張曉婉，張嘉慧，李威龍，馬芹，卜賢盼，王建國(guó),

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西楊凌 712100）（2.安康市富硒產(chǎn)品研發(fā)中心，陜西安康 725000）

食品中腐敗菌的生長(zhǎng)嚴(yán)重威脅食品的質(zhì)量與安全，消費(fèi)者需要更新鮮和加工適度的產(chǎn)品，符合上述要求的果汁在人類(lèi)飲食中占有重要地位。脂環(huán)酸芽孢桿菌是導(dǎo)致果汁腐敗變質(zhì)的主要菌種，其已成為果汁行業(yè)的重要目標(biāo)和關(guān)注點(diǎn)。

脂環(huán)酸芽孢桿菌（Alicyclobacillus acidoterrestris）是一種好氧或兼性厭氧的革蘭氏陽(yáng)性菌[1]，與大多數(shù)芽孢桿菌的耐受pH值相比，脂環(huán)酸芽孢桿菌可低至2.5，因此又被稱(chēng)為嗜酸耐熱菌。脂環(huán)酸芽孢桿菌是非致病性細(xì)菌，但在果汁中會(huì)產(chǎn)生有煙熏味的愈創(chuàng)木酚和消毒水味的鹵酚[2]等次級(jí)代謝產(chǎn)物而使果汁渾濁，出現(xiàn)不愉快氣味，進(jìn)而嚴(yán)重影響果汁的品質(zhì)[3]。脂環(huán)酸芽孢桿菌具有嗜酸、耐熱、強(qiáng)抗逆性等生理生化特征，傳統(tǒng)的巴氏滅菌對(duì)其抑制效果并不理想[4,5]，而其他物理或化學(xué)滅菌方法對(duì)其作用也有限。因此，開(kāi)發(fā)安全、高效、環(huán)保的抗菌材料尤為重要。

根據(jù)報(bào)道，目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)出一系列含有溶菌酶的抗菌材料用于傷口敷料和食品包裝，但是，溶菌酶和基質(zhì)之間松散的連接可能會(huì)導(dǎo)致溶菌酶遷移造成二次污染，或者可能需要使用昂貴的交聯(lián)劑，因此在溶菌酶和底物之間引入穩(wěn)定的共價(jià)鍵可能是避免上述問(wèn)題的更好選擇。本研究采用聚多巴胺涂覆纖維素磁球的方法將溶菌酶負(fù)載到磁球上，聚多巴胺起到連接磁球和溶菌酶的橋梁作用。聚多巴胺具有良好的生物相容性和豐富的官能團(tuán)，可在幾乎任何基質(zhì)表面形成涂層用于功能化改性。Cheng等[6]在聚多巴胺修飾的二氧化硅納米粒子表面引入靶向聚合物聚乙二醇-葉酸作為治療宮頸癌的模型藥物；Ren等[7]使用聚多巴胺包覆的磁性納米粒子固定脂肪酶用于催化不同的反應(yīng)；Sureshkumar等[8]通過(guò)多巴胺自聚合涂覆在甲殼素顆粒上用于固定淀粉水解酶，這些實(shí)驗(yàn)均已證明當(dāng)聚多巴胺沉積在固體表面上時(shí)，它可與含有胺或硫醇的功能性配體通過(guò)邁克爾加成反應(yīng)或席夫堿反應(yīng)相結(jié)合。截止目前未見(jiàn)報(bào)導(dǎo)使用該方法負(fù)載溶菌酶針對(duì)A.acidoterrestris（DSM3922）進(jìn)行抑制的相關(guān)記錄。

由于綠色標(biāo)簽的普及以及消費(fèi)者和監(jiān)管機(jī)構(gòu)對(duì)健康和食品安全的擔(dān)憂(yōu)，對(duì)天然抗菌劑的需求有所增加。溶菌酶（Lysozyme，Lyz）是常用的Generally Recognized as Safe（GRAS）級(jí)的天然抗菌蛋白[9,10]，其性質(zhì)穩(wěn)定，尤其是在酸性條件下這一特征更為明顯。其抗菌機(jī)理主要是破壞細(xì)菌細(xì)胞壁，使N-乙酰氨基葡萄糖與N-乙酰胞壁酸之間的β-1,4糖苷鍵斷裂致使內(nèi)容物流出，故溶菌酶又稱(chēng)胞壁質(zhì)酶[11]。溶菌酶作為保鮮劑，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域的防腐保鮮，對(duì)人體無(wú)毒副作用，且具有一定的保健功效，已被國(guó)際食品法典委員會(huì)和我國(guó)衛(wèi)生部門(mén)允許應(yīng)用于食品加工領(lǐng)域[12]。

雖然溶菌酶直接投放到食品中可以發(fā)揮抑制A.acidoterrestris的作用，但已使用的溶菌酶無(wú)法回收利用，造成二次污染的同時(shí)增加了食品工業(yè)的生產(chǎn)成本和資源的耗費(fèi)。為解決這一問(wèn)題，向抗菌劑載體中加入磁性納米粒子可構(gòu)建具有磁響應(yīng)性的抗菌材料，從而快速磁分離達(dá)到回收利用的目的。磁赤鐵礦（γ-Fe2O3）納米顆粒具有優(yōu)異的生物相容性、熱穩(wěn)定性、化學(xué)穩(wěn)定性以及超順磁行為，近年來(lái)在生物醫(yī)學(xué)和水處理等領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)了廣泛的應(yīng)用[13,14]，本研究選擇將其加入抗菌材料。

本研究以纖維素為原材料，通過(guò)溶凝膠轉(zhuǎn)變法制得纖維素磁球。多巴胺鹽酸鹽在堿性條件下氧化自聚合涂覆在纖維素磁球上形成聚多巴胺涂層，溶菌酶通過(guò)官能團(tuán)間相互作用接枝到聚多巴胺涂層上，用以去除果汁中的脂環(huán)酸芽孢桿菌。通過(guò)SEM、FT-IR、XPS、EDX、VSM、TGA、XRD對(duì)復(fù)合球進(jìn)行表征，通過(guò)比濁法測(cè)定復(fù)合球?qū).acidoterrestris的抑制性。纖維素磁球負(fù)載溶菌酶可為食品安全提供低成本和綠色途徑，在保持抗菌活性的同時(shí)防止對(duì)環(huán)境的二次污染。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

棉短絨纖維素，購(gòu)自湖北化纖集團(tuán)有限公司；一水合氫氧化鋰、尿素、氯化鈉、Tris，均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；γ-Fe2O3，購(gòu)自阿拉丁化學(xué)試劑有限公司；溶菌酶、多巴胺鹽酸鹽購(gòu)自麥克林化學(xué)試劑有限公司；鹽酸購(gòu)自四川西隴科學(xué)有限公司；脂環(huán)酸芽孢桿菌（A.acidoterrestris）DSM 3922購(gòu)自德國(guó)微生物菌種保藏中心。

1.2 儀器與設(shè)備

Vetex 70傅里葉變換紅外光譜儀，德國(guó)布魯克公司；TGA/DSC 3+熱重分析儀，瑞士梅特勒-托利多公司；D/max 2200PC X射線(xiàn)衍射儀，日本理學(xué)株式會(huì)社；MIRA LMS掃描電子顯微鏡，捷克TESCAN公司；UV2700紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津公司；VSM7404振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)，美國(guó)Lake Shore公司；ESCALAB 250Xi X射線(xiàn)光電子能譜儀，美國(guó)ThermoFischer公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 纖維素磁球的制備

將4 g純纖維素（PC）用玻璃棒分散到由8 wt%LiOH·H2O/15 wt% Urea/77 wt% H2O配制成的綠色溶劑（100 mL）中?；旌先芤涸?20 ℃下冰凍，取出后在室溫下解凍，得到濃度為4 wt%的透明纖維素溶液。在機(jī)械攪拌下，向溶液中加入0.5 gγ-Fe2O3納米粒子，繼續(xù)攪拌1 h，以保證納米顆粒的均勻分散，隨后，用注射器將溶液滴入10 wt%氯化鈉溶液中成球并過(guò)夜固化，用蒸餾水多次洗滌并透析除去綠色溶劑，排除綠色溶劑對(duì)磁球抑菌性能的影響，利用此方法得到的磁性纖維素球命名為RC[15]，將制備方法相同但未加入γ-Fe2O3納米粒子的純纖維素球稱(chēng)為CB。

1.3.2 聚多巴胺涂覆的纖維素磁球的的制備

多巴胺鹽酸鹽溶液（2 mg/mL）的配制：將1 g多巴胺鹽酸鹽溶于500 mL Tris-HCl緩沖液中（pH值8.5，10 mmol/L）攪拌均勻。

將300個(gè)纖維素磁球分成三批每批100個(gè)分別分散到100 mL多巴胺鹽酸鹽溶液中，室溫下分別混合攪拌4、8、16 h，隨后磁分離取出磁球，并用去離子水徹底沖洗，以除去殘留的溶劑和未聚合的多巴胺[16]，排除雜質(zhì)對(duì)磁球抑菌性能的影響。

1.3.3 溶菌酶的固定化

將不同聚多巴胺涂覆時(shí)間處理過(guò)的纖維素磁球分別溶于50 mL溶菌酶溶液中（5 mg/mL），室溫下攪拌24 h，用蒸餾水清洗數(shù)次，常溫干燥至恒重。將經(jīng)過(guò)4、8、16 h多巴胺鹽酸鹽溶液處理后制備而成的溶菌酶固定的纖維素磁球分別命名為L(zhǎng)C-1、LC-2和LC-3。

1.3.4 官能團(tuán)分析

用于確定樣品的化學(xué)結(jié)構(gòu)。將干燥的樣品和溴化鉀（1:100）充分研磨壓片。在4 000~400 cm-1的范圍內(nèi)以4 cm-1的分辨率掃描16次得到樣品的紅外光譜圖。

1.3.5 形貌表征

使用掃描電子顯微鏡觀(guān)察樣品的表面形貌。取樣品粘到導(dǎo)電膠上，使用濺射鍍膜儀10 mA下噴金45 s，隨后使用掃描電子顯微鏡拍攝樣品形貌，加速電壓為3 kV。能譜mapping拍攝時(shí)加速電壓為15 kV，探測(cè)器為SE2二次電子探測(cè)器。

1.3.6 磁化強(qiáng)度分析

使用振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)研究γ-Fe2O3納米粒子和樣品在室溫下-1.5~1.5 T磁場(chǎng)強(qiáng)度范圍內(nèi)的磁性。

1.3.7 晶型結(jié)構(gòu)分析

樣品的晶體結(jié)構(gòu)是在2θ=5~80°的區(qū)間范圍內(nèi)通過(guò)X射線(xiàn)衍射儀在λ=0.154 06 nm、40 kV、40 mA的Cu Kα輻射下進(jìn)行測(cè)定。

1.3.8 元素及鍵能分析

采用X射線(xiàn)光電子能譜儀測(cè)定樣品表面元素組成，其中測(cè)試通能全譜為50 eV，窄譜為20 eV，步長(zhǎng)為0.05 eV，停留時(shí)間為40~50 ms。

1.3.9 熱穩(wěn)定性分析

通過(guò)熱重分析儀分析樣品熱穩(wěn)定性。加熱范圍25~600 ℃，加熱速率為10 ℃/min，氮?dú)夥毡Ｗo(hù)。

1.3.10 抗菌活性測(cè)試

AAM培養(yǎng)基的配制：稱(chēng)取葡萄糖2.0 g、酵母浸粉2.0 g、(NH4)2SO40.4 g、MgSO4·7H2O 1.0 g、無(wú)水CaCl20.38 g、KH2PO41.2 g溶解于1 L蒸餾水中，H2SO4調(diào)pH值4.2，121 ℃高壓滅菌15 min備用。

取脂環(huán)酸芽孢桿菌DSM 3922菌種凍存管，室溫融化后接種于AAM培養(yǎng)基中，45 ℃搖床培養(yǎng)12 h待用。采用生長(zhǎng)曲線(xiàn)法測(cè)定樣品的抗菌活性。將新鮮AAM培養(yǎng)基配制成含菌量約為每毫升含1×104CFU的菌懸液。50 mL純凈培養(yǎng)基為空白組（BlACK），加入50 mg RC的菌懸液為對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組為分別含有0.75、1.25、2.5、5、10、20 mg/mL溶菌酶的菌懸液，測(cè)試溶菌酶在該實(shí)驗(yàn)條件下的最小抑菌濃度。

稱(chēng)取RC、LC-1、LC-2和LC-3樣品各50 mg，分別加入50 mL菌懸液，50 mL培養(yǎng)基為空白組（Black），加入RC的菌懸液為對(duì)照組，全部培養(yǎng)瓶置于45 ℃搖床培養(yǎng)12 h，每隔2 h測(cè)定各組在600 nm處的吸光度值（OD600）。

1.3.11 數(shù)據(jù)分析

使用Origin 9.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用Image J 1.8.0軟件進(jìn)行粒徑統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與討論

2.1 溶菌酶涂覆的纖維素磁球的制備與表征

2.1.1 LCs的制備

LCs的制備流程如圖1所示。纖維素通過(guò)凍融法溶解于LiOH·H2O/Urea體系，γ-Fe2O3磁性納米粒子與纖維素溶解體系充分混合后在NaCl凝固浴中再生成球。多巴胺鹽酸鹽氧化自聚合在纖維素磁球表面形成聚多巴胺涂層，溶菌酶于涂層表面實(shí)現(xiàn)接枝固定。

圖1 纖維素磁球負(fù)載溶菌酶的制備流程圖Fig.1 Flow chart of preparation of lysozyme-coated cellulose magnetic beads

2.1.2 形貌分析

圖2是純纖維素球CB，纖維素磁球RC，涂覆接枝磁球LC-3的干燥前后形貌圖對(duì)比和LC-3的粒徑分布圖對(duì)比。單純的纖維素球呈乳白色透明狀，加入γ-Fe2O3后，顏色由乳白色變?yōu)榉奂t色，經(jīng)過(guò)聚多巴胺涂覆和溶菌酶的接枝后，復(fù)合球顏色轉(zhuǎn)變?yōu)楹谏Ｍㄟ^(guò)ImageJ軟件測(cè)得LC-3干燥前后平均直徑分別為3.20和1.45 mm。干燥后球的直徑急劇減小，這可能是由于球中水含量降低，使得纖維素氫鍵網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加致密。

圖2 干燥前后CB(a,e)、RC(b,f)、LC-3(c,g)的形貌圖和LC-3(d,h)的粒徑分布圖Fig.2 Topography of CB (a, e), RC (b, f), LC-3 (c, g) and particle size distribution of LC-3 (d, h) before and after drying

圖3是RC、LC-1和LC-3的掃描電鏡圖像。纖維素在溶解與再生的過(guò)程中，由于水誘導(dǎo)的相分離，RC中富含溶劑的區(qū)域形成了孔隙和粗糙表面，這與Luo等[17]研究一致。由于多巴胺氧化自聚合形成松散的薄層，涂覆在纖維素磁球的表面和溶菌酶的少量接枝，使得LC-1表面較為平滑，這與Xi等[16]的研究相類(lèi)似。隨著涂覆時(shí)間的增加，LC-3上聚多巴胺粒子不斷堆積，涂層變厚，高放大倍數(shù)下，在其表面觀(guān)察到無(wú)數(shù)小的微粒，由Ji等[18]可知這是由于聚多巴胺涂層提供了足夠多的活性位點(diǎn)因而接枝了大量的溶菌酶粒子。

圖3 RC（a-e)、LC-1（f-j）和LC-3（k-o)的掃描電鏡圖Fig.3 SEM images of RC (a-e), LC-1 (f-j) and LC-3 (k-o)

2.1.3 官能團(tuán)分析

RC和LCs的FT-IR譜圖如圖4所示。所有纖維素球在3 400 cm-1處的寬吸收峰歸因于羥基的伸縮振動(dòng)。對(duì)于LCs，1 000 cm-1附近處出現(xiàn)的吸收峰是由苯環(huán)引起的，這與Sureshkumar等[8]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。由Zhang等[19]可知1 650 cm-1的吸收峰是由于芳香環(huán)中的C=C共振以及N-H彎曲振動(dòng)疊加引起。2 800~3 200 cm-1的吸收峰變寬，強(qiáng)度變?nèi)跏怯捎诜恿u基拉伸引起的，Li等[20]和Song等[21]在研究中也發(fā)現(xiàn)這些官能團(tuán)歸因于兒茶酚胺和醌，證明聚多巴胺成功涂覆在纖維素球表面。在1 477 cm-1處發(fā)現(xiàn)的吸收峰歸因于溶菌酶中甲基C-H的彎曲振動(dòng)，Sebti等[22]也報(bào)道了類(lèi)似的研究結(jié)果，表明溶菌酶成功錨定在纖維素磁球上。

圖4 RC、LC-1、LC-2和LC-3的FT-IR光譜圖Fig.4 FT-IR spectra of RC, LC-1, LC-2 and LC-3

2.1.4 熱穩(wěn)定性分析

如RC、LCs的熱重分析譜圖5a和微分差熱重分析譜圖5b圖所示。在熱重分析譜圖中，RC和LCs有相同的減重趨勢(shì)，100~200 ℃的質(zhì)量損失歸因于水分的蒸發(fā)，這與Tan等[23]的研究結(jié)果一致。隨著溫度持續(xù)升高，在300~370 ℃范圍內(nèi)質(zhì)量損失明顯，這是由于纖維素分子鏈降解，Nie等[24]也報(bào)道了相同的結(jié)果。在第三階段370 ℃之后纖維素燃燒和碳化，使質(zhì)量又出現(xiàn)一定程度的下降，這與Zhang等[25]的研究結(jié)果類(lèi)似。LCs在60%質(zhì)量損失時(shí)所對(duì)應(yīng)溫度分別為358、365和393 ℃，這表明隨著聚多巴胺涂覆時(shí)間增強(qiáng)，LCs的質(zhì)量損失出現(xiàn)不同程度的減少，且涂覆時(shí)間越長(zhǎng)，質(zhì)量損失越少，600 ℃時(shí)，RC和LCs具有不同的質(zhì)量損失率是因?yàn)槔w維素磁球表面經(jīng)過(guò)聚多巴胺涂覆和溶菌酶接枝后在一定程度上保護(hù)了一部分纖維素免受碳化，降低了質(zhì)量損失，進(jìn)而提升了纖維素磁球的熱穩(wěn)定性。LC-1聚多巴胺涂覆時(shí)間短，因此在熱重分析譜圖和微分差熱重分析譜圖中其譜圖幾乎與RC譜圖重合。在微分差熱重分析譜圖中，RC的起始降解溫度（T0）為300 ℃，最大降解速率溫度（Tm）為346 ℃，對(duì)應(yīng)的最大降解速率絕對(duì)值為1.84。在349和343 ℃，LC-2和LC-3有最大降解速率，絕對(duì)值分別為1.44和1.16，小于RC。以上結(jié)果表明，聚多巴胺的涂覆和溶菌酶的固定沒(méi)有破壞纖維素磁球的穩(wěn)定性，反而在某種程度上提升了其穩(wěn)定性，這將有助于復(fù)合球在食品工業(yè)領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用。

圖5 RC、LCs的TGA譜圖（a）和DTG（b）譜圖Fig.5 TGA (a) and DTG (b) of RC and LCs

2.1.5 磁化強(qiáng)度分析

RC和LCs的磁滯回線(xiàn)如圖6所示。各組樣品的磁化強(qiáng)度隨外加場(chǎng)強(qiáng)的增加而增大，RC、LC-1和LC-3的飽和磁化強(qiáng)度值Ms分別為5.68、5.54和5.38 emu/g，由Tan等[23]的研究可知，γ-Fe2O3的磁化強(qiáng)度為219.73 emu/g，與之相比，RC和LCs磁化強(qiáng)度有明顯的下降，這表明γ-Fe2O3被纖維素成功包覆，這與Samaneh等[26]的研究結(jié)果相一致。此外，由圖6d可知，與RC相比，LCs的飽和磁化強(qiáng)度值Ms隨著聚多巴胺和溶菌酶的修飾而降低，這可能是由于涂覆接枝增加了復(fù)合球的尺寸和質(zhì)量，表明聚多巴胺涂層和溶菌酶的修飾是成功的。3條S形磁滯回線(xiàn)均表現(xiàn)出零剩磁和矯頑力，表明復(fù)合材料繼承了γ-Fe2O3超順磁特性，Yinfeng等[23]在研究中通過(guò)使用外部磁鐵實(shí)現(xiàn)了磁球在幾秒鐘內(nèi)快速分離和收集，分離過(guò)程表明了其在食品或水處理領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景，可避免二次污染，且常溫下可儲(chǔ)存，這有利于纖維素磁球在食品工業(yè)中的回收再利用。

圖6 RC（a）、LC-1（b）、LC-3（c）的磁滯回線(xiàn)和飽和磁化強(qiáng)度值比較(d)Fig.6 Comparison of saturation magnetization values (d) and hysteresis loops of RC (a), LC-1 (b), and LC-3 (c)

2.1.6 元素及鍵能分析

各組樣品的XPS分析如圖7所示。在圖7a中，RC僅顯示出C、O兩個(gè)峰，而在圖7b和圖7c中，LCs均顯示出額外的N峰，證明聚多巴胺和溶菌酶成功修飾在纖維素磁球上，此結(jié)果與圖8中EDS譜圖結(jié)果一致。

圖7 RC（a）、LC-1（b）和LC-3（c）的XPS全譜圖，LC-3的C1s（d）、O1s（e）、N1s（f）譜圖Fig.7 XPS spectrum for the RC (a), LC-1 (b), LC-3 (c), the corresponding spectra of LC-3 for C1s (d), O1s (e) and N1s (f)

圖8 RC（g）、LC-1（h）、LC-3（i）的EDS譜圖Fig.8 EDS spectrum for the RC (g), LC-1 (h) and LC-3 (i)

在C1s（d）譜圖中可以看到284.8、286.3、288 eV處產(chǎn)生了三個(gè)峰，分別對(duì)應(yīng)于-CH[27]、C-N/C-OH[28]和C=O鍵。O1s（e）區(qū)域光譜在531.7和532.4 eV處有兩個(gè)峰，歸因于C=O[29]和-OH鍵。532.4 eV的結(jié)合能來(lái)源于聚多巴胺中兒茶酚和多巴胺奎寧形式的氧自由基，Xi等[18]也有相同的結(jié)果。Fazli等[30]發(fā)現(xiàn)單一的聚多巴胺僅在399.8 eV處顯示出N-R（N-C或N-H）峰，本研究與其結(jié)果一致。而在LC-3（f）中，401.2和399.0 eV處出現(xiàn)新的譜帶，其分別代表著苯環(huán)與溶菌酶間的R-N-R連接鍵和酰胺鍵，這些結(jié)果表明溶菌酶的氨基和聚多巴胺的苯基之間通過(guò)邁克爾加成反應(yīng)和席夫堿反應(yīng)結(jié)合在一起，Lee等[31]和Zhang等[32]此前均有類(lèi)似的報(bào)道。在XPS譜圖和EDS譜圖中，F(xiàn)e元素含量極少，這可能是由于纖維素將絕大多數(shù)γ-Fe2O3包裹在球內(nèi)，表面Fe元素含量低，后經(jīng)涂覆接枝改性，復(fù)合球表面Fe元素含量進(jìn)一步降低。

2.1.7 晶形結(jié)構(gòu)分析

圖9為純纖維素（PC）、再生纖維素球（CB）、γ-Fe2O3和LCs的XRD譜圖。在PC譜圖中2θ=15.0 °、16.5 °、22.8 °和34.5 °為其衍射峰，對(duì)應(yīng)于纖維素I處（-110）、（110）、（200）和（004）的晶面，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Xu等[33]一致。CB譜圖中，在2θ=12.2 °、20.1 °和21.9 °處觀(guān)察到纖維素II晶體的特征峰，對(duì)應(yīng)于（-110）、（110）和（020）的晶面[34]，這表明纖維素在溶解和再生后晶形結(jié)構(gòu)由I型轉(zhuǎn)變?yōu)镮I型，此結(jié)果與Cai等[35]一致。LCs纖維素II型晶體的特征峰強(qiáng)度較CB明顯降低，這是由于纖維素球中添加了磁性納米粒子，且纖維素I型晶體時(shí)表觀(guān)特征為棉短絨纖維，而II型晶體時(shí)對(duì)應(yīng)纖維素磁球，干燥后機(jī)械性能明顯提升。由右圖可知，聚多巴胺涂覆時(shí)間的增強(qiáng)對(duì)纖維素晶形結(jié)構(gòu)無(wú)明顯影響。同時(shí)，在2θ=30.3 °、33.1 °、35.7 °、43.3 °、49.5 °、53.7 °、57.2 °和62.9 °處LCs均表現(xiàn)出相同的γ-Fe2O3的特征衍射峰，分別對(duì)應(yīng)于（220）、（310）、（311）、（400）、（421）、（422）、（511）和（440）晶面，Cai等[35]也有相同的結(jié)論，表明聚多巴胺和溶菌酶修飾沒(méi)有明顯影響磁性納米粒子的晶體結(jié)構(gòu)。

圖9 PC、CB、γ-Fe2O3和LCs的XRD譜圖Fig.9 XRD spectra of PC, CB, γ-Fe2O3 and LCs

2.2 LCs在抗菌領(lǐng)域的應(yīng)用

2.2.1 溶菌酶抗菌活性分析

溶菌酶的抗菌活性如圖10所示。50 mL純凈培養(yǎng)基為空白組（BlACK），對(duì)照組為加入了50 mg RC的菌懸液，通過(guò)之前的預(yù)實(shí)驗(yàn)確定了RC對(duì)A.acidoterrestris的生長(zhǎng)無(wú)影響。將分別含有0.75、1.25、2.5、5、10、20 mg/mL溶菌酶的菌懸液設(shè)為實(shí)驗(yàn)組，測(cè)試溶菌酶在該實(shí)驗(yàn)條件下的最小抑菌濃度。當(dāng)溶菌酶濃度達(dá)到0.75 mg/mL及以上時(shí)對(duì)脂環(huán)酸芽孢桿菌有很好的抑制性，這是由于脂環(huán)酸芽孢桿菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，溶菌酶通過(guò)對(duì)脂環(huán)酸芽孢桿菌的細(xì)胞壁靶向水解從而達(dá)到抗菌作用[11]。由于在該實(shí)驗(yàn)條件下實(shí)測(cè)溶菌酶最小抑菌濃度較低，故合理推測(cè)纖維素磁球上溶菌酶的接枝量可以對(duì)A.acidoterrestris產(chǎn)生抑制，因而繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)負(fù)載溶菌酶的實(shí)驗(yàn)。

圖10 不同濃度溶菌酶對(duì)脂環(huán)酸芽孢桿菌的抗菌活性Fig.10 Antibacterial activities of different concentrations of lysozyme against A.acidoterrestris

2.2.2 復(fù)合球抗菌活性分析

復(fù)合球的抗菌活性如圖11所示。對(duì)照組RC的OD600值在2h后開(kāi)始明顯上升，表明菌體開(kāi)始快速繁殖。所有經(jīng)過(guò)涂覆接枝的纖維素磁球均對(duì)脂環(huán)酸芽孢桿菌顯示出優(yōu)異的抗菌活性，菌的生長(zhǎng)幾乎被完全抑制，LC-3的抑制效果最強(qiáng)，這是由于經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間聚多巴胺涂覆的纖維素磁球溶菌酶接枝量更大，抗菌效果更好。雖然溶菌酶在食品加工中具有明確的優(yōu)勢(shì)，但在液態(tài)食品中必須達(dá)到一定濃度才能抑制微生物的生長(zhǎng)，故需要消耗大量溶菌酶才能抑制少量的A.acidoterrestris。因此，在果汁中添加溶菌酶是一種低效且昂貴的果汁殺菌方式，將其制備成抗菌材料可節(jié)省果汁工業(yè)的生產(chǎn)成本和造成的資源浪費(fèi)。

圖11 復(fù)合球?qū)χh(huán)酸芽孢桿菌的抗菌活性Fig.11 Antibacterial activities of RC and LCs against Alicyclobacillus

2.3 LCs的安全性評(píng)價(jià)

本研究制備的抗菌材料由以下幾部分組成：纖維素、溶菌酶、γ-Fe2O3納米粒子、聚多巴胺。纖維素及纖維素基抗菌材料具有安全無(wú)毒等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于食品包裝、藥物輸送、污水處理等領(lǐng)域[36]；溶菌酶已被國(guó)際食品法典委員會(huì)和我國(guó)衛(wèi)生部門(mén)允許應(yīng)用于食品加工領(lǐng)域[12]；γ-Fe2O3納米粒子由于其優(yōu)異的生物相容性、表面可修飾性、熱化學(xué)穩(wěn)定性和超順磁性，近年來(lái)已在食品抗菌材料、生物醫(yī)學(xué)、水處理等領(lǐng)域得到應(yīng)用[23]；在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域，聚多巴胺因其豐富的官能團(tuán)和吸附位點(diǎn)，近年來(lái)作為功能化復(fù)合材料已在食品樣品的多種痕量有機(jī)污染物的檢測(cè)中發(fā)揮應(yīng)用，推動(dòng)了食品樣品前處理技術(shù)向著綠色化方向前進(jìn)[37]。綜上可知，本研究制備的抗菌復(fù)合球可安全應(yīng)用于食品加工等領(lǐng)域。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)溶膠-凝膠轉(zhuǎn)化法構(gòu)建磁性纖維素球，聚多巴胺由多巴胺鹽酸鹽在堿性條件下形成并包覆在纖維素磁球表層，再通過(guò)席夫堿反應(yīng)與邁克爾加成反應(yīng)將溶菌酶與聚多巴胺共價(jià)結(jié)合形成交聯(lián)聚合物，生成由溶菌酶錨定的纖維素磁球，該復(fù)合球具有磁響應(yīng)性靈敏，熱穩(wěn)定性好的特點(diǎn)?？咕囼?yàn)表明纖維素磁球能有效抑制脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長(zhǎng)。本研究制備的復(fù)合球?yàn)榻档凸I(lǐng)域中脂環(huán)酸芽孢桿菌的危害提出了理論構(gòu)想，將在后續(xù)研究中進(jìn)一步以多種果汁為模型進(jìn)行實(shí)際抗菌應(yīng)用實(shí)驗(yàn)。此外，該復(fù)合球具有成本低、效率高、便于回收、可生物降解等優(yōu)點(diǎn)，在食品工業(yè)和其他領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。