pH值培養(yǎng)下對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長總量（OD600）有一定的影響。

圖2 不同pH值下酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長曲線Fig.2 Growth curves of Alicyclobacillus acidoterrestris under various pH

2.2 不同pH值下酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的形態(tài)變化

采用掃描電鏡對菌體形態(tài)進行觀察，進一步研究不同pH值生長環(huán)境對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生長的影響，結果如圖3a～d所示。從圖3c和d看到，pH值4.0和4.4生長下的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌菌體呈現(xiàn)短桿狀，為正常形態(tài)特征，與之前的文獻結果一致[19]；然而酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌在pH值3.2與3.6生長條件下出現(xiàn)異常伸長，呈現(xiàn)絲狀形態(tài)，且pH值3.2培養(yǎng)的菌體更為明顯。Zhao等[18]也發(fā)現(xiàn)低pH值（2.8和3.4）培養(yǎng)下酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌表現(xiàn)出類似的菌體形態(tài)延長的現(xiàn)象。Wehrens等[20]在大腸桿菌上發(fā)現(xiàn)42 ℃的培養(yǎng)溫度對大腸桿菌進行脅迫，發(fā)現(xiàn)細菌能比正常狀態(tài)下伸長10～20倍，最長能達到40 μm，但是寬度幾乎不變，最終表現(xiàn)為長絲狀。這種菌體的絲化現(xiàn)象被認為是細菌在應對外部環(huán)境應激時的自我保護機制之一[20]。

圖3 不同pH值下酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌菌體形態(tài)變化Fig.3 Morphological changes of Alicyclobacillus acidoterrestris under different growth pH

2.3 DBD-等離子體對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的殺滅作用分析

不同pH值條件下培養(yǎng)的菌體經(jīng)離心、洗滌并重新分散于無菌生理鹽水溶液和非濃縮蘋果汁中，采用DBD-等離子體進行處理。處理后的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌梯度稀釋并進行平板培養(yǎng)，進而分析DBD-等離子體對不同pH值生長的菌體的致死作用，結果如圖4所示。從圖中可以看出，在生理鹽水（圖4a和b）和蘋果汁（圖4c和d）中，DBD-等離子體對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的滅活量均隨著處理電壓和時間的增加而增大，且對不同pH值生長下的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌殺滅效率表現(xiàn)出一定差異。例如當處理電壓為20 kV，時間為1.0 min條件下，DBD-等離子體處理對pH值為3.2條件培養(yǎng)的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌殺滅效率為3.0個對數(shù)（圖4a）。相比之下，DBD-等離子體對pH值為3.6條件下培養(yǎng)的菌體滅活數(shù)顯著降低，僅為3.6個對數(shù)（P＜0.05），且pH值為4.0條件生長的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的死亡數(shù)量最低，約為1.1個對數(shù)（P＜0.05）。當處理時間為2.0 min時，不同pH值培養(yǎng)下的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌滅活量都有一定的提高，但不同溫度之間酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的滅活量仍有差異。其中DBD-等離子體處理引起pH值3.2條件培養(yǎng)的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌滅活量為4.7個對數(shù)，導致pH值為3.6和4.0培養(yǎng)的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的失活量則分別為4.2和2.7個對數(shù)（P＜0.05）。當處理電壓為30 kV，處理時間為2.0 min時（圖4b），pH值3.2、3.6和4.0條件下培養(yǎng)的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌滅活量分別達5.9、5.4和4.8個對數(shù)。以蘋果汁為處理體系也展現(xiàn)出類似的現(xiàn)象（圖4c和d）。

pH值為3.2～4.0范圍內，酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌對等離子體的耐受性的高低可能與菌體形態(tài)直接相關。研究表明，DBD-等離子體處理時能夠產(chǎn)生自由基如活性氮類和活性氧類物質[8,21]，對細菌表面產(chǎn)生強烈的刻蝕作用導致細胞膜的破裂，進而引起菌體死亡。因此菌體表面積越大，所遭受的自由基損傷越嚴重[22]。相比于最適pH值4.0，pH值3.2和3.6條件下培養(yǎng)的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌呈長桿狀，表面積顯著增加，由等離子引起的致死率顯著增加。pH值3.2條件下培養(yǎng)的菌體長桿狀數(shù)量更多、且長度相對更大，因而死亡率最高。

值得注意的是，DBD-等離子體對pH值為4.4條件下培養(yǎng)的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌形態(tài)正常，相比于pH值4.0生長的菌體表現(xiàn)出致死率更高的現(xiàn)象。該結果可能與菌體膜脂質存在一定關系。大量研究表明，環(huán)境的改變可介導細菌細胞膜脂肪酸組成進而影響其對熱與非熱滅菌技術如脈沖電場、等離子體和超高壓等的耐受性[23,24]。例如，Wang等[12]研究發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌對脈沖電場的耐受性與細胞膜支鏈/直鏈脂肪酸含量有一定的聯(lián)系，柚皮素介導的金黃色葡萄球菌為了增加細胞膜流動性，合成了更多的支鏈脂肪酸，進而更易被脈沖電場擊穿。Pan等[24]研究了不同溫度下李斯特菌對等離子體的耐受性，結果表明溫度越低李斯特菌對等離子體的耐受性越強，認為主要與低溫下李斯特菌細胞膜中的支鏈脂肪酸（Anteiso-C15:0）相對含量增加有關，這類脂肪酸與親水性活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）相互作用，降低ROS滲入細胞內部的效率，提高了李斯特菌對等離子體對DBD-等離子體的耐受性。

2.4 不同pH值下的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌膜脂肪酸分析

為了驗證酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌細胞膜脂肪酸成分與其對等離子體耐受性之間的關系，不同pH值下培養(yǎng)至穩(wěn)定期初期的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌細胞膜脂肪酸成分經(jīng)提取，甲酯化和氣質聯(lián)用分析，結果如表1所示。所檢測出的脂肪酸種類主要為7種，分別為肉豆蔻酸（C14:0）、棕櫚酸（C16:0）、硬脂酸（C18:0）、棕櫚油酸、油酸、環(huán)己烷十一酸（ω-Cyclohexyl C17:0）和環(huán)戊烷十三酸（ω-Cyclopentane C18:0）。這些膜脂肪酸可以分為三類，即直鏈脂肪酸、不飽和脂肪酸和環(huán)狀脂肪酸。從表中可以看出，在不同pH值條件下酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌細胞膜中以上三類脂肪酸的總量沒有太大變化（P＞0.05），但單一脂肪酸成分存在顯著差異（P＜0.05）。其中環(huán)己烷-11-十一酸在培養(yǎng)pH值為3.2時相對含量最低，占35.49%。隨著培養(yǎng)pH值的增加（3.2～4.4），環(huán)己烷-11-十一酸含量逐步增加，分別占48.37%、59.21%和67.86%（P＜0.05）。相比之下，環(huán)戊烷-13-十三酸的含量則出現(xiàn)下降的趨勢，隨著pH值的升高從53.83%降低至40.94%、31.61%和22.21%。研究表明，細菌處于不同環(huán)境下，為了維持一個合適的細胞膜流動性，會改變細胞膜中不同脂肪酸的含量[25,26]。其中直鏈脂肪酸可在細胞膜中排列整齊，堆疊性好而緊密。因此直鏈脂肪酸在細胞膜中所占比例越高，細胞膜的流動性越低[16]。相比之下，支鏈脂肪酸堆疊性差所占空間更大，因此更有利于增加細胞膜的流動性[24]。ω-環(huán)狀脂肪酸是一類較為特殊的支鏈脂肪酸，主要出現(xiàn)在嗜酸耐熱菌細胞膜中，且含量可達到60%～90%。本研究中，酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌為嗜酸耐熱菌，環(huán)己烷-11-十一酸和環(huán)戊烷-13-十三酸占比超過80%。研究表明，堆疊疏松的ω-脂環(huán)脂肪酸可通過形成動態(tài)屏障，限制脂質擴散和H+的跨膜擴散，從而保護嗜酸耐熱菌的免受H+的毒害作用[27]。最近的研究表明，ω-環(huán)狀脂肪酸在細胞膜中的堆積松散，引起脂質尾部的有序度降低進而導致細胞膜流動性增加，并且ω-脂環(huán)脂肪酸中的環(huán)尺寸越大，其作用越明顯[28]。本研究中隨著培養(yǎng)pH值的上升（3.2～4.4），酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌細胞膜中環(huán)己烷-11-十一酸的相對含量逐步增加，從48.37%增加至67.86%（P＜0.05），而環(huán)戊烷-13-十三酸的含量從53.83%減少至22.21%。該結果表明，pH值的升高，酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌細胞膜流動性逐步增加。由此可推斷，在低pH值條件下，酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌通過調整環(huán)己烷-11-十一酸與環(huán)戊烷-13-十三酸的相對比例降低細胞膜流動性，進而適應低pH值環(huán)境達到生長的目的。

表1 不同pH值培養(yǎng)下的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的膜脂肪酸種類Table 1 Membrane fatty acid composition of Alicyclobacillus acidoterrestris under different growth pH

與低酸（H+）作用機制不同，等離子體處理過程中會產(chǎn)生各類活性氧、活性氮成分如臭氧、羥基自由基、單線態(tài)氧自由基等會損害脂肪酸的功能，誘導脂質尤其是不飽和脂肪酸的過氧化，甚至破壞細胞膜導致細胞裂解而引起細菌死亡[29,30]。另外，等離子處理產(chǎn)生的自由基還能跨過細胞膜進入細胞質攻擊核酸等生物大分子[31]。由此可以推斷，環(huán)己烷-11-十一酸可能更有利于氧自由基等成分在細胞膜中的堆積，不僅引起細胞膜的破壞，還增加了氧自由基等成分的進入而引起細胞死亡。因此，相比于pH值4.0，pH值4.4條件下生長的菌體細胞膜中環(huán)己烷-11-十一酸含量的增加，是其對等離子體耐受性降低的潛在原因。

3 結論

本研究探討了不同pH值生長條件對DBD-空氣低溫等離子體滅活酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的影響，結果表明不同pH值條件下生長的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌對DBD-空氣低溫等離子體的耐受性存在差異。其中pH值3.2條件下生長的菌體耐受性最低，pH值升高（3.2～4.0），菌體耐受性逐步增強，然而pH值4.4條件下生長的菌體對等離子體耐受性并未進一步增強，反而表現(xiàn)出降低的趨勢。這種耐受性的差異主要與菌體形態(tài)和菌體膜脂質有關。掃描電鏡結果表明，pH值3.2和3.6條件下生長的菌體呈現(xiàn)長桿狀，使其表面積增大，因而菌體更易被自由基損傷而導致死亡。氣相-質譜聯(lián)用結果顯示不同培養(yǎng)溫度下酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌細胞膜成分有一定的差異，且pH值的升高使細胞膜中環(huán)己烷-11-十一酸含量逐步升高，而環(huán)戊烷-13-十三酸則逐步降低。這種變化使pH值4.4培養(yǎng)下的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌耐受性降低更易被DBD-空氣低溫等離子體導致氧化損傷而死亡。